不同沖泡溫度下滁菊茶湯HPLC指紋圖譜的研究

張俊巍 韓月婷 呂伯龍 王偉 張承 于士軍

摘 要：以滁菊為原料，分別在6種不同溫度下沖泡，建立滁菊茶湯的HPLC指紋圖譜，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行分析。結(jié)果表明，滁菊茶湯品質(zhì)與沖泡溫度有關(guān)，18個(gè)樣品有6個(gè)共有峰。主成分分析提取了兩大主成分，其累積貢獻(xiàn)率達(dá)到93.187%。聚類分析可將樣品分為3類，分別為50℃和60℃，70℃、80℃和90℃，100℃。隨著溫度升高，茶湯顏色越濃，活性物質(zhì)含量越高，茶湯品質(zhì)也越好。沖泡溫度為100℃時(shí)，茶湯品質(zhì)最佳。為合理沖泡和飲用滁菊茶提供參考和科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：滁菊;指紋圖譜;沖泡溫度;茶湯品質(zhì)

中圖分類號(hào) TS275 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2022）11-0125-05

Study on the HPLC Fingerprint of Chrysanthemum morifolium （Ramat） Tzvel. cv. Chuju Tea Soup Brewed at Different Temperatures

ZHANG Junwei1? ?HAN Yueting2? ?LV Bolong3? ?WANG Wei1? ?ZHANG Cheng1? ?YU Shijun2

（1Agricultural Products Quality and Safety Center，Xuancheng City，Xuancheng 24200， China 2Chuzhou Academy，Chuzhou City， Chuzhou 239500， China; 3Anhui Tuowei Testing Services Co.， Ltd.，Xuancheng City，Xuancheng 24200，China）

Abstract： The HPLC fingerprints and antioxidant activities of C. morifolium （Ramat） Tzvel. cv. Chuju tea soup were studied by brewing Chuju tea at 6 different temperatures. The fingerprints were analyzed by chemometrics . The results showed that the quality of Chuju tea soups had a good relationship with the brewing temperature significantly. There are 6 common peaks in the fingerprints of 18 samples .Cluster analysis can divide samples into three categories， namely 50℃ and 60℃， 70℃， 80℃ and 90℃， and 100℃. When the brewing temperature is 100℃， the quality of tea soup is the best. Provide reference and scientific basis for reasonable brewing and drinking of Chuju tea.

Key words： Chuju; Fingerprint; Brewing temperature; The quality of tea soup

菊花是一種常見的藥食兩用的花卉，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床和生活食品。滁菊（Chrysanthemum morifolium（Ramat）Tzvel. cv. Chuju）是多種菊花中效用最為優(yōu)質(zhì)的品種。滁菊的生產(chǎn)地區(qū)主要在滁州，擁有數(shù)百年的栽培歷史[1]。滁菊是當(dāng)?shù)靥厣参镔Y源，也是當(dāng)?shù)靥禺a(chǎn)，是國家的地理標(biāo)志性產(chǎn)品。滁菊又可以被叫為“白菊”、“甘菊”，位列中國“四大藥菊”之一[2]。經(jīng)我國的衛(wèi)生部批準(zhǔn)，滁菊是藥食兼優(yōu)植物，它有很高的藥用保健價(jià)值。滁菊在生活中主要為茶沖泡飲用，也可作為中藥材入藥，同時(shí)可以直接食用，是藥、茶、食三用的純天然綠色食品保健品[3]。大量的研究和中藥藥典表明，滁州的滁菊藥用價(jià)值很高，含有多酚類、黃酮類和萜類等活性物質(zhì)，并且含有多糖和微量元素，適量使用后，能夠起到抗氧化、抗腫瘤以及改善缺血心肌的血液供應(yīng)等作用[4]。

