川紅花與新疆紅花對大鼠軟組織損傷的影響

唐軍，李剛敏，孫晨，陳銀，邵茂，姜治樺，陳瑤，謝曉芳，彭成

(西南特色中藥資源國家重點實驗室/成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 成都 611130)

紅花，又名紅藍(lán)花、刺紅花，為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，夏季花由黃變紅采摘，陰干或曬干制成成品，功效為活血通經(jīng)，散瘀止痛，用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、惡露不行、疤痕痞塊、胸痹心痛、瘀滯腹痛、胸脅刺痛、跌撲損傷、瘡癰腫痛[1]。我國的藥用紅花曾以四川簡陽“川紅花”和河南“懷紅花”最為出名，現(xiàn)在紅花的主產(chǎn)區(qū)則主要是新疆、云南、甘肅一帶，新疆現(xiàn)在是我國最大的紅花產(chǎn)地，產(chǎn)量占據(jù)了全國產(chǎn)量的80%以上[2]。本文通過單味藥評價藥效的方式，比較原紅花主產(chǎn)地(四川簡陽)和當(dāng)下紅花主產(chǎn)地(新疆昌吉)所制紅花酊對大鼠軟組織損傷的治療效果，評價兩個產(chǎn)地紅花的藥效，從而為紅花的道地性研究提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，購于四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SCXK(川)2018-19。

1.1.2 實驗藥品 收集四川簡陽和新疆昌吉人工栽培的紅花，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥種質(zhì)資源庫陳江副教授鑒定為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花。制備高、低劑量的紅花酊：將簡陽、昌吉紅花分別稱80 g、40 g用紗布包裹，用400 mL 60%乙醇浸泡于4個密閉容器中，紅花全部淹沒，靜置一周后過濾，所得濾液即為對應(yīng)簡陽、昌吉產(chǎn)地的高、低劑量紅花酊。云南白藥酊(云南省昆明市呈貢新區(qū)云南白藥集團股份有限公司，批號：ZMC1801)。

1.1.3 實驗試劑 95%乙醇，0.9%生理鹽水，2%戊巴比妥鈉溶液，4%多聚甲醛(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號：2020112601)，TNF-α試劑盒(Elabscience，批號：E-EL-R2856c)，IL-10試劑盒(上海瑞番生物科技有限公司，批號：MM-0195R1)。

1.1.4 實驗儀器 高速冷凍離心機(Beckman Coulter,型號：Allegra X-30R)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司，型號：DHG-9030A)中，高級多功能酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，型號：VARIOSKA)，血液流變儀(北京賽科希德科技股份有限公司，型號：SA-9000)。

2 實驗方法

2.1 造模方法

將49只大鼠按體重隨機分為正常對照組、模型對照組、云南白藥酊組、簡陽紅花高、低劑量組(JY 0.2 g/mL、JY 0.1 g/mL)、昌吉紅花高、低劑量組(CJ 0.2 g/mL、CJ 0.1 g/mL)，每組7只。造模時，大鼠以50 mg/kg腹腔注射2%的戊巴比妥鈉溶液麻醉后，將左邊臀部及左下