芪地明目顆粒對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷的保護作用

趙越,周雷,余旭,吳豪,賁梅杰,黃莉吉,安曉飛,余江毅,周希喬

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210029)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的主要微血管并發(fā)癥之一,也是全球中老年人視力喪失的主要原因[1]。目前DR的發(fā)病機制仍未完全闡明,而以控制血糖、血壓等危險因素為主的治療手段對DR的干預效果有限,積極探索DR發(fā)病機制及針對性干預手段對DR防治有著非常重要的意義。

研究顯示,高糖誘導視網(wǎng)膜中轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)/微小核糖核酸-200b(micro-RNA-200b，miR-200b)/血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)信號通路激活,是導致血-視網(wǎng)膜屏障(Blood-retinal barrier,BRB)破壞及DR發(fā)生的重要機制[2-3]。而相關文獻提示,某些中藥可通過改善氧化應激和炎癥狀態(tài)發(fā)揮干預DR的作用[4],如黃芪、三七可通過抑制視網(wǎng)膜組織中TGF-β1、IL-1β、NF-κB等炎癥因子的過表達改善DR[5-6]。同時我們在前期研究中也發(fā)現(xiàn),六味地黃丸加銀杏葉片組合可明顯緩解DR的進展且降低患者血清羧甲基賴氨酸水平[7-8];黃蜀葵花可顯著改善非增殖期DR,減輕黃斑區(qū)水腫并降低VEGF水平[9]。在此基礎上,我們結(jié)合既往研究結(jié)果及文獻提示,擬定芪地明目顆粒來干預DR大鼠,評估其對DR大鼠視網(wǎng)膜損傷的保護作用;同時觀察芪地明目顆粒對DR大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β1/miR-200b/VEGF的影響,探索其干預DR的可能作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠,6周齡,體質(zhì)量180 g左右,購買于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場,生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2017-0011。本研究通過南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗動物研究倫理審查(批件號:2020DW-21-02)。

1.2 主要藥品與試劑

芪地明目顆粒:黃芪、生地黃、石斛、黃蜀葵花、丹皮、丹參、三七粉、密蒙花,按固定組成配制中藥配方顆粒,購自江陰天江藥業(yè)有限公司(批號:201210613);羥苯磺酸鈣(Calcium dobesilate,CD),購自江蘇萬高藥業(yè)股份有限公司;鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ),貨號：V900890，購自Sigma-Aldrich公司;羧甲基纖維素鈉，貨號：R008134,購自Rhawn公司。蘇木素-伊紅染色液、熒光定量PCR試劑盒(2×SYBR Green qPCR Mix),貨號：BL-700A/BL705A，購自Biosharp公司;胰蛋白酶消化液、高碘酸-雪夫(PAS)染色液,貨號：G5030/G1008，購自Servicebio公司;BCA蛋白定量試劑,貨號：ZJ101，購自EpiZyme公司;TGF-β1一抗、內(nèi)參抗體(β-actin)、HRP標記二抗,貨號：3709S/3700S/7074P2，購自CST公司;VEGF一抗,貨號：sc-7269，購自Santa Cruz公司;FITC標記二抗,貨號：GMS40007，購自杰美基因公司;RNA提取試劑(Trizol),貨號：15596-018，購自ThermoFisher公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,貨號：4368814，購自Invitrogen公司;TGF-β1及VEGF的qPCR引物,購自上海生工;miR-200b的Hairpin-it miRNAs qPCR引物套裝,貨號：E01011，購自吉瑪公司。

1.3 主要儀器

ELX800 Perkin Elmer酶標儀(BioTek公司);1658033垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(BIO-RAD公司);Image Quant LAS4000mini檢測儀器(GE Healthcare公司);6131-26843核酸蛋白分析儀(Eppendorf公司);AG22332 PCR自動系列化分析儀(Eppendorf公司);7500實時熒光定量PCR儀(ABI公司);CKX31倒置相差顯微鏡(Olympus公司);血糖檢測儀(倍穩(wěn)?倍捷型)。

