經(jīng)自然腔道內(nèi)鏡手術(shù)微創(chuàng)保膽治療膽囊炎患者圍手術(shù)期腸道菌群的變化

鄧立新，陳藝玲，呂新芝，唐慶林，劉將，溫慧萍，溫春虹，黃東，王淘淘，張鳴青

膽囊結(jié)石、膽囊良性息肉是臨床常見(jiàn)的膽囊良性病變，近年來(lái)其發(fā)病率逐年升高。全球成年人膽囊結(jié)石總患病率已達(dá)10%～20%[1]。膽囊息肉在我國(guó)的患病率也逐年升高[2-5]。膽囊結(jié)石合并膽囊炎患者通常會(huì)因工作壓力、飲食習(xí)慣等因素影響，使得病情更加嚴(yán)重，若不及時(shí)治療則容易出現(xiàn)多種并發(fā)癥，對(duì)患者的生命健康構(gòu)成威脅。針對(duì)膽囊結(jié)石合并膽囊炎患者的治療，傳統(tǒng)方式是開(kāi)腹膽囊切除術(shù)，雖然徹底解決了膽石癥發(fā)作帶來(lái)的痛苦，但膽囊缺失所帶來(lái)的并發(fā)癥，如消化不良、腹脹腹瀉、十二指腸液的胃反流、胃液食管反流、膽管損傷、肝膽管結(jié)石、甚至增加結(jié)腸癌發(fā)生率等嚴(yán)重影響著患者術(shù)后的生活質(zhì)量[6]。近年來(lái)，由張寶善教授倡導(dǎo)的內(nèi)鏡微創(chuàng)保膽手術(shù)(choledochoscopic gallbladder-preserving surgery，CGPS)日趨成熟，已經(jīng)成為治療膽囊良性疾病的手術(shù)方式之一[7]。CGPS是用軟性(纖維)膽道鏡進(jìn)入膽囊內(nèi)進(jìn)行檢查和治療，纖維膽道鏡既可以隨意彎曲，又可以照明觀察，哪里有結(jié)石就可以到達(dá)哪里取石，做到完全、徹底取凈結(jié)石；此外，對(duì)懷疑有肝內(nèi)外膽管結(jié)石或其它膽道疾患者，可經(jīng)膽囊管纖維膽道鏡檢查并通過(guò)監(jiān)視器得到其他術(shù)者的監(jiān)視和幫助，獲得病變的印象更為可靠[8]。與膽囊切除術(shù)相比，腹腔鏡(laparoscope)保膽取石術(shù)具有保留膽囊生理功能、改善生活質(zhì)量、避免膽汁反流、緩解因器官缺失而造成的精神壓力等優(yōu)點(diǎn)[9]，然而治療膽囊結(jié)石的金標(biāo)準(zhǔn)依然為腹腔鏡膽囊切除術(shù)[10]。除了腹腔鏡膽囊切除術(shù)歷史悠久，技術(shù)成熟外，歸根到底，制約著CGPS難以廣泛推廣的原因在于，術(shù)后膽囊結(jié)石仍有一定的復(fù)發(fā)率[11]。

膽囊結(jié)石合并膽囊炎作為一種常見(jiàn)消化道疾病，由膽固醇代謝失衡(包括腸道吸收、肝臟合成、膽汁膽固醇輸出及轉(zhuǎn)化膽汁酸過(guò)程)引起[12]。其發(fā)病原理是膽固醇與膽汁酸濃度的比例發(fā)生變化，膽汁阻滯，形成結(jié)石[13]。由于腸道細(xì)菌在轉(zhuǎn)化次級(jí)膽汁酸過(guò)程中扮演重要角色，可在一定程度上影響膽固醇與膽汁酸濃度的比例，推測(cè)腸道菌群紊亂與膽結(jié)石病之間可能存在某種關(guān)聯(lián)性。

