miR-1180基因沉默介導(dǎo)Wnt通路增強人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株THC8307/L-OHP化療的敏感性

蒼宏宇，郝靈芳，梁潤

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一，據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)布的最新癌癥數(shù)據(jù)顯示，結(jié)腸癌發(fā)病率僅次于乳腺癌和肺癌居第3位，死亡率僅次于肺癌居第2位[1]。對于中晚期結(jié)腸癌患者多采用手術(shù)結(jié)合放化療為主的綜合治療方案，奧沙利鉑(L-OHP)是目前臨床常用的鉑類化療藥物，但長期使用易導(dǎo)致患者產(chǎn)生化療耐藥性，嚴(yán)重影響化療效果[2]。因此探討結(jié)腸癌化療耐藥性的形成機制并尋求有效提高腫瘤化療敏感性的方法有重要意義。Wnt信號通路是調(diào)控細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵通路，Wnt的異常激活與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[3]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt通路的關(guān)鍵基因，Wnt可通過活化β-catenin促進其下游的細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、多藥耐藥基因1(MDR1)等靶基因的表達，上述過程在多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生轉(zhuǎn)移和化療耐藥中發(fā)揮促進作用[4-5]。微小核糖核酸-1180(miR-1180)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種小分子非編碼RNA，異常表達于多種惡性腫瘤，呈現(xiàn)一定的腫瘤特異性。例如，miR-1180在卵巢癌和肝癌中表達上調(diào)發(fā)揮促癌作用[6-7]，但在腎癌和胰腺癌中卻呈低水平表達，發(fā)揮抑癌作用[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1180還可以通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路促進卵巢癌細(xì)胞的增殖和糖酵解[10]，但其對結(jié)腸癌化療敏感性的作用尚無相關(guān)報道。因此，本研究通過體外實驗觀察miR-1180基因沉默介導(dǎo)Wnt通路增強人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株THC8307/L-OHP化療敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株THC8307/L-OHP(武漢普諾賽生命科技有限公司，生產(chǎn)批號CL-0118)。

1.1.2 藥物與試劑

L-OHP(湖北齊飛醫(yī)藥化工有限公司，生產(chǎn)批號為QF2006)；二甲基亞砜(DMSO)(上海源葉生物科技有限公司，生產(chǎn)批號為S24295)；噻唑藍(MTT)(上海脈鉑醫(yī)藥科技有限公司，生產(chǎn)批號MED17868)；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，生產(chǎn)批號KFS186)；Trizol試劑盒(美國Thermo Fisher公司，生產(chǎn)批號15596-018)；2,2′-聯(lián)喹啉-4,4′-二甲酸二鈉(BCA)蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號PC0022)；兔抗人Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、抗凋亡因子(Bcl-2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號MA5-15511、MA5-15046、701857、39-0300、PA1-9118、PA5-19149)；山羊抗兔Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2、GAPDH多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號MA5-11757、13-8800、MA1-26233、14-1028-82、MA5-15046、PA5-34316)；雙熒光素酶報告載體Wnt-WT和Wnt-Mut均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建；miR-1180 inhibitor、NC inhibitor均由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計合成。

1.1.3 實驗儀器

BOI-50型恒溫培養(yǎng)箱(上海三騰儀器有限公司)；NSOM型普通光學(xué)顯微鏡(以色列Nanonics公司)；QLS-scope型熒光顯微鏡(西班牙Planelight公司)；SuPerMax 3000FA型多功能酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司)；CMVC U-M型超低溫高速離心機(德國CMVC公司)；Northern Lights 1L-3L型流式細(xì)胞儀(美國Cytek Biosciences公司)；CG-05型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀[力新儀器(上海)有限公司]；Capel-105M型電泳儀(加拿大LUMEX公司)；TY-201-01型M-Blot快速轉(zhuǎn)膜儀(南京中科通儀科技有限公司)；Biosens 850型凝膠成像系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代和分組