2 方法

2.1 動物模型建立

從40只雄性SD大鼠中,隨機選取8只作為正常對照組,另外32只大鼠制備DR模型,方法如下:SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周+高脂飼料喂養(yǎng)3周后,禁食12 h,用pH4.5的0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液溶解STZ,配成1%溶液,按25 mg·kg-1劑量經(jīng)腹腔注射,間隔2 d后再以同等劑量注射1次,正常對照組SD大鼠予腹腔注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。模型組STZ注射完成后72 h測隨機血糖,大鼠血糖水平>16.7 mmol·L-1,則DM大鼠建模成功。DM模型組及正常組大鼠均自由進食飲水,定期測量血糖及體質(zhì)量,觀察形態(tài)改變。繼續(xù)喂養(yǎng)8周后,在DM大鼠中隨機抽取2只,正常對照組隨機抽取1只,處死后取雙側(cè)眼球,用眼科剪沿角鞏膜緣剪去角膜,去除前節(jié)和玻璃體,制成視杯。一側(cè)視杯制作石蠟切片及HE染色;另一側(cè)視杯分離出視網(wǎng)膜組織做血管消化鋪片,以共同確定DR大鼠造模成功。

2.2 分組給藥及取材

DR大鼠建模成功后隨機分配到以下4組:DR組、DR+芪地明目顆粒低劑量組(DR+FFE-L)、DR+芪地明目顆粒高劑量組(DR+FFE-H)、DR+羥苯磺酸鈣組(DR+CD)。DR+FFE-L組及DR+FFE-H組分別將芪地明目顆粒按1.0、3.0 g·kg-1·d-1劑量以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制后給大鼠灌胃。DR+CD組將羥苯磺酸鈣按照135 mg·kg-1·d-1劑量與0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制后給大鼠灌胃。正常對照組及DR組每日給予等量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。各組均正常飲食、進水、灌胃,持續(xù)8周后,用3%戊巴比妥鈉過量麻醉處死所有大鼠,迅速摘除雙側(cè)眼球,用眼科剪沿角鞏膜緣剪去角膜,去除前節(jié)和玻璃體,制成視杯。各組隨機抽取3只大鼠的雙側(cè)視杯,一側(cè)行HE染色,另一側(cè)行消化鋪片。其余視杯全部分離視網(wǎng)膜組織,冷凍于液氮中備用。

2.3 檢測指標

2.3.1 常規(guī)指標 在造模前后多個時點采大鼠尾靜脈血，檢測血糖,并記錄同時點體質(zhì)量。

2.3.2 視網(wǎng)膜組織HE染色 取各組新鮮制作的視杯,4%多聚甲醛固定24 h后,在通風櫥內(nèi)用手術刀將目的部位組織修平整,將修切好的組織放于脫水盒內(nèi)采用梯度濃度酒精脫水,二甲苯處理透明,之后進行石蠟包埋。使用切片機將蠟塊切為4 μm厚度組織切片,烘干后使用二甲苯及梯度濃度酒精常規(guī)脫蠟復水,使用蘇木素及伊紅染色液對切片進行染色,再次用梯度濃度酒精脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察各組視網(wǎng)膜組織的病理改變。

2.3.3 視網(wǎng)膜微血管消化鋪片 將視杯在預冷的4%多聚甲醛中固定48 h后取出,流水沖洗,以眼杯-視盤為中心剪成橘瓣樣,分離出內(nèi)壁的視網(wǎng)膜層,PBS漂洗,0.15 mol·L-1pH7.4的甘氨酸緩沖液浸泡過夜。3%胰蛋白酶37 ℃消化2 h。視網(wǎng)膜溶解后移入蒸餾水中輕輕振蕩,洗掉內(nèi)界膜及殘留的視網(wǎng)膜神經(jīng)組織,僅剩一層透明的視網(wǎng)膜血管網(wǎng),將其漂取并移至載玻片上展平,自然晾干,PAS染色。顯微鏡下觀察各組視網(wǎng)膜毛細血管的改變,計算每高倍視野直徑長度的血管數(shù)目及內(nèi)皮細胞/周細胞(E/P)比值。鏡下血管數(shù)目計算方法:200倍鏡下,每視網(wǎng)膜標本隨機取5個部位,每部位計算經(jīng)過高倍視野中心橫徑及垂直徑兩徑線的微血管數(shù)目,取其平均數(shù)作為該視野每徑線上血管數(shù)目,并取5個部位算出平均數(shù)代表該樣本高倍視野下血管數(shù)目。E/P比值計算方法:顯微鏡連接照相機,200倍鏡下對消化鋪片樣本進行拍照,隨機截取5個小范圍,在圖像分析軟件ImagePro Plus下進行內(nèi)皮細胞和周細胞計數(shù),計算E/P比值。

