荒漠植物珍珠豬毛菜根際土壤細(xì)菌多樣性與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

魏艷晨， 陳吉祥*， 王永剛， 孟彤彤， 韓亞龍， 李美

（1.蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，蘭州 730050；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730050；3.蘭州理工大學(xué)能源與動(dòng)力工程學(xué)院，蘭州 730050）

西北荒漠區(qū)作為我國(guó)典型的中-重型生態(tài)脆弱區(qū)，是氣候變化響應(yīng)的敏感帶，也是西北生態(tài)安全的重要屏障。景泰位于甘肅中部，河西走廊東端，地處甘肅、內(nèi)蒙、寧夏交界處，屬于黃土高原與騰格里沙漠過渡地帶。氣溫多變、干旱多風(fēng)少雨、沙化嚴(yán)重，是典型的干旱生態(tài)脆弱區(qū)［1］。珍珠豬毛菜（Salsola passerina）屬藜科半灌木，廣泛分布于景泰縣干旱荒漠區(qū)礫石質(zhì)、沙礫質(zhì)戈壁和鹽堿湖盆地，具有抗風(fēng)沙、耐旱和耐寒的特性，是維護(hù)區(qū)域生態(tài)平衡的重要植物。研究荒漠區(qū)土壤細(xì)菌多樣性對(duì)荒漠植物生態(tài)適應(yīng)及生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)有重要意義。不同荒漠區(qū)優(yōu)勢(shì)植物類群根際土壤的微生物類群及豐度有明顯差異?？祵毺斓龋?］研究祁連山高寒草甸和荒漠草原土壤細(xì)菌群落組成發(fā)現(xiàn)，不同草地土壤的細(xì)菌群落存在顯著差異，放線菌門和綠彎菌門在高寒草甸土壤中的相對(duì)豐度顯著低于荒漠草原，而變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和Rokubacteria則相反。黃耀龍［3］研究發(fā)現(xiàn)，荒漠植物梭梭（Haloxylon ammodendron）與白刺（Nitraria tangutorum）根際土壤的細(xì)菌多樣性差異顯著。單立山等［4］和李善家等［5］對(duì)聯(lián)生珍珠豬毛菜和聯(lián)生紅砂、單生珍珠豬毛菜和單生紅砂的比根長(zhǎng)、比表面積、根系生物量的垂直分布特征及葉片功能性狀進(jìn)行比較，驗(yàn)證了紅砂-珍珠豬毛菜聯(lián)生群落適應(yīng)干旱脅迫環(huán)境。然而，在荒漠環(huán)境脅迫下，單生珍珠豬毛菜根際土壤和荒漠土壤的細(xì)菌在數(shù)量和多樣性均可能具有差異，且二者土壤理化性狀也可能存在差異。為此，本研究選取珍珠豬毛菜根際土壤和荒漠土壤（周邊非根際土壤）為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序?qū)φ渲樨i毛菜根際和周邊非根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究；通過對(duì)比根際和非根際土壤的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量、細(xì)菌總數(shù)、理化性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)的變化和區(qū)別，分析土壤細(xì)菌群落組成和土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，為珍珠豬毛菜生態(tài)適應(yīng)及荒漠草原生態(tài)修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及樣品采集

研究區(qū)地處甘肅省景泰縣境內(nèi)荒漠草原區(qū)（E 103°55′，N 36°55′），屬溫帶大陸性干旱氣候，海拔1 276～3 321 m，年均氣溫8.2℃，年均降水量185 mm，年蒸發(fā)量達(dá)3 038.5 mm，無霜期191 d。該區(qū)主要地貌為風(fēng)沙地貌，土壤以荒漠土和灰鈣土為主。植被結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且稀疏，主要有珍珠豬毛菜、紅砂，其中珍珠豬毛菜分布較為廣泛。

在研究區(qū)內(nèi)取珍珠豬毛菜根際土壤（rizosphere soil，GJ）和非根際土壤（non-rizosphere soil，NG）。其中，GJ：選取長(zhǎng)勢(shì)一致的珍珠豬毛菜3株做重復(fù)，隨機(jī)選取離植株莖稈2～5 cm處的3個(gè)采樣點(diǎn)，用土鉆法取樣，垂直深度0—60 cm，將所取土樣混勻后裝入無菌保鮮袋于低溫保存待測(cè)；NG：自同一采樣點(diǎn)周邊區(qū)域，去除地表0—5 cm處土壤，收集5—60 cm土壤裝于無菌保鮮袋，于冷藏條件帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。