目前，在菊花的品種鑒別、質(zhì)量檢測控制上已經(jīng)引入了HPLC指紋圖譜技術(shù)。陳曉慶等對滁菊的HPLC特征指紋圖譜進(jìn)行研究，對10個(gè)不同批次的滁菊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，不同批次的菊花之間所含化學(xué)成分存在顯著差異，所以可見HPLC指紋圖譜能夠有效區(qū)分滁菊與其它菊花，且該方法快捷、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為滁菊藥材的鑒別及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)[5]。于士軍等對滁菊建立了HPLC指紋圖譜，對其化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行分析和研究，結(jié)果表明，在滁菊的產(chǎn)地選擇和質(zhì)量評價(jià)技術(shù)上，可以采用HPLC指紋圖技術(shù)[2]。本文主要對滁菊在不同沖泡溫度下滁菊茶湯的浸提液建立滁菊茶湯生物HPLC指紋圖譜，對不同沖泡溫度下的滁菊茶湯浸出物進(jìn)行主成分、聚類分析，旨在研究不同沖泡溫度下對滁菊茶湯品質(zhì)和浸出物的的影響，為合理沖泡和飲用滁菊茶提供參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 滁菊、甲醇（色譜純）、磷酸（分析純）、超純水、DPPH、無水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇溶液、過氧化氫溶液、磷酸鹽緩沖液、鐵氰化鉀溶液、三氯乙酸溶液，氯化鐵溶液。蘆?。兌?5.5%）購于中國藥品生物制品鑒定所。對照品木犀草苷（批號(hào)：MUST-15012204，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.77%），綠原酸（批號(hào)：MUST-15041814，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.39%）;槲皮素（CAS號(hào)：117-39-5，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.00%）;芹菜素（CAS號(hào)：520-36-5，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.00%）。

1.1.2 儀器與設(shè)備 Agilent1260II高效液相色譜儀、SpectraMaxPlus384全波長酶標(biāo)儀、BPG-9070A鼓風(fēng)干燥箱、KQ3200DA數(shù)控超聲波清洗器、MINI-10K+微型離心機(jī)、HX-01N真空泵、FA2204B分析天平、此外還使用到一次性注射器、0.22μm濾膜、封口膜等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 取4g的滁菊干茶分別放入18個(gè)錐形瓶中，依次加入溫度為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，pH為6.0的蒸餾水200mL。搖勻，用保鮮膜對其進(jìn)行封口，再分別放入相應(yīng)溫度的水浴槽中保溫，浸提10min。最后用濾網(wǎng)將滁菊過濾，將過濾后的茶湯置于干凈的燒杯中，待用。對滁菊溶出物HPLC指紋圖譜的測定還需取上述各樣液1mL，對樣液離心沉淀雜質(zhì)，再經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，收集濾液于液相樣品瓶中待測。

1.2.2 滁菊溶出物HPLC指紋圖譜的測定 （1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制。分別稱取干燥至恒重的對照品綠原酸2.4mg、木犀草苷0.8mg、槲皮素0.4mg、蘆丁0.5mg、芹菜素0.5mg，置5mL棕色容量瓶中，加入75%甲醇溶解定容，配制成綠原酸濃度為480μg/mL、木犀草苷160μg/mL、槲皮素80μg/mL、蘆丁100μg/mL、芹菜素100μg/mL的對照品溶液，超聲30min，用0.45μm微孔濾膜將對照品溶液過濾，得待測溶液，備用。

（2）色譜條件。色譜柱：Eclipse Plus C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動(dòng)相：0.4%磷酸水溶液（A）-甲醇（C）;流速：1mL/min;柱溫：30oC;檢測波長：320nm;進(jìn)樣量：10μL;采用梯度洗脫：0～5min，70%A;11min，62%A;17min，62%A;20min，58%A;22min，50%A;25min，40%A;30min，40%A;35min，70%A;37min，70%A。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC指紋譜圖的建立 采用6種溫度按照“1.2.1”項(xiàng)的方法處理滁菊制備樣品提取液，使用“1.2.2”中的色譜條件，對滁菊茶湯樣品提取液進(jìn)行測定。將指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012A版）》進(jìn)行分析，選擇樣品S2的指紋圖譜為參照圖譜，采用多樣本平均數(shù)矢量綜合作為共有模式矢量，時(shí)間寬度設(shè)定為0.50，對色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正和全峰匹配，得到指紋圖譜，如圖1。每種沖泡溫度的滁菊茶湯平行實(shí)驗(yàn)3次，一共18個(gè)指紋圖譜，共計(jì)20個(gè)色譜峰，其中有6個(gè)色譜峰是18個(gè)滁菊茶湯樣品提取液所共有的。計(jì)算了各色譜峰相對峰面積，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

