高脂飲食誘導(dǎo)沙鼠非酒精性脂肪肝性纖維化模型的建立

王妍璐，彭偉康，梁嘉樂，馬衛(wèi)列，丁 航，張志珍，陳曉佳*（廣東醫(yī)科大學(xué).第二臨床醫(yī)學(xué)院；.技術(shù)學(xué)院；.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 5808）

據(jù)估計，全球1/4 的人口患有非酒精性脂肪肝（NAFLD），預(yù)計未來10 年非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的發(fā)病率將增加56%，NASH 如不及時治療，可出現(xiàn)肝纖維化（HF），最終發(fā)展成肝細胞癌（HCC）[1-2]。由于肥胖率增加，HF 相關(guān)的HCC 發(fā)病率逐年上升[3]，亟需構(gòu)建一種與人類HF 發(fā)生和發(fā)展高度相似的動物模型進行HF 的預(yù)防和治療的研究。目前構(gòu)建HF 動物模型主要有基因工程鼠、肝毒性藥物誘導(dǎo)鼠和高脂飲食誘導(dǎo)鼠[4-5]，其中基因工程鼠成本高[6]；肝毒性藥物誘導(dǎo)雖然建模時間快但與人的HF 發(fā)生發(fā)展不符，且不穩(wěn)定[7]；高脂飲食誘導(dǎo)HF 模型與人的HF 發(fā)生、發(fā)展模式相近[8-9]。沙鼠血脂代謝與其他實驗動物存在很大差別，其血脂對高脂飼料反應(yīng)敏感，且其載脂蛋白變化與人類相似，被認為是高脂血癥良好的研究模型[10]。本課題組前期研究顯示，采用89%基礎(chǔ)飼料+1%膽固醇+l0%豬油配方的高脂飼料可構(gòu)建與人類高脂血癥一致的高血脂動物模型[11]，故本實驗在高脂血癥沙鼠模型的基礎(chǔ)上構(gòu)建NAFLD 模型，延長高脂喂養(yǎng)時間，模擬人類HF 由NAFLD 發(fā)展的過程，構(gòu)建穩(wěn)定的與人類HF 發(fā)生、發(fā)展高度一致的HF 沙鼠模型。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 5417R 高速臺式離心機（Eppendorf 公司）；7180 型全自動生化分析儀（HITACHI 公司）；SYNERGY H1 酶標儀（Biotek 公司）。

1.1.2 實驗動物與材料 30 只清潔級雄性沙鼠，體質(zhì)量為40～60 g，由遵義醫(yī)科大學(xué)提供。單籠飼養(yǎng)，室溫24～26℃，濕度50%，晝夜交替時長12 h，自由進食飲水。SPF 級普通維持飼料和定制高脂飼料（89%基礎(chǔ)飼料+1% 膽固醇+l0% 豬油配方）購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。戊巴比妥鈉購自Sigma 公司；蘇木素、尹紅購自索萊寶公司；多聚甲醛購自天津大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑為國產(chǎn)分析純。MASSON 染色試劑盒購自索萊寶公司；組織TG、TC 檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA 蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與造模 30 只體質(zhì)量40～60 g 雄性沙鼠，隨機分為正常對照組（NCG）和模型組（MG），每組15 只。正常對照組給予正常維持飼料喂養(yǎng)，模型組進行高脂飼料喂養(yǎng)，自由進食，單籠喂養(yǎng)，保持籠具清潔，分別喂養(yǎng)16 周。

1.2.2 沙鼠血脂和體質(zhì)量檢測 造模前兩組沙鼠禁食不禁水16 h 后，2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉，用毛細玻璃管眼眶靜脈叢取血，于1.5 mL 高壓滅菌的離心管中室溫靜置1 h，室溫4 500 r/min 離心10 min，分離血清，使用全自動生化分析儀通過質(zhì)控，按標準化值標定后測定血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）水平。同時測定兩組沙鼠造模前體質(zhì)量。造模16 周后，按照上述方法檢測血清TG、TC、LDL-c和HDL-c，同時檢測造模后的體質(zhì)量。

1.2.3 肝臟取材和肝體質(zhì)量指數(shù)計算 戊巴比妥鈉麻醉后，將沙鼠固定于小動物解剖臺上，用剪刀快速剪開腹腔及胸腔。在解剖顯微鏡下仔細分別將肝臟、胃和胃連接的筋膜分離，剪斷進出肝臟的動靜脈，將肝臟取下。預(yù)冷PBS 溶液清洗后，放置于帶有標尺的板上拍照并稱重，計算肝體質(zhì)量指數(shù)。肝體質(zhì)量指數(shù)為肝臟濕重與體質(zhì)量之比。之后將肝臟分成兩部分，一部分用4% 多聚甲醛溶液固定，用于HE 染色和MASSON染色；另一部分切成小塊，在液氮中速凍10 s，置-80℃?zhèn)溆茫糜跍y定肝臟TG 和TC 含量。