經(jīng)自然腔道內(nèi)鏡手術(shù)(natural orifice transluminal endoscopic surgery，NOTES)是指不經(jīng)腹壁切口，而經(jīng)過(guò)人體自然腔道進(jìn)入人體腔內(nèi)進(jìn)行內(nèi)鏡下操作和治療的全新技術(shù)[14]。十年前中國(guó)消化界學(xué)者接受了NOTES 的概念并開(kāi)展了一系列研究活動(dòng)。李兆申、張澍田、李聞等率先開(kāi)始NOTES 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，王東、朱惠明、劉冰熔等將NOTES 技術(shù)應(yīng)用于臨床工作，劉冰熔等相繼報(bào)道了多例世界首創(chuàng)應(yīng)用經(jīng)胃NOTES 技術(shù)進(jìn)行宮外孕切除術(shù)、卵巢囊腫剝離術(shù)、經(jīng)胃或經(jīng)直腸純NOTES 保膽取石術(shù)及保膽息肉摘除術(shù)等[15]。NOTES 技術(shù)避免了腹壁切口，因此其預(yù)期的好處包括術(shù)后疼痛更輕、恢復(fù)期短、避免傷口感染和腹壁疝以及體表沒(méi)有疤痕等，是繼腹腔鏡技術(shù)之后最重要的創(chuàng)新微創(chuàng)手術(shù)方式。由于該手術(shù)突破了消化道壁等傳統(tǒng)的禁區(qū)，近年來(lái)一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)[16]。考慮到NOTES 與腹腔鏡微創(chuàng)保膽手術(shù)兩者在內(nèi)鏡使用和手術(shù)入路等方面存在許多差異，作為一項(xiàng)創(chuàng)新手術(shù)，其治療價(jià)值尚存爭(zhēng)議。本文結(jié)合患者圍手術(shù)期的肝功能和腸道菌群的變化，為系統(tǒng)研究行NOTES微創(chuàng)保膽手術(shù)對(duì)膽囊炎患者腸道菌群的長(zhǎng)期影響提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

前瞻性納入2018年1月至2018年7月聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院消化內(nèi)科住院需行內(nèi)鏡微創(chuàng)保膽治療的膽囊炎患者29例，其中1例患者因測(cè)序后缺失術(shù)前糞便樣品測(cè)序結(jié)果予以剔除。最終納入患者28例，其中男性14例，女性14例；平均年齡(49.43±12.51)歲。經(jīng)胃入路手術(shù)12例，經(jīng)直腸入路手術(shù)15例，經(jīng)臍入路手術(shù)1例；結(jié)石患者有14例：男性5例，女性9例；息肉患者有14例：男性9例，女性5例?？傮w上看，男性患者息肉比例相對(duì)較高，而女性患者結(jié)石病例相對(duì)較高(表1)?；颊咝g(shù)前一般予以口服諾氟沙星和甲硝唑預(yù)防感染，手術(shù)過(guò)程予以左氧氟沙星沖洗腹腔，術(shù)后采用頭孢類抗生素靜脈連續(xù)滴注進(jìn)行預(yù)防感染處理，術(shù)后均無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥；術(shù)前術(shù)中術(shù)后均給予抗生素預(yù)防感染治療患者有22例，術(shù)后給予抗感染治療患者有6例。1例患者由直腸入路行NOTES手術(shù)取膽囊息肉，術(shù)后出現(xiàn)直腸穿孔并急性腹膜炎，給予復(fù)查腸鏡并經(jīng)腸鏡再次給予一枚止血夾夾閉，采用腹腔排氣機(jī)行腹腔灌洗以及左側(cè)腹腔穿刺置中心靜脈導(dǎo)管引流術(shù)，癥狀完全緩解后出院。

表1 患者一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：①持續(xù)或間歇性右上腹痛、腹脹；②超聲/CT檢查掃描可見(jiàn)強(qiáng)回聲團(tuán)或彩超提示膽囊息肉樣變；③膽囊輪廓清晰，位置、大小正常，膽囊收縮功能良好；④心肺功能正常；⑤有明確保膽意愿。排除標(biāo)準(zhǔn)：①膽囊結(jié)石急性炎癥發(fā)作期：如合并急性膽囊炎、急性膽管炎、膽源性胰腺炎；②膽囊已基本無(wú)功能，膽囊管閉塞，膽囊萎縮者；③膽囊惡性腫瘤患者；④不適宜進(jìn)行無(wú)痛胃腸鏡手術(shù)治療的患者；⑤不同意進(jìn)行微創(chuàng)保膽治療的患者以及資料不全的可疑患者。本研究通過(guò)聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批件號(hào)為2018-009-01；并已在中國(guó)臨床注冊(cè)試驗(yàn)中心注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)為ChiCTR1900028267。