從表1中的數(shù)據(jù)可以看到，100℃時(shí)20個(gè)出峰時(shí)間均出峰，而50℃時(shí)，出峰個(gè)數(shù)較少，隨著沖泡溫度升高，茶湯出峰的個(gè)數(shù)也隨之增加。所以不同的沖泡溫度對滁菊活性成分浸出量有影響。將表1中的色譜峰的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰出峰時(shí)間對比之后，確定了樣品中20個(gè)色譜峰中的5個(gè)色譜峰，其中峰號(hào)P4為綠原酸、峰號(hào)P10為木犀草甘、峰號(hào)P13為蘆丁、峰號(hào)P14為芹菜素、峰號(hào)P18為槲皮素。

2.2 幾種成分含量測定 由表2可知不同溫度下，滁菊茶湯中的活性物質(zhì)槲皮素、綠原酸、木犀草甘、蘆丁和芹菜素含量存在顯著性差異（p<0.05）。90℃時(shí)槲皮素的含量達(dá)到最大值為0.29mg/g，100oC時(shí)綠原酸、木犀草甘、蘆丁、芹菜素的含量均達(dá)到最大值分別為7.58、1.03、0.55、1.85mg/g。從表2可看出，黃酮類活性物質(zhì)槲皮素、木犀草甘、蘆丁、芹菜素的含量和多酚類物質(zhì)綠原酸的含量均隨著溫度的升高而增加，50℃和60℃時(shí)，5種活性物質(zhì)的含量均不存在顯著性差異（p<0.05），隨著溫度的升高，70℃時(shí)與50℃和60℃存在顯著性差異（p<0.05），80℃、90℃和100℃時(shí)，槲皮素和綠原酸不存在顯著性差異（p<0.05）;木犀草甘、蘆丁和芹菜素在90℃和100℃時(shí)不存在顯著性差異，但3種黃酮類物質(zhì)的含量在沖泡溫度為100℃和80℃時(shí)存在顯著性差異。綜上所述，不同的沖泡溫度對滁菊茶湯中的活性物質(zhì)的溶出量有影響，隨著溫度的升高而增加，槲皮素在90℃時(shí)達(dá)到最大值，100℃時(shí)保持不變，綠原酸、木犀草甘、蘆丁和芹菜素4種活性物質(zhì)均在100℃達(dá)到最大值。

2.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.3.1主成分分析 將HPLC-DAD指紋圖譜20個(gè)峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 23.0軟件，并對導(dǎo)入的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。因第三主成分的特征值只有0.584，沒有超過1，所攜帶的信息量不到原來的1個(gè)變量，所以本研究提取表3中第一和第二兩個(gè)主成分進(jìn)行分析。

將HPLC-DAD指紋圖譜20個(gè)峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行PCA分析，得到PCA主成分載荷圖（a）、（b）2個(gè)分圖（圖2），得分圖（a）、（b）2個(gè)分圖（圖3）。

圖2的載荷圖能比較明顯的看出區(qū)分這些樣品的關(guān)鍵變量點(diǎn)，與原點(diǎn)之間的距離越遠(yuǎn)，表示其與主成分之間的相關(guān)性越高，正方向表示正相關(guān)，負(fù)方向表示負(fù)相關(guān)。其中圖（a）表示第一主成分和第二主成分的載荷圖，圖中可以看到色譜峰P1～P20與第一主成分都成正相關(guān)，其中與第一主成分相關(guān)性較高的有P1、P2、P3、P4、P5、P8、P10、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19。與第二主成分成正相關(guān)的有P6、P7、P9、P11、P17、P20，其中相關(guān)性較高的有P6、P7、P17。圖（b）表示第一主成分和第三主成分的載荷圖，可以看到，與第三主成分相關(guān)性較高的是P11、P20。

根據(jù)圖3（a）、（b）的2個(gè)主成分得分圖可以看出，6種溫度沖泡滁菊樣品（每種沖泡溫度有3個(gè)平行）大致集中在4個(gè)區(qū)域，每種沖泡溫度均能夠較好的聚在一起。從（a）圖中可以看到?jīng)_泡溫度為50℃和60℃的2組非常接近，且2種沖泡溫度幾乎重疊在一起;70℃、80℃和90℃較為接近，這3種沖泡溫度有的重疊在一起;80℃和90℃分布在1個(gè)區(qū)域，而100℃獨(dú)自分布在1個(gè)區(qū)域。圖（b）中：50℃、60℃和70℃各自能很好的聚為一體，和圖（a）一樣50℃和60℃非常接近幾乎重合;70℃和80℃比較接近;與圖（a）不同的是圖（b）中的90℃獨(dú)自在1個(gè)得分區(qū)域，100℃和80℃在1個(gè)區(qū)域。綜合分析可以得出，6種不同的沖泡溫度對茶湯中的活性成分浸出量有著不同的影響，低溫的沖泡溫度為50℃、60℃和高溫的沖泡溫度為90℃、100℃有著很明顯的區(qū)別，其中50℃、60℃較為接近，70℃和80℃也相對接近。