1.2 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤pH采用pH計(jì)測(cè)定；土壤含水率（water content，WC）用烘干法測(cè)定；土壤全氮（total nitrogen，TN）用凱氏定氮法測(cè)定；土壤速效氮（available nitrogen，AN）采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定；土壤全磷（total phosphorus，TP）采用堿熔融-鉬銻抗比色法測(cè)定；土壤速效磷（available phosphorus，AP）采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定；土壤全鉀（total potassium，TK）采用氫氟酸消解-原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定；土壤速效鉀（available potassium，AK）采用NH4Ac浸提-火焰光度計(jì)法測(cè)定［6］。

1.3 土壤細(xì)菌總數(shù)和可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)的測(cè)定

土壤細(xì)菌總數(shù)測(cè)定采用“LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit”試劑盒，根據(jù)說明書進(jìn)行。稱取10 g土樣于90 mL滅菌生理鹽水30℃振蕩30 min，使土壤中細(xì)菌均勻分散，制成10倍稀釋度的土壤懸液，離心收集菌體，用生理鹽水重懸。SYTO9和碘化丙啶核酸染色劑染色后，用激光共聚焦顯微鏡觀察［7］。可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)采用稀釋涂布平板法［8］測(cè)定。土壤懸液依次進(jìn)行 10-1、10-2、10-3、10-4稀釋。取不同稀釋度土壤懸液100 μL，涂布LB平板，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)平行。

1.4 土壤細(xì)菌多樣性分析

采用HiPure Soil DNA Kits試劑盒（D3142，廣州美基生物科技有限公司）提取土壤樣本的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)榧?xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)，引物為341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′）。使用AMPure XP Beads對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，用ABI StepOnePlus Real Time PCR System（Life Technologies，產(chǎn)地美國(guó)）進(jìn)行定量，最后根據(jù)Novaseq 6000的PE250模式pooling上機(jī)測(cè)序［9］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Uparse軟件對(duì)所有樣品的全部有效Tags序列聚類，以97%相似水平的OTUs序列進(jìn)行分類分析。利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Image J軟件完成CLSM數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

珍珠豬毛菜根際土壤和非根際土壤的理化性狀存在顯著差異（表1）。其中，珍珠豬毛菜根際土壤的全氮、全鉀、速效氮、速效磷和速效鉀均顯著高于非根際土壤；土壤含水量和pH顯著低于非根際土壤；土壤全磷含量在根際土壤和非根際土壤間差異不顯著。

表1 珍珠豬毛菜根際和非根際土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of GJ and NG

2.2 土壤細(xì)菌總數(shù)和可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)

對(duì)不同土壤的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)、活細(xì)菌數(shù)和細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定結(jié)果（圖1）表明，根際和非根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)分別為1.62×106CFU·g-1和5.40×105CFU·g-1；活細(xì)胞數(shù)分別為 2.52×106個(gè)·g-1和2.26×106個(gè)·g-1；細(xì)菌總數(shù)分別為1.33×107個(gè)·g-1和1.12×107個(gè)·g-1。由此表明，珍珠豬毛菜根際土壤的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)、活細(xì)菌數(shù)和總細(xì)菌數(shù)均高于周邊非根際土壤；且兩種土壤樣品的細(xì)菌總數(shù)和活細(xì)菌數(shù)均高于可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)。

圖1 激光共聚焦顯微鏡下染色細(xì)胞圖Fig.1 Image of the stained cells with fluorescent dye under confocal laser microscope

2.3 土壤細(xì)菌群落多樣性分析

通過測(cè)序，珍珠豬毛菜根際和非根際土壤中OUT數(shù)分別為5 655和4 665個(gè)。其中，根際和非根際土壤特有的OUT數(shù)分別為2 580和1 590個(gè)，共同的為3 075個(gè)。多樣性分析結(jié)果（表2）表明，兩種土壤中細(xì)菌的Chao1指數(shù)無顯著差異；而珍珠豬毛菜根際土壤的Shannon指數(shù)顯著高于非根際土壤。非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析（圖2）表明，根際和非根際土壤樣本被分離，表明兩種土壤的細(xì)菌群落組成具有明顯差異。

圖2 基于Weighted UniFrace NMDS分析的樣本二維排序圖Fig.2 NMDS plot based on weighted UniFrac distances

表2 土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices of soil bacteria

2.4 不同土壤中細(xì)菌門組成

珍珠豬毛菜根際土壤和非根際土壤樣品中共檢測(cè)出33門細(xì)菌（圖3）。其中，放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes）等在2種土壤樣本中均有分布。放線菌門相對(duì)豐度最大，成為最優(yōu)勢(shì)菌門，在根際土壤中約占40.6%～43.3%，在非根際土壤中約占46.5%～52.0%。變形菌門、浮霉菌門和芽單胞菌門的相對(duì)豐度也較高。其中，浮霉菌門在根際土壤中的相對(duì)豐度（15.3%）顯著高于非根際土壤（9.1%）。而WPS-2和Latescibacteria為珍珠豬毛菜根際土壤特有的2個(gè)菌門；軟壁菌門（Tenericutes）和Halanaerobiaeota為非根際土壤特有的菌門。