2.3.4 視網(wǎng)膜組織免疫熒光 取各組大鼠視網(wǎng)膜組織,同上方法制備組織切片,3%雙氧水孵育后依次進行抗原修復及山羊血清封閉,使用TGF-β1一抗4 ℃孵育過夜,洗滌,FITC標記的二抗37 ℃孵育30 min,洗滌、封閉,熒光顯微鏡下觀察并拍照,比較各組視網(wǎng)膜組織中TGF-β1表達的差異。VEGF檢測使用相應一抗及二抗,其余步驟同上。

2.3.5 定量qPCR檢測 取各組大鼠視網(wǎng)膜組織,使用RNA提取試劑(Trizol)提取各組樣本總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄為cDNA樣本后,用特異引物在DNA聚合酶(2×SYBR Green qPCR Mix)作用下進行擴增,在熒光定量PCR儀中分析miR-200b及TGF-β1、VEGF的mRNA表達水平。miR-200b以U6為內(nèi)參,TGF-β1及VEGF以β-actin為內(nèi)參。引物序列:miR-200b上游5'-ATCGTACGTGGGTAATACTGCCTGGTAA-3',下游5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3';U6上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';TGF-β1上游5'-AACAATTCCTGGCGTTACCTT-3',下游5'-GCCCTGTATTCCGTCTCCTT-3';VEGF上游5'-GAAGTGGTGAAGTTCATGGA-3',下游5'-TTGTCACATCTGCAAGTACG-3';β-actin上游5'-CACAGCTGAGAGGGAAATC-3',下游5'-TCAGCAATGCCTGGGTAC-3'。記錄熒光值達到閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值),用2-ΔΔCt進行相對定量分析。

2.3.6 Western blot檢測 取各組大鼠視網(wǎng)膜組織,加入RIPA裂解液后提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度后進行SDS-PAGE電泳,經(jīng)轉(zhuǎn)膜儀電轉(zhuǎn)印至PVDF膜后,以5%脫脂奶粉封閉2 h。加入稀釋后的TGF-β1一抗4 ℃過夜孵育,HRP標記二抗37 ℃孵育1 h。用ECL底物發(fā)光試劑對PVDF膜進行孵育,曝光顯影后掃描各組條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參,用Image J軟件分析TGF-β1蛋白相對表達水平。VEGF檢測使用相應一抗及二抗,其余同上。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況

對照組大鼠正常生長,體質(zhì)量逐漸增加,毛色光澤,進食正常;DM大鼠建模成功后,其食量、飲水量、尿量明顯增加,但體質(zhì)量相較于對照組增長緩慢,毛色萎黃;建模8周后,DR組大鼠行動緩慢,晶體混濁,明顯消瘦,個別大鼠出現(xiàn)腹脹;給藥組大鼠情況相對較好,輕中度消瘦,毛色尚有光澤,多伴有晶體混濁。

大鼠數(shù)量:評估DR模型時對照組處死1只,模型組隨機處死2只;在造模及后續(xù)給藥過程中,DR組大鼠死亡2只,對照組死亡1只,其余DR+給藥組各死亡1只。最終大鼠數(shù)量:對照組6只,DR組6只,DR+FFE-L組6只,DR+FFE-H組6只,DR+CD組7只。

3.2 各組大鼠體質(zhì)量及血糖情況

造模前4周時,各組大鼠體質(zhì)量及空腹血糖比較均無顯著差異。DM造模后,模型組大鼠體質(zhì)量逐漸減低,血糖顯著升高(P<0.01)。在造模后8周及16周時,所有模型組體質(zhì)量較對照組均顯著下降(P<0.01),空腹血糖較對照組均顯著升高(P<0.01);而DR+FFE-L組、DR+FFE-H組及DR+CD組體質(zhì)量及血糖較DR組均未見顯著差異(表1)。