1.2 采樣方法

所有受試對(duì)象對(duì)本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容與性質(zhì)均有明確認(rèn)知，糞便樣本采集均得到本人同意，采樣程序符合醫(yī)院倫理要求。術(shù)前由護(hù)士留取糞便一次，術(shù)后3～9 d內(nèi)，再留取糞便一次。無(wú)菌條件下獲取研究對(duì)象自然排出的新鮮糞便，避開(kāi)表面，采集中心部分糞便樣本2～5 g，置于已滅菌糞便收集管中，封口后置于冰盒暫存并帶回實(shí)驗(yàn)室保存在-70 ℃冰箱。樣品以干冰運(yùn)輸，委托上海慕柏生物醫(yī)學(xué)科技有限公司以Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 樣品Miseq測(cè)序分析

針對(duì)16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行Miseq PE 2×300 bp高通量測(cè)序。采用物化法進(jìn)行核酸提取，PCR擴(kuò)增經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程后，嚴(yán)格遵循：①樣品濃度的均一性；②最低循環(huán)數(shù)的控制；③每例樣品擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的統(tǒng)一。PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)，上下游引物為341F-805R。根據(jù)PE (Paired End) Reads之間互補(bǔ)區(qū)域，將配對(duì)的Reads拼接成一條序列，同時(shí)對(duì)Reads的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，根據(jù)序列首尾兩端的index序列和引物序列區(qū)分樣品得到高質(zhì)量的有效序列，并校正序列方向；所有樣本的Illumina Miseq測(cè)序原始讀數(shù)數(shù)據(jù)保存在歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室核苷酸檔案數(shù)據(jù)庫(kù)(PRJNA750235)。

1.4 操作單元聚類、注釋與統(tǒng)計(jì)

利用Usearch算法(Usearch algorithm)將拼接好的序列聚類歸類為操作單元(operational taxonomic unit, OTU)，軟件平臺(tái)為Usearch[17](version 11，http://drive5.com/uparse/)。對(duì)所有樣品的有效序列，以97%的相似性(Identity) 將序列聚類成為OTU。Venn圖用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣品中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目[18]。

1.5 α-多樣性分析(α-diversity analysis)

多樣性指數(shù)分析：根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果，通過(guò)單樣品的α多樣性計(jì)算，可以估計(jì)物種豐度和多樣性。計(jì)算菌群豐度的指數(shù)有Ace、Chao1；計(jì)算菌群的多樣性指數(shù)有Simpson、Shannon；測(cè)序深度的指數(shù)有Coverage。分析軟件為mothur[19](version v.1.30.1 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)，用于指數(shù)評(píng)估的OTU相似水平為97%。

稀釋性曲線(rarefaction curve)[20]采用對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建rarefaction curve，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。因此，通過(guò)作稀釋性曲線，可得出樣品的測(cè)序深度情況。Shannon-Wiener曲線[21]使用97%相似度的OTU，利用mothur計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的shannon值，利用R軟件作圖。反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣品的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣品在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。Rank-abundance曲線[22]構(gòu)建方法是統(tǒng)計(jì)單一樣品中，每一個(gè)OTU所含的序列數(shù)，將OTU按豐度(所含有的序列條數(shù))由大到小等級(jí)排序，再以O(shè)TU等級(jí)為橫坐標(biāo)，以每個(gè)OTU中所含的序列數(shù)(也可用OTU中序列數(shù)的相對(duì)百分含量)為縱坐標(biāo)做圖。Rank-abundance曲線可用來(lái)解釋多樣性的兩個(gè)方面，即物種豐度和物種均勻度。在水平方向，物種的豐度由曲線的寬度來(lái)反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀(平滑程度)反映了樣品中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。Specaccum物種累積曲線(species accumulation curves)[23]是用于描述隨著樣品量的加大物種增加的狀況，是調(diào)查樣品的物種組成和預(yù)測(cè)樣品中物種豐度的有效工具，在生物多樣性和群落調(diào)查中，被廣泛用于樣品量是否充分的判斷以及物種豐富度(species richness)的估計(jì)。

1.6 β-多樣性分析(β-diversity analysis)

采用微生態(tài)定量分析流程(quantitative insights into microbial ecology，QIIME)，對(duì)測(cè)序結(jié)構(gòu)進(jìn)行β分析。使用R軟件vegan軟件包進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)并繪圖。PCoA是一種降維排序方法，通過(guò)一系列特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu)[24]?；贐ray_curtis、Weighted Unifrac距離和Unweighted Unifrac 距離分別來(lái)進(jìn)行PCoA分析，并選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖展示。如果樣品距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開(kāi)。