1.2.4 肝臟總TG、TC 含量測定 取-80℃凍存的部分肝臟，加入液氮研磨。按照1 mg 肝臟加入10 μL裂解液比例于冰上裂解10 min，2 000 r/min 離心5 min 后取適量上清，BCA 法測定蛋白含量。剩余上清 70 ℃加熱10 min，2 000 r/min 離心5 min，取上清測定TG 和TC 含量。按4∶1 比例配置工作液，取4 mL試劑R1 與1 mL 試劑R2 混合。在96 孔板上，每組樣品設(shè)3 個復(fù)孔，每孔加入190 μL 工作液和10 μL 樣品上清液，輕搖混勻，于室溫避光反應(yīng)20 min，在酶標儀上550 nm 波長下進行比色。分別繪制TG 和TC 的標準曲線，計算TG 和TC 濃度，以每毫克蛋白濃度校正TG 和TC 的含量。

1.2.5 肝臟石蠟切片HE 染色和MASSON 染色 切取部分肝臟，在4%多聚甲醛中固定24 h 以上，經(jīng)水洗、脫水、透明、恒溫浸蠟之后在包埋機上進行包埋，以厚度為4 μm 進行切片。切片經(jīng)脫蠟、脫二甲苯、水洗后參照染色試劑盒說明書進行HE 和MASSON 染色，最后封片。在顯微鏡下觀察、拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Grapad Prime 8.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模前后沙鼠血脂四項的改變

測定造模前兩組沙鼠的血清TG、TC、LDL-c 和HDL-C 水平，差異均無明顯變化（P＞0.05），結(jié)果見圖1A。高脂飼料喂養(yǎng)16 周后，MG 沙鼠血清中TC、TG、LDL-c 和HDL-c 含量均明顯高于NCG（P＜0.01 或0.05），見圖1B。結(jié)果提示高脂喂養(yǎng)16 周后可導(dǎo)致沙鼠出現(xiàn)高脂血癥。

圖1 造模前后沙鼠的血脂4 項水平

2.2 沙鼠體質(zhì)量與肝指數(shù)

高脂飼料喂養(yǎng)16 周后，MG 沙鼠體質(zhì)量平均增加（46.17±5.77）g，高于NCG 沙鼠體質(zhì)量的（20.80±3.70）g，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。解剖沙鼠亦可發(fā)現(xiàn)，MG 沙鼠腹腔脂肪量較NCG 沙鼠明顯增多。取完整肝臟，稱取肝臟濕重，計算肝指數(shù)。結(jié)果顯示，MG 沙鼠肝指數(shù)為0.074±0.003，明顯高于NCG 的0.033±0.002（P＜0.01）。該結(jié)果提示高脂飲食可導(dǎo)致沙鼠體質(zhì)量和肝臟重量增大。

2.3 沙鼠肝臟大體形態(tài)

造模16 周后取完整肝臟，可見MG 沙鼠肝臟外觀呈淺黃色，有油膩感，肝臟彌漫性腫大，肝包膜緊張，切開肝臟，切緣外翻，肝緣變頓，呈肝臟脂肪異常累積現(xiàn)象。NCG 肝臟大小適中，呈紅褐色，肝臟邊緣銳利，切面整齊，見圖2。結(jié)果說明，高脂飲食可導(dǎo)致沙鼠肝臟出現(xiàn)脂肪累積。

圖2 造模16 周后沙鼠肝臟形態(tài)觀察（cm）

2.4 肝臟總TG、TC 含量

肝臟充分研磨后，離心取上清測定肝臟總TG 和TC 含量。結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)16 周后，MG 組沙鼠肝臟中總TG 含量為(183.80 ± 5.69) μmol/g 蛋白，與正常對照組的(114.33 ±16.55) μmol/g 相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；總TC 含量為(506.49 ± 47.87) μmol/g，亦高于正常對照組的(61.67 ± 6.68) μmol/g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果提示，高脂飲食16 周后，沙鼠攝入的大部分脂肪和膽固醇累積在肝臟。

2.5 沙鼠肝臟石蠟切片HE 染色

對肝臟進行石蠟包埋，切片進行HE 染色，結(jié)果見圖3。HE 染色顯示，NCG 沙鼠肝細胞形態(tài)正常，肝索肝竇結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)均勻淡染，細胞核居中。而MG 沙鼠切面分布大小不等空泡，肝細胞變大，細胞核偏向一側(cè)，肝細胞擁擠，呈明顯肝細胞脂肪變性征象。

圖3 高脂喂養(yǎng)16 周后沙鼠肝臟HE 染色（200×）

2.6 沙鼠肝臟冰凍切片油紅O 染色

為驗證HE 切片空泡為異常累積的脂肪，取新鮮肝臟進行冰凍切片油紅O 染色。結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)16 周后MG 沙鼠肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量均質(zhì)紅染（圖4），與石蠟切片HE 染色空泡位置一致，提示肝臟細胞脂肪累積。