表1 各組大鼠不同時點體質(zhì)量及空腹血糖比較Table 1 The comparisons of body mass and FBG of rats in all groups at different times

3.3 DR大鼠模型評價

對照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常,節(jié)細胞層細胞較為整齊,內(nèi)核以及外核層細胞排列緊密;模型組大鼠節(jié)細胞層細胞排列紊亂,內(nèi)核層與外核層排列較空白組相比稀疏,排列不緊密(圖1A),提示DR大鼠模型制備成功。

對照組大鼠視網(wǎng)膜毛細血管分布規(guī)則,血管管徑粗細均勻一致,走向較直。模型組大鼠毛細血管網(wǎng)排列紊亂,管徑粗細不均,扭曲擴張,管壁邊緣不規(guī)則,多根毛細血管扭聚成叢;內(nèi)皮細胞明顯增生(圖1B),同樣提示DR大鼠模型制備成功。

圖1 正常大鼠及DR模型大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色(A)及視網(wǎng)膜微血管PAS染色(B)比較(×200)Fig.1 The comparisons of retinal tissue HE (A) and retinal capillary PAS (B) of rats between normal and DR groups (×200)

3.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理改變

HE結(jié)果顯示:對照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常,節(jié)細胞層細胞較為整齊,內(nèi)核以及外核層細胞排列緊密;DR組大鼠節(jié)細胞層細胞排列較為紊亂,內(nèi)核層與外核層排列較空白組相比稀疏,排列不緊密。DR+FFE-L組節(jié)細胞紊亂有所減輕,內(nèi)核以及外核層細胞排列較DR組緊密。而DR+FFE-H組及DR+CD組的病理改變有進一步減輕(圖2)。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果比較(×200)Fig.2 The comparisons of retinal tissue HE of rats in all groups (×200)

3.5 各組視網(wǎng)膜毛細血管改變

血管消化鋪片顯示:對照組大鼠視網(wǎng)膜毛細血管分布規(guī)則,血管管徑粗細均勻一致,走向較直,可見極少數(shù)無細胞毛細血管,未見周細胞鬼影;微血管數(shù)目:14.83±2.04,E/P比值:1.03±0.12。DR組大鼠視網(wǎng)膜毛細血管網(wǎng)明顯變密,行走紊亂,管徑粗細不均,扭曲擴張,管壁邊緣不規(guī)則,多根毛細血管扭聚成叢,可見較多無細胞毛細血管、周細胞鬼影,內(nèi)皮細胞明顯增生;微血管數(shù)目(30.33±3.83)和E/P比值(2.43±0.22)較對照組均顯著升高(P<0.001)。DR+FFE-L組的微血管改變較DR組有所減輕,微血管數(shù)目(25.33±2.81)和E/P比值(1.50±0.14)較DR組均顯著下降(P<0.01,P<0.001)。而DR+FFE-H組及DR+CD組微血管改變有進一步改善,微血管數(shù)目及E/P比值較DR組均顯著下降(P<0.001)(圖3,表2)。

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜血管消化鋪片結(jié)果比較(×200)Fig.3 The comparisons of retinal capillary trypsin digest of rats in all groups (×200)

表2 各組視網(wǎng)膜血管消化鋪片微血管數(shù)目及E/P比值比較Table 2 The comparisons of retinal vascular quantity and E/P of retinal capillaries in all groups

3.6 各組視網(wǎng)膜組織中TGF-β1及VEGF蛋白表達情況比較

視網(wǎng)膜組織免疫熒光顯示:DR組TGF-β1以及VEGF較對照組表達明顯升高(P<0.01),DR+FFE-L組、DR+FFE-H組較DR組顯著降低(P<0.05，P<0.01),DR+CD組降低最明顯(P<0.01)(圖4)。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中TGF-β1及VEGF蛋白免疫熒光比較(×200)Fig.4 The comparisons of TGF-β1 and VEGF immunofluorescence of retinal tissues in all groups(×200)