1.7 物種組成分析

采用RDP classifier貝葉斯算法[25]對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個(gè)分類水平：domain(域)，kingdom(界)，phylum(門)，class(綱)，order(目)，family(科)，genus(屬)，species(種)統(tǒng)計(jì)各樣品的群落組成。比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為16S細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)Silva[26]，置信度閾值為0.7。根據(jù)OTU注釋結(jié)果分別在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣品的物種相對(duì)豐度并作圖。

分組聚類熱圖展示總豐度排名靠前的物種在不同分組中的豐度，根據(jù)其在每個(gè)樣品中的豐度信息，對(duì)物種進(jìn)行聚類，繪制成熱圖，便于觀察哪些物種在哪些樣品中聚集較多或含量較低。

1.8 菌群結(jié)構(gòu)差異分析

LEfSE(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=lefse_upload)根據(jù)分類學(xué)組成對(duì)樣本按照不同的分組條件進(jìn)行線型判別分析(LDA)，找出對(duì)樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理使用軟件SPSS 26.0；兩組之間比較使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)[27]，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果

本項(xiàng)目最終納入有效樣品56份，共獲得1 133 017條高質(zhì)量序列。經(jīng)過(guò) Mothur 軟件拼接并除去引物，序列的平均長(zhǎng)度為462 bp，長(zhǎng)度分布在452～470 bp之間。術(shù)前獲得的平均優(yōu)化序列數(shù)為(20 719±292)條，術(shù)后獲得的平均優(yōu)化序列數(shù)為(19 746±513)條，結(jié)果表明術(shù)后與術(shù)前獲得的優(yōu)化序列數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.584,P=0.125)。

2.2 OTU聚類、物種注釋及統(tǒng)計(jì)

通過(guò)16S rRNA-V3區(qū)的深度測(cè)序，經(jīng)97%相似性歸并為術(shù)后與術(shù)前的測(cè)序覆蓋深度(Coverage指數(shù))均>0.99。對(duì)OTU進(jìn)行α-多樣性分析，56個(gè)樣本的平均Reads為17 376；OTU平均值為130。聚類共獲得524個(gè)OTU，歸屬15個(gè)門、27個(gè)綱、46個(gè)目、84個(gè)科、195個(gè)屬。術(shù)前Reads指數(shù)17 274，略低于術(shù)后Reads指數(shù)17 478，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.414,P=0.682)。術(shù)前OTU為145.10±8.70，術(shù)后OTU為114.64±8.18，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.539,P=0.001)(圖1A)。VENN圖(圖1B)顯示，術(shù)前獨(dú)有OTU 78個(gè)，術(shù)后獨(dú)有OTU 58個(gè)，共有OTU 388個(gè)。

2.3 α-多樣性分析(α-Diversity Analysis)

Ace或Chao1越大說(shuō)明菌群豐度越高，術(shù)前、術(shù)后的Ace分別是169.13±9.22和138.34±8.45(P=0.026)，Chao1分別為168.56±9.48和136.44±9.41(P=0.024)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C、1D)。Shannon越大或Simpson越小表明群落多樣性越強(qiáng)，術(shù)前和術(shù)后的Shannon值分別為3.05±0.16和2.53±0.13(P=0.002)，Simpson值分別為0.13±0.03和0.20±0.03(P=0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后群落多樣性顯著低于術(shù)前，見(jiàn)圖1E、1F。

圖1 膽囊炎患者消化內(nèi)鏡下微創(chuàng)保膽治療術(shù)前術(shù)后腸道菌群α多樣性分析 A:實(shí)測(cè)OTU數(shù)；B:VENN圖；C:ACE指數(shù)；D:Chao指數(shù)；E:Shannon指數(shù)；F:Simpson指數(shù)。術(shù)前(紅色)；術(shù)后(藍(lán)色)