2.3.2 聚類分析 用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對18個(gè)樣品的20個(gè)峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，利用NCSS進(jìn)行聚類分析，采用瓦爾德聚類法，距離的計(jì)算方法為歐氏距離，二維聚類分析結(jié)果見圖4。

橫向聚類結(jié)果為樣品間的聚類分析，據(jù)圖可知，在第1次聚類時(shí)，18個(gè)樣品可聚為6類，即3個(gè)重復(fù)性試驗(yàn)可以很好的聚在一起。在距離為0～6.25之間，較低溫度的50℃和60℃聚在一起，偏高溫度的70℃和80℃聚在一起。當(dāng)距離為6.25時(shí)，可以看到18個(gè)樣品聚為3類，50℃和60℃聚為一類，70℃、80℃和90℃聚為一類，最高溫度100℃為一類。距離為12.5時(shí)，70℃、80℃、90℃和100℃才聚為一類，低溫與高溫沖泡滁菊得到的茶湯差異較大，由圖中可以看到距離達(dá)到25時(shí)，6種溫度才可聚在一起。說明不同沖泡溫度對滁菊茶湯中的活性成分溶出量有一定的影響，且高溫與低溫對滁菊茶湯的影響很明顯，其中50℃和60℃對茶湯的影響非常接近，70oC和80oC對茶湯的影響較接近，該聚類結(jié)果與主成分分析的得分圖結(jié)果基本一致。

縱向聚類結(jié)果為色譜峰聚類分析，據(jù)圖可知，50℃和60℃的色譜峰P1～P20的峰面積都比較小，由圖中的顏色梯度可以看到，相比高溫的顏色，50℃和60℃為負(fù)值說明50℃和60℃ 2個(gè)溫度的滁菊茶湯中的活性成分的溶出量較少。在70℃時(shí)，色譜峰中的P1、P2、P3、P5、P8、P9、P12、P15、P16、P19、綠原酸、槲皮素、芹菜素、木犀草甘、蘆丁的峰面積由顏色梯度可以看到開始變?yōu)檎?，說明峰面積增大，表示所代表的活性成分在茶湯中含量開始增大。隨著溫度增高，值為負(fù)值的峰面積也開始變?yōu)檎?，其他的峰面積也在增大。當(dāng)溫度達(dá)到100℃時(shí)，色譜峰P1～P20的峰面積基本上都是正值并達(dá)到最大值，即所代表的活性成分含量最大，這表明溫度越高活性成分的溶出量越大。綜上所述，高溫和低溫沖泡滁菊，其茶湯中活性成分差異較大，說明不同的沖泡溫度對滁菊茶湯中活性成分的溶出量有較大的影響。

3 結(jié)論

通過對不同沖泡溫度下滁菊茶湯的HPLC指紋圖譜的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，表明不同沖泡溫度下的滁菊茶湯品質(zhì)和HPLC指紋圖譜是存在顯著差異的，隨著沖泡溫度的升高，茶湯活性物質(zhì)含量越高，并在100℃時(shí)達(dá)到最大值，100℃時(shí)茶湯的各項(xiàng)指標(biāo)基本都顯示最好，所以本研究中100℃為滁菊茶湯的最優(yōu)沖泡溫度，可以得到較好品質(zhì)的滁菊茶湯。

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基金項(xiàng)目：安徽省長三角創(chuàng)新聯(lián)合公關(guān)專項(xiàng)（107085328028）、滁州市科技指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目（2021ZD024）。

作者簡介：張俊巍（1985—），男，安徽宣城人，農(nóng)藝師，從事農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全工作。

通訊作者：于士軍（1983—），男，安徽臨泉人，副教授，主要從事天然產(chǎn)物和食品質(zhì)量安全方面的研究和教學(xué)工作。? 收稿日期：2022-02-28