圖4 高脂喂養(yǎng)16 周后沙鼠肝臟油紅O 染色（200×）

2.7 沙鼠肝臟石蠟切片MASSON 染色

在高脂沙鼠模型基礎(chǔ)上，延長高脂喂養(yǎng)時間，對肝臟進行石蠟切片MASSON 染色。結(jié)果顯示，與NCG沙鼠相比，MG 沙鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，肝細胞有空泡、肝血竇周圍出現(xiàn)纖維化，膠原纖維大量增生并形成纖維間隔，可見匯管區(qū)纖維化，偶見假小葉形成（圖5）。

圖5 高脂喂養(yǎng)16 周后沙鼠肝臟MASSON 染色（200×）

3 討論

隨著生活水平的提高、飲食習(xí)慣的改變，NAFLD的發(fā)病率逐年上升，人類的HF 的自然發(fā)生發(fā)展過程為：NAFLD-NASH-HF，即出現(xiàn)高脂血脂后，肝臟之后累積，形成NAFLD，肝細胞由于脂毒性出現(xiàn)炎癥，導(dǎo)致NASH，炎癥因子激活肝星狀細胞，產(chǎn)生過量的細胞外基質(zhì)導(dǎo)致HF。NAFLD 是一種由多重因素導(dǎo)致的肝臟脂肪異常累積，早期表現(xiàn)為肝細胞單純性的脂肪累積，后期可發(fā)展為NASH、HF，肝臟纖維化可導(dǎo)致肝小葉形態(tài)紊亂，膽汁淤積，如不進行有效干預(yù)，最終可發(fā)展成肝硬化和肝細胞癌[12]。

外源性的脂類物質(zhì)，被轉(zhuǎn)運到肝臟，被肝細胞攝取進行代謝[13]，當機體需要脂類物質(zhì)時，肝細胞內(nèi)的脂類物質(zhì)可通過極低密度脂蛋白運輸?shù)酵庵?，保持肝細胞中的脂類物質(zhì)處于合理水平，當攝入過多的脂類物質(zhì)時，其累積在肝細胞中，出現(xiàn)肝細胞脂肪變[14-15]，實驗結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)16 周時，MG 組沙鼠血清中TC 含量、TG 及LDL-c 含量均高于NCG 組沙鼠水平（P＜0.01），提示MG 組沙鼠出現(xiàn)高脂血癥。血液中的TC、TG 被運輸?shù)礁渭毎写x，過多的TG、TC 被累積于肝細胞，導(dǎo)致肝臟腫大，16 周時取完整沙鼠肝臟，大體觀顯示肝臟體質(zhì)量增大，肝包膜緊張，稱取肝臟濕重和體質(zhì)量計算肝指數(shù)亦提示MG 組沙鼠肝指數(shù)高于NCG 組。為驗證是否增大的肝臟是因為TG、TC 累積所致，進一步去肝組織研磨，檢測肝組織中總TG 和TC含量，結(jié)果顯示MG 沙鼠肝臟TG 和TC 含量明顯高于NCG 沙鼠（P＜0.05 或0.01），提示高脂喂養(yǎng)可導(dǎo)致沙鼠肝臟TG 和TC 異常累積，符合NAFLD 發(fā)病機制。肝臟中過度累積的TG 在代謝過程中會產(chǎn)生有毒物質(zhì)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥介質(zhì)激活，這些因素共同引起肝細胞損傷出現(xiàn)NASH[16]。肝臟在持續(xù)炎癥介質(zhì)的刺激下，肝竇內(nèi)處于靜止狀態(tài)下的星狀細胞可被激活，轉(zhuǎn)分化為促瘢痕形成的肌成纖維細胞，分泌大量的細胞外基質(zhì)對肝損進行修復(fù)，但過量的細胞外基質(zhì)可導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)纖維化，破壞肝小葉的正常形態(tài)，導(dǎo)致肝硬化甚至肝細胞癌變[17]。肝臟組織病理檢查是診斷HF 的金標準，16 周時MG 沙鼠肝臟進行石蠟切片HE 和油紅O 染色，均表現(xiàn)出肝臟脂肪累積，符合NAFLD 的診斷標準，成功構(gòu)建單純高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 動物模型。在此基礎(chǔ)上進行MASSON 染色，結(jié)果顯示16周時MG 沙鼠肝臟出現(xiàn)纖維化，符合HF 診斷標準。

本實驗方法通過單純的高脂喂養(yǎng)，模擬人類因飲食習(xí)慣改變導(dǎo)致的高脂血癥，肝臟脂肪累積出現(xiàn)NAFLD，在沒有有效的干預(yù)措施前提下，繼續(xù)高脂飲食，導(dǎo)致NASH，炎癥介質(zhì)激活肝臟星狀細胞，分泌大量的細胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致HF 發(fā)生。該模型與人類HF 的發(fā)生發(fā)展模式相似，且造模方法簡單，且可在不同時間點取材觀察到HF 發(fā)生發(fā)展全過程，沙鼠體型居中，成年沙鼠100 g 左右，方便操作和多次取血，優(yōu)于大小鼠，有利于對HF 發(fā)病機制的研究。