圖2A的稀釋性曲線(Rarefaction curve)表明，隨著樣品測(cè)序深度的增加，觀測(cè)物種指數(shù)曲線趨于平緩，說(shuō)明當(dāng)前測(cè)序深度足以發(fā)現(xiàn)各樣本生境中的大部分物種。圖2B的Shannon-Wiener曲線進(jìn)一步表明，隨著隨機(jī)抽取的樣品數(shù)據(jù)量增大，曲線趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。圖2C反映物種豐富度及均勻度的Rank-Abundance曲線可以看出，隨著OTU等級(jí)的增加，曲線愈加平坦并且在橫軸的跨度也越來(lái)越大，說(shuō)明樣品中物種的均勻度和相對(duì)豐度都達(dá)到了很高的水平。圖2D反映了持續(xù)抽樣下新OTU(新物種)出現(xiàn)的速率, 當(dāng)樣品量在1～20，曲線顯示急劇上升趨勢(shì)，當(dāng)樣品量在20～30，曲線仍顯示上升趨勢(shì)，而當(dāng)樣品量大于30，曲線趨于平緩，則表示此環(huán)境中的物種并不會(huì)隨樣品數(shù)的增加而顯著增多，本研究樣品數(shù)為28，樣品數(shù)基本充分，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

圖2 α-多樣性指數(shù)分析 A:稀釋性曲線(Rarefaction curve)；B:Shannon-Wiener曲線；C:Rank-abundance曲線；D:Specaccum物種累積曲線

2.4 β-多樣性分析(β-Diversity Analysis)

主坐標(biāo)分析顯示術(shù)后與術(shù)前區(qū)分良好?；赑CoA_bray_curtis距離：PC1解釋率為42.83%，PC2解釋率為20.11%；基于Unweighted_unifrac距離：PC1解釋率為43.59%，PC2解釋率為15.34%；基于Weighted_unifrac距離： PC1解釋率為81.97%，PC2解釋率為6.33%。均提示微創(chuàng)保膽治療術(shù)前術(shù)后兩個(gè)階段的菌群能顯著分開(kāi)，且同一階段的菌群聚集在一起，說(shuō)明菌群結(jié)構(gòu)有明顯的區(qū)別，微創(chuàng)保膽取石治療圍手術(shù)期腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較明顯的改變(圖3)。

圖3 消化內(nèi)鏡微創(chuàng)保膽治療前后差異菌群主坐標(biāo)分析 A:基于Bray_curtis距離; B:基于Unweighted_unifrac距離; C:基于Weighted_unifrac距離

2.5 物種組成分析

通過(guò)測(cè)序并利用 QIIME生成多樣品物種豐度分布圖(圖4)。整體來(lái)看，所占比例最大的是擬桿菌門，其次是厚壁菌門和變形菌門，然后是放線菌門。以門水平上菌群結(jié)構(gòu)差異為例，優(yōu)勢(shì)物種豐度圖表明，術(shù)前和術(shù)后具有不同的菌群結(jié)構(gòu)特征。術(shù)前擬桿菌門(P=0.023)、厚壁菌門(P=0.006)顯著高出；術(shù)后變形菌門(P=0.002)、放線菌門(P=0.003)顯著高出,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 消化內(nèi)鏡微創(chuàng)保膽治療前后腸道菌群門水平上多樣品物種分布圖

分組聚類熱圖(圖5)顯示優(yōu)勢(shì)物種OTU258(動(dòng)膠菌屬)、OTU408(鏈球菌屬)、OTU167(葡萄球菌屬)等在術(shù)后組中明顯增加；OTU511(擬桿菌屬)、OTU463(副桿菌屬) 、OTU247(考拉桿菌屬) 、OTU162(柔嫩梭菌屬)等在術(shù)后組中明顯減少。

圖5 消化內(nèi)鏡微創(chuàng)保膽治療前后差異關(guān)鍵菌群聚類熱圖

2.6 菌群結(jié)構(gòu)差異分析

由于術(shù)前術(shù)后菌群豐度差異大，繪制LEfSe圖時(shí)將LDA閾值設(shè)定為4.0。LEfSe法計(jì)算出術(shù)前和術(shù)后中的差異菌屬，所有菌在門、綱、目、科、屬水平的差異信息用餅形圖表示，餅形圖藍(lán)色表示在術(shù)前中高出，紅色表示在術(shù)后中高出，最內(nèi)圈表示門水平的差異，依次往外的圈表示綱、目、科、屬；扇形面積表示在此范圍內(nèi)的菌均有差異(圖6A)。柱形圖表示在手術(shù)前后中的差異菌屬信息，藍(lán)色表示在術(shù)前中高出，紅色表示術(shù)后中高出(圖6B)。