將人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株THC8307/L-OHP以含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的THC8307/L-OHP細(xì)胞，按1.0×105個/孔接種于96孔板。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-1180 inhibitor(正義鏈序列5′-CCAGUACGAUUAGCGAU-3′，反義鏈序列5′-UGAAGUCGGA-UGACGC-3′)、NC inhibitor(正義鏈序列5′-AAGUCCGUAGA-UCCUGC-3′，反義鏈序列5′-AAUGCCAAGCCGUAGC-3′)慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染THC8307/L-OHP細(xì)胞并記為沉默組和對照組，另取未轉(zhuǎn)染細(xì)胞記為空白組，每組6個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后，分別在普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下拍照計數(shù)，計算沉默組和對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率=(熒光鏡下發(fā)光細(xì)胞數(shù)/光鏡下細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.2 MTT法檢測各組細(xì)胞活力和對L-OHP的半數(shù)抑制濃度(IC50)

將各組細(xì)胞以1.0×104個/孔接種至96孔板，分別在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0、3.13、6.25、12.5、25、50 μmol/mL的L-OHP作用48 h。每孔加入20 μL的MTT溶液，37 ℃條件下在培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸去培養(yǎng)液，加入150 μL的DMSO，繼續(xù)孵育10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測各孔光密度(OD)值，以此代表細(xì)胞活力，用SPSS 25.0軟件計算各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50，μg/mL)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率

分別取各組細(xì)胞加入胰蛋白酶進行消化處理，以1×106個/孔接種至96孔板中，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，1000 rpm(離心半徑6 cm)離心5 min，用提前預(yù)冷的75%的酒精固定細(xì)胞2 h，PBS再次沖洗細(xì)胞，離心棄上清，加緩沖液重懸細(xì)胞。加入5 μL的細(xì)胞染色劑Annexin Ⅴ-FITC和2 μL的PI原液混勻，避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測各組細(xì)胞miR-1180表達及Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2信使核糖核酸(mRNA)表達

Trizol法提取其各目的基因的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，以cDNA為模板進行PCR擴增。引物由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計合成，其中miR-1180上游引物5′-TAGGTACGTACAGTACA-3′，下游引物5′-CCGTAGTACGATCA-3′，產(chǎn)物長度188 bp；Wnt上游引物5′-CTGGATCAGTACGC-3′，下游引物5′-GATGTAACGTACGAT-3′，產(chǎn)物長度193 bp；β-catenin上游引物5′-AACTGAGG-TAGCCGCA-3′，下游引物5′-TGTTGACCTAGCAGC-3′，產(chǎn)物長度204 bp；CyclinD1上游引物5′-GCCGATAGCTAGCAAC-3′，下游引物5′-TTGCCAAGTACCCGTAA-3′，產(chǎn)物長度179 bp；MDR1上游引物5′-AATGCTCGATCGCCCAG-3′，下游引物5′-CCGTATTCGCAACGATAC-3′，產(chǎn)物長度215 bp；Bcl-2上游引物5′-TAAGTCCGTAAGCTAGATC-3′，下游引物5′-AATCGCT-AGTCGATACCGG-3′，產(chǎn)物長度162 bp；U6上游引物5′-GAATGCTCGTACCTAG-3′，下游引物5′-ATGTGTACCGATCA-3′，產(chǎn)物長度133 bp；GAPDH上游引物5′-CAGGTCGCTAGAT-CGCTAACC-3′，下游引物5′-AAGCTCGTACGAGGCGT-3′，產(chǎn)物長度281 bp。反應(yīng)體系：2 μL cDNA，上下游引物各0.5 μL，2.5 μL 10×PCR Buffer，2.5 μL三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs)，加入超純無酶雙蒸水至25 μL，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s、變性94 ℃ 5 s、退火及延伸72 ℃ 1 min。共計40個循環(huán)。miR-1180以U6為內(nèi)參，Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-1180表達及各基因mRNA的相對表達量，其中ΔCt=Ct平均值(目的基因)-Ct平均值(內(nèi)參基因)，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法(WB)檢測各組細(xì)胞Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2蛋白表達