視網(wǎng)膜組織Western blot檢測顯示:DR組TGF-β1及VEGF蛋白表達較對照組明顯升高(P<0.01),DR+FFE-L組較DR組有顯著下降(P<0.05),DR+FFE-H組VEGF較DR+FFE-L組有顯著下降(P<0.05),DR+CD組TGF-β1及VEGF較DR組均有顯著下降(P<0.01)(圖5)。

3.7 各組視網(wǎng)膜組織中miR-200b及TGF-β1、VEGF mRNA表達情況比較

視網(wǎng)膜組織qPCR檢測顯示:DR組TGF-β1及VEGF mRNA表達較對照組顯著升高(P<0.01),miR-200b表達較對照組顯著降低(P<0.01)。DR+FFE-L組TGF-β1及VEGF mRNA表達較DR組明顯下降(P<0.01),miR-200b較DR組顯著上升(P<0.05)。DR+FFE-H組VEGF mRNA表達較DR+FFE-L組有進一步下降(P<0.01),miR-200b較DR+FFE-L組有進一步上升(P<0.01)。DR+CD組TGF-β1及VEGF mRNA表達較DR組均明顯下降(P<0.01),miR-200b較DR組表達顯著升高(P<0.01)(圖6)。

注：與對照組比較，##P<0.01;與DR組比較，*P<0.05,**P<0.01；與DR+FFE-H組比較，△P<0.05。圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中TGF-β1及VEGF蛋白表達情況比較Fig.5 The comparisons of TGF-β1 and VEGF protein expressions in retinal tissue of rats in all groups

注：與對照組比較，##P<0.01;與DR組比較，*P<0.05,**P<0.01；與DR+FFE-H組比較，△△P<0.01。圖6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中TGF-β1、miR-200b、VEGF mRNA表達情況比較Fig.6 The comparisons of TGF-β1, miR-200b and VEGF mRNA expressions in retinal tissue of rats in all groups

4 討論

祖國醫(yī)學認為DR屬“消渴目病”范疇,其病機相對復雜,但病性總屬本虛標實,本虛以陰虛、氣虛為主,標實以濕濁、血瘀為主[10],“在氣陰虧虛基礎上,濕、瘀逐漸形成并貫穿DR始終”可視為DR的基本病機[11],因此,益氣養(yǎng)陰、化濕活血法可作為DR的基本治則。芪地明目顆粒由黃芪、生地黃、石斛、黃蜀葵花、丹皮、丹參、三七粉、密蒙花組成,方中黃芪味甘,性微溫,可益氣兼利濕通滯;生地黃味甘,性寒,可養(yǎng)陰生津;石斛味甘,性微寒,可滋陰生津,此三者相伍,為益氣養(yǎng)陰之主藥;黃蜀葵花味甘,性寒,可清利濕熱;丹皮苦、辛,性微寒,有涼血活血之功;丹參味苦,微寒,有祛瘀涼血之功;三七味甘、微苦,性溫,可化瘀止血,此四者相伍,為化濕活血之主藥;密蒙花味甘,微寒,有清熱養(yǎng)肝明目之功。全方溫涼配合、補清并用,共奏益氣養(yǎng)陰、化濕活血之功效。

BRB是介于視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞與毛細血管之間的選擇性通透結(jié)構(gòu),負責調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微環(huán)境并維持其穩(wěn)態(tài)。高糖環(huán)境下糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)增多可使視網(wǎng)膜周細胞(Retinal pericytes,RPCs)凋亡增加,視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞(Retinal endothelial cells,RECs)異常遷移和增殖,同時細胞間的緊密連接(Tight junctions,TJs)結(jié)構(gòu)受到破壞,細胞間隙擴大,視網(wǎng)膜毛細血管通透性顯著增加,BRB功能異常及損傷逐步出現(xiàn)[12],這也是DR早期的基本病理改變。在高糖誘導BRB損傷的分子機制中,TGF-β1/miR-200b/VEGF通路的激活被認為扮演了重要的角色。