在綱的水平：擬桿菌綱、梭菌綱、厚壁菌綱在術(shù)前高出；放線菌綱、芽孢桿菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱在術(shù)后高出；在目的水平：擬桿菌目、梭菌目、硒單胞菌目在術(shù)前高出；芽孢桿菌目、乳桿菌目、根瘤菌目、紅環(huán)菌目在術(shù)后高出；在科水平：擬桿菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科、氨基酸球菌科在術(shù)前高出；葡萄球菌科、腸球菌科、鏈球菌科、生絲微菌科、紅環(huán)菌科在術(shù)后高出；在屬水平：擬桿菌屬、副桿菌屬、丹毒絲菌科未培養(yǎng)屬；考拉桿菌屬在術(shù)前高出；動(dòng)膠菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、鵜鶘桿菌屬在術(shù)后高出。

3 討論

利用高通量測(cè)序技術(shù)研究腸道菌群，能夠克服常規(guī)培養(yǎng)方法的缺陷，發(fā)現(xiàn)低豐度細(xì)菌或未知細(xì)菌，進(jìn)而可全面、準(zhǔn)確地獲得菌群信息。血型、指印、虹膜掃描和DNA條形碼是區(qū)分或識(shí)別人類個(gè)體的幾種方法。根據(jù)Arumugam及其同事的說(shuō)法，可以通過(guò)糞便中的微生物群落，即“腸型”來(lái)區(qū)分；以腸道內(nèi)的細(xì)菌種類和數(shù)量劃分，人類擁有三種腸型：擬桿菌型(bacteroides)、普雷奧氏菌型(prevotella)和瘤胃球菌型(ruminococcus)，用來(lái)反映各生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌[28]。

成人腸道菌群的構(gòu)成是相對(duì)穩(wěn)定的，但也會(huì)受到某些因素影響，如腸道感染、飲食習(xí)慣、抗生素和益生菌的應(yīng)用、手術(shù)、晝夜節(jié)律破壞等[29]。有研究認(rèn)為，膽結(jié)石患者與健康對(duì)照組相比，腸道中屬于變形菌門的細(xì)菌如大腸桿菌、沙門氏菌和螺桿菌屬等水平較高；與此相反，糞桿菌屬、毛螺菌屬、羅斯伯里氏菌屬處于較低水平[30]。本研究表明，患者術(shù)前擬桿菌屬(Bacteroides)型顯著高出。擬桿菌屬(Bacteroides)是指革蘭氏染色陰性、無(wú)芽孢、專性厭氧的小桿菌，能分解葡萄糖、乳糖和蔗糖，與腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收密切相關(guān)[31]，提示患者術(shù)前更多地從碳水化合物和蛋白質(zhì)中獲取能量。而術(shù)后動(dòng)膠菌屬(Zoogloea)顯著高出。動(dòng)膠菌屬(Zoogloea)屬革蘭氏染色陰性，專性好氧，化能異養(yǎng)，是廢水生物處理中的重要細(xì)菌；動(dòng)膠菌屬豐度顯著增加提示經(jīng)NOTES術(shù)治療后患者營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解加速?？傮w來(lái)看，慢性膽囊炎患者經(jīng)NOTES保膽治療，患者已經(jīng)由“?！鞭D(zhuǎn)“機(jī)”；腸道菌群方面，多樣性和豐度顯著下降，處于一個(gè)重建的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，一些耐抗生素的菌群如鏈球菌屬、葡萄球菌屬放線菌屬豐度顯著增加，可能與手術(shù)過(guò)程抗生素的使用有關(guān)；值得關(guān)注的是，一些低豐度菌屬如噬膽菌屬明顯減少，推測(cè)術(shù)后膽囊膽汁淤積消除，腸道膽汁酸代謝恢復(fù)正常。

本研究樣本數(shù)量相對(duì)較小，屬單中心研究，是為不足之處。在條件允許的情況下，后期將加大樣本量，進(jìn)行多中心隨機(jī)對(duì)照研究以充實(shí)本文結(jié)果。此外，后期也將密切關(guān)注患者術(shù)后三年以上的膽囊結(jié)石或息肉的復(fù)發(fā)率，以及膽囊結(jié)石或息肉復(fù)發(fā)與腸道菌群和膽汁酸譜變化之間的聯(lián)系。

致謝：作者們感謝西京消化病醫(yī)院聶勇戰(zhàn)教授、孫麗娟博士在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文修改過(guò)程所提供的寶貴意見(jiàn)！