分別取各組細(xì)胞1×107個，加入500 μL預(yù)冷的PBS沖洗3次，冰浴60 min。加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液裂解細(xì)胞30 min，棄上清液，加入等體積蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min使蛋白質(zhì)充分變性。以20 μg/孔樣品液加樣于加樣孔內(nèi)，電泳分離，分離蛋白轉(zhuǎn)移法將膠轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗人Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2、GAPDH單克隆抗體(稀釋倍數(shù)為1∶1000)，4℃孵育過夜。次日加入對應(yīng)的山羊抗兔Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2、GAPDH多克隆抗體(稀釋倍數(shù)為1∶2000)，室溫下孵育30 min，電化學(xué)發(fā)光液進行曝光顯影，Biosens 850型凝膠成像系統(tǒng)分析處理，以目標(biāo)蛋白與GAPDH灰度值的比值代表目標(biāo)蛋白的相對表達水平。

1.2.6 雙熒光素酶活性實驗驗證miR-1180靶向調(diào)控Wnt

采用TargetScan靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-1180的靶基因。將雙熒光素酶報告載體Wnt-WT、Wnt-MuT與miR-1180 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染THC8307/L-OHP細(xì)胞。根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書的操作步驟檢測miR-1180 mimics組和miR-NC組中Wnt熒光素酶相對活性，以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值為熒光素酶相對活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率比較

對照組和沉默組轉(zhuǎn)染效率分別為(93.51±1.89)%、(94.09±2.26)%，均在90%以上，見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染效率圖(×200)

2.2 MTT法檢測各組細(xì)胞活力和IC50值

在同一濃度下，與空白組和對照組比，沉默組細(xì)胞活力下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各組細(xì)胞活力均隨L-OHP濃度的升高而降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且空白組和對照組在不同L-OHP濃度下細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2?？瞻捉M、對照組和沉默組細(xì)胞的IC50值分別為(22.59.06±4.12)μmol/L、(23.05±4.18)μmol/L和(7.74±1.40)μmol/L，與空白組和對照組比，沉默組IC50值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且空白組和對照組IC50值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 各組細(xì)胞活力圖 與空白組比，#P<0.05，與對照組比▲P<0.05；與本組0 μmol/mL L-OHP比，*P<0.05；與本組3.13 μmol/mL L-OHP比，&P<0.05；與本組6.25 μmol/mL L-OHP比，◇P<0.05；與本組12.5 μmol/mL L-OHP比，△P<0.05，與本組25 mol/mL L-OHP比，▽P<0.05

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率

空白組、對照組和沉默組細(xì)胞凋亡率分別為(15.52±2.89)%、(17.74±3.05)%和(45.48±8.44)%，與空白組和對照組比，沉默組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且空白組和對照組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 各組細(xì)胞凋亡率檢測(流式細(xì)胞術(shù))

2.4 RT-qPCR檢測各組細(xì)胞miR-1180表達及Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2mRNA表達

與空白組和對照組比，沉默組miR-1180表達及Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2mRNA表達均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，空白組和對照組上述差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組細(xì)胞miR-1180表達及Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2 mRNA表達

2.5 WB檢測各組細(xì)胞Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2蛋白表達

與空白組和對照組比，沉默組Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2蛋白表達均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，空白組和對照組上述差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4，表2。

表2 各組細(xì)胞Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2蛋白表達

圖4 各組細(xì)胞Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2蛋白表達

2.6 雙熒光素酶活性實驗驗證miR-1180靶向調(diào)控Wnt

經(jīng)TargetScan數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，Wnt的3′UTR序列中含有miR-1180的結(jié)合位點，表明Wnt可能是miR-1180的靶基因。在轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt-WT細(xì)胞中，miR-1180 mimic組細(xì)胞熒光素酶相對活性低于miR-NC組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt-Mut細(xì)胞中，miR-1180 mimic組與miR-NC組細(xì)胞熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

圖5 miR-1180靶基因預(yù)測及熒光素酶相對活性檢測 (與miR-NC組比，*P<0.05)