圖3 珍珠豬毛菜根際和非根際土壤細(xì)菌門水平的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial communities at the phylum level in different soils of Salsola passerine

2.5 不同土壤中細(xì)菌屬組成

珍珠豬毛菜根際土壤和非根際土壤分別包含367和398個(gè)細(xì)菌屬。其中，紅色桿菌屬（Rubrobacter） 、RB41、類 諾 卡 氏 菌 屬（Nocardioides）、鏈霉 菌 屬（Streptomyces）、Pir4_lineage、芽 孢 桿 菌 屬（Bacillus）、紅 桿 菌 屬（Solirubrobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、小梨形菌屬（Pirellula）假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、Subgroup_10、分 支 桿 菌 屬（Mycobacterium）、半角藻屬（Haliangium）、MND1、Gaiella和Pelagibius在2種土壤中的相對(duì)豐度均較高（圖4）。其中，根際土壤相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬為紅色桿菌屬，占3.8%；而非根際土壤的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為類諾卡氏菌屬（Nocardioides），占2.9%。芽球菌屬（Blastococcus）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）在根際土壤中的相對(duì)豐度也較高（＞1%）；而擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）和糖霉菌屬（Glycomyces）在非根際土壤中的相對(duì)豐度較高（＞1%）。

圖4 珍珠豬毛菜根際和非根際土壤細(xì)菌屬水平的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial communities at the genus level in different soils of Salsola passerine

2.6 土壤細(xì)菌與土壤理化性狀間的關(guān)系

2.6.1 土壤細(xì)菌數(shù)量與理化因子相關(guān)性分析對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量與土壤理化性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表3）表明，可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量與土壤pH呈極顯著負(fù)相關(guān)，與其他理化性狀相關(guān)不顯著；而細(xì)菌總數(shù)與土壤養(yǎng)分含量、pH和土壤含水率相關(guān)均不顯著。

表3 土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和細(xì)菌總數(shù)與理化因子之間的相關(guān)性Table 3 Correlation between the number of bacteria and soil physical and chemical properties

2.6.2 細(xì)菌多樣性指數(shù)與土壤理化因子相關(guān)性分析 對(duì)細(xì)菌多樣性與土壤理化性狀進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果（表4）表明，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)與土壤速效氮、速效磷和速效鉀含量均達(dá)到極顯著正相關(guān)；Simpson指數(shù)與土壤全氮含量呈顯著正相關(guān)；ACE指數(shù)和Chao l指數(shù)均與土壤速效鉀含量呈顯著正相關(guān)。

表4 細(xì)菌多樣性與土壤理化因子之間的相關(guān)性Table 4 Correlation between physical and chemical properties and diversity index of bacteria

2.6.3 細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門與土壤理化因子相關(guān)性分析 對(duì)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門與土壤理化性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表5）表明，放線菌門的相對(duì)豐度與土壤全磷、速效氮、速效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與土壤pH呈極顯著正相關(guān)；酸桿菌門與土壤全氮、速效氮、速效鉀含量呈顯著正相關(guān)，與土壤pH和含水率呈顯著負(fù)相關(guān)；綠彎菌門與土壤全氮和全磷含量呈顯著正相關(guān)，與土壤含水率呈顯著負(fù)相關(guān)，與速效氮和速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)，與pH呈極顯著負(fù)相關(guān)。

表5 不同土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門與土壤理化因子的相關(guān)性Table 5 Correlation of dominant communities of bacteria at the phylum level with soil physical and chemical factors

2.6.4 細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬與土壤理化因子相關(guān)性分析 對(duì)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬與土壤理化性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表6）表明，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬與不同土壤理化性狀具有一定的相關(guān)性。鏈霉菌屬與土壤pH呈顯著正相關(guān)。紅色桿菌屬與土壤全氮含量呈顯著正相關(guān)，與速效氮和速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)，與土壤pH和含水率呈極顯著負(fù)相關(guān)。RB41與土壤速效氮和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)，與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)。類諾卡氏菌屬和Pelagibius與土壤全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與土壤含水率呈顯著正相關(guān)，與速效氮和速效鉀含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與土壤pH呈極顯著正相關(guān)。Pelagibius與土壤全磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)。由此表明，土壤養(yǎng)分含量、pH和含水量是影響土壤細(xì)菌群落組成的重要因子。

表6 不同土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬與土壤理化因子的相關(guān)性Table 6 Correlation of dominant communities of bacteria at the genus level with soil physical and chemical factors