高糖及AGEs可使淋巴細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞及上皮細胞等表達TGF-β1的水平及活性明顯上升[13]。被激活的TGF-β1與細胞表面特異性受體結(jié)合后,可將信號傳遞給胞內(nèi)分子Smads蛋白[14],Smads蛋白將信號繼續(xù)跨膜傳入細胞核內(nèi)可抑制miR-200b啟動子的活性使其表達顯著下降[15]。而miR-200b是一種能特異性與VEGF mRNA的3'非編碼區(qū)相結(jié)合,進而發(fā)揮抑制VEGF mRNA翻譯及蛋白合成的非編碼RNA[16]。miR-200b水平的下降,可使VEGF的表達顯著上升。高表達的VEGF與其受體結(jié)合后可對視網(wǎng)膜組織產(chǎn)生多種效應,如加速RPCs凋亡;促進RECs異常增殖;破壞細胞間的TJs蛋白Occludin和Claudin;誘導細胞間黏附因子-1表達;抑制色素上皮源性因子對VEGF的拮抗作用;促進細胞吞飲及內(nèi)皮細胞穿孔等[17],最終使BRB損傷導致出血、滲出、水腫等典型的DR早期改變。

本實驗中大鼠視網(wǎng)膜血管消化鋪片結(jié)果顯示DR組E/P比值及微血管數(shù)目顯著高于正常對照組,提示DR組RPCs凋亡、RECs增殖及血管新生均明顯增加;視網(wǎng)膜組織HE染色顯示DR組節(jié)細胞層排列紊亂,內(nèi)核層與外核層排列較稀疏,提示DR組損傷相對較重,已突破BRB,波及至視神經(jīng)細胞。而芪地明目顆粒干預組,無論是視網(wǎng)膜E/P比值、微血管數(shù)目還是HE染色,較DR組均有顯著改善,且這種改善作用隨藥物劑量的增加而越發(fā)明顯。由此提示,芪地明目顆粒對DR大鼠的視網(wǎng)膜損傷確實具有保護作用。

而進一步的實驗結(jié)果顯示,DR組大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β1、VEGF的表達顯著高于對照組,miR-200b的表達顯著低于對照組,這與之前文獻提示的高糖可激活TGF-β1/miR-200b/VEGF通路引發(fā)DR的描述一致。而芪地明目顆粒干預組大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β1、VEGF的表達顯著低于DR組,miR-200b的表達顯著高于DR組,提示該中藥復方可明顯抑制DR大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β1/miR-200b/VEGF通路的激活,且該抑制效應在高劑量芪地明目顆粒組表現(xiàn)得更為明顯。此外,DR組、DR+FFE-L組、DR+FFE-H組各時段的血糖均無顯著差異,提示芪地明目顆粒干預DR的療效并非通過降低血糖的途徑獲得,這與既往某些研究的結(jié)果不完全一致。如周赫等[18]發(fā)現(xiàn),含黃連、黃芪中藥復方可顯著降低DR小鼠血糖,同時對視網(wǎng)膜微血管損傷具有明顯的保護作用;歐陽黃迪[19]也發(fā)現(xiàn),參芪護網(wǎng)湯能改善DR患者血糖,同時可減輕黃斑水腫,促進視網(wǎng)膜出血、滲出的吸收。然而需要引起重視的是,由于長期高血糖引發(fā)了“代謝記憶”效應,許多患者會出現(xiàn)血糖雖獲得顯著改善卻仍無法阻止DR進展的尷尬局面[20]。因此,探尋獨立于血糖控制之外的DR干預手段,顯得尤為重要。本研究的結(jié)果向我們展示了芪地明目顆粒通過抑制TGF-β1/miR-200b/VEGF通路而非通過降低血糖達到干預DR的作用,其可被視作一種潛在的獨立于血糖控制之外的有效干預DR的補充和替代治療。

綜上,本研究通過相關體內(nèi)實驗初步證實了芪地明目顆粒對DR大鼠視網(wǎng)膜損傷的保護作用,并對其可能通過抑制TGF-β1/miR-200b/VEGF通路而達到相應療效的作用機制作出了初步探索,后期將進一步完善相關研究以期獲得更為有力的證據(jù)。