3 討論

結(jié)腸癌的確切發(fā)病原因尚未完全闡明，目前已知的與結(jié)腸癌發(fā)病有關(guān)的因素有遺傳、飲食、環(huán)境、生活習(xí)慣等[11]。對于早中期患者臨床上多采用手術(shù)切除治療，而對于晚期結(jié)腸癌患者則主要以化療為主，但是化療耐藥性的產(chǎn)生使得部分患者療效有限[12-13]。因此，了解化療耐藥性的發(fā)生機制并提高化療敏感性已成為近些年的研究熱點。

L-OHP是第3代鉑類化療藥物，在安全性和抗腫瘤效果等方面均較順鉑有較大提升，是消化道腫瘤治療的常用藥物[14]。L-OHP主要是通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，但耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重影響了化療效果[15]。miRNAs是內(nèi)源性短鏈非編碼RNAs，通過結(jié)合目標(biāo)mRNA參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控[16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[17]，miRNAs與腫瘤化療敏感性密切相關(guān)。Pandey等[18]報道指出，miRNAs可通過靶向調(diào)控耐藥基因的表達提高腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，逆轉(zhuǎn)化療耐藥并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。miR-1180是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的多功能miRNA，在不同的惡性腫瘤中發(fā)揮不同作用。本研究結(jié)果顯示，空白組和對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均在90%以上，與空白組和對照組比，沉默組細(xì)胞活力及IC50值降低，而凋亡率升高，說明已成功轉(zhuǎn)染THC8307/L-OHP，從而抑制了miR-1180的表達，導(dǎo)致細(xì)胞活力IC50值降低，細(xì)胞凋亡率提高，化療敏感性增強。有報道顯示[19]，下調(diào)miR-1180的表達可通過調(diào)控細(xì)胞周期促進胃癌細(xì)胞凋亡，并抑制其增殖活力，本研究結(jié)果與該報道相一致。

本研究中，與空白組和對照組比，沉默組Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2mRNA及蛋白表達均降低，說明miR-1180基因沉默可抑制THC8307/L-OHP 細(xì)胞株Wnt通路及其下游基因的表達。雙熒光素酶實驗結(jié)果證實了miR-1180可靶向調(diào)控Wnt，因此推測miR-1180可能是通過靶向調(diào)控Wnt的表達增強了THC8307/L-OHP細(xì)胞株化療敏感性的。Wnt信號通路是廣泛存在于生物體內(nèi)的一條經(jīng)典癌癥相關(guān)調(diào)控通路，異常激活的Wnt信號通路已被證實有助于癌癥的發(fā)生、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和化療耐藥[20-21]。β-catenin是細(xì)胞間黏附連接的重要組分，是Wnt信號通路的調(diào)節(jié)中心，在Wnt激活后作為轉(zhuǎn)錄激活因子進入細(xì)胞核啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達[22]。Bcl-2基因是Bcl基因家族的主要成員，作為一種抗凋亡因子抑制多種組織細(xì)胞凋亡。近年來發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因及其蛋白有著更加廣泛的功能，其過表達不但參與細(xì)胞增殖和的凋亡調(diào)控，而且在腫瘤的多藥耐藥中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[23]。以往研究顯示[24]，Wnt可通過激活β-catenin并促進其下游的CyclinD1、多藥耐藥基因MDR1、抗凋亡因子Bcl-2等靶基因的表達，促進腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡和轉(zhuǎn)移，從而促進化療耐藥產(chǎn)生。有報告指出[25]，來自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的miR-1180能夠通過上調(diào)Wnt信號通路的表達，激活轉(zhuǎn)錄因子β-catenin進入細(xì)胞核，并促進CyclinD1、MDR1、Bcl-2的表達，增強卵巢癌細(xì)胞的化療耐藥性，進一步佐證了本研究的猜想。

綜上所述，miR-1180基因沉默可能是通過靶向Wnt信號通路，抑制Wnt、β-catenin、CyclinD1、MDR1、Bcl-2的表達，增強THC8307/L-OHP細(xì)胞株的化療敏感性。本研究進一步闡釋了miR-1180基因沉默對人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株化療敏感性的作用及機制，為結(jié)腸癌的靶向治療提供了新的思路。