3 討論

景泰位于黃土高原與騰格里沙漠過渡地帶，為典型荒漠草原，土壤pH 8.23～8.93。研究表明，荒漠土壤pH顯著高于珍珠豬毛菜根際土壤，與楊陽等［10］研究結(jié)果相一致，可能是由于植物呼吸作用產(chǎn)生CO2及代謝作用產(chǎn)生的有機(jī)酸降低了土壤pH［11］；而根際土壤含水率低于非根際土壤，可能與植物吸收水分有關(guān)。除全磷含量外，珍珠豬毛菜根際土壤養(yǎng)分含量均顯著高于非根際土壤，說明植物根系從環(huán)境攝取養(yǎng)分并促進(jìn)了根際養(yǎng)分的積累，體現(xiàn)了“根際效應(yīng)”有利于增加土壤養(yǎng)分［12］。根際微生物為植物提供養(yǎng)料和水分，增強(qiáng)植物對(duì)氮素?cái)z入，促進(jìn)土壤磷富集，有利于植物生長(zhǎng)［13-14］。

珍珠豬毛菜根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)為1.62×106CFU·g-1，活細(xì)胞數(shù)為 2.52×106個(gè)·g-1，細(xì)菌總數(shù)為1.33×107個(gè)·g-1；與非根際土壤相比，都有不同程度增加，表明根際土壤有利于微生物活動(dòng)。值得注意的是，不同土壤的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量比活細(xì)菌數(shù)和細(xì)菌總數(shù)低，可能是在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的環(huán)境中存在著較多難培養(yǎng)細(xì)菌或不可培養(yǎng)細(xì)菌（Viable but Non-Culturable）［15-16］，由此可見，純培養(yǎng)方法可能不能全面反映土壤微生物的類群和數(shù)量。

景泰荒漠草原土壤細(xì)菌具有豐富的多樣性，其中，荒漠土壤中細(xì)菌類群包含33門367屬，而珍珠豬毛菜根際土壤細(xì)菌類群涉及33門398屬。根際土壤和非根際土壤中OUT數(shù)、多樣性指數(shù)的顯著差異進(jìn)一步驗(yàn)證了兩種土壤中細(xì)菌在群落組成上存在差異。且根際土壤細(xì)菌的多樣性顯著高于非根際土壤，與前人研究結(jié)果相一致［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)放線菌門在兩種土壤中的豐度均最高，其中在非根際土壤中有更高的相對(duì)豐度（49.9%），可能是由于荒漠土壤為放線菌提供了木質(zhì)素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［2］。放線菌門的許多屬種具有耐旱、耐鹽堿等特性，是干旱、鹽堿等類型土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群［19-20］，本研究表明，放線菌門與土壤理化因子間無顯著相關(guān)性。根際土壤中浮霉菌門的豐度僅次于放線菌門，其相對(duì)豐度從非根際土壤的9.1%增加到15.3%。酸桿菌門在根際土壤中的相對(duì)豐度從非根際土壤的4.7%增至6.2%，且與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)，表明其更適應(yīng)于pH較低的土壤環(huán)境［2］。綠彎菌門和擬桿菌門在珍珠豬毛菜根際土壤中的相對(duì)豐度亦高于非根際土壤；且綠彎菌門與土壤全氮、全磷、速效氮和速效鉀呈顯著正相關(guān)，與楊秉珣等［21］對(duì)川西北沙化地區(qū)的研究結(jié)果一致。植物根際可改變土壤微環(huán)境，使得某些細(xì)菌類群的豐度或多樣性增加或減少，形成有益于植物自身的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)［22］，如西瓜根際土壤中的優(yōu)勢(shì)類群是厚壁菌門、變形菌門和放線菌門［23］；菊芋根際土壤中的優(yōu)勢(shì)類群是變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門［24］，而造成不同植物根際土壤中優(yōu)勢(shì)菌群差異的機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

在屬水平上，荒漠土壤主要優(yōu)勢(shì)菌屬為類諾卡氏菌屬，其次為紅色桿菌屬。紅色桿菌屬屬于放線菌門細(xì)菌，抗性較強(qiáng)，具有很好的固氮能力［25］，與土壤全氮、速效氮和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)，與土壤含水率和pH呈極顯著負(fù)相關(guān)。珍珠豬毛菜根際土壤的最優(yōu)勢(shì)菌為紅色桿菌屬，其次為RB41，芽單胞菌屬在根際土壤中相對(duì)豐度明顯增加，可能與多磷酸鹽積累有關(guān)［26］，與土壤理化因子無顯著關(guān)系。

珍珠豬毛菜根際和非根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，土壤pH和含水率及全氮、全磷、速效氮、速效鉀含量是影響土壤細(xì)菌群落組成的主要因子，但這些菌群對(duì)珍珠豬毛菜生長(zhǎng)的影響尚不清楚，故需進(jìn)一步研究菌群的生長(zhǎng)代謝，掌握細(xì)菌群-珍珠豬毛菜的協(xié)同規(guī)律和環(huán)境生存機(jī)制，為生態(tài)恢復(fù)提供理論依據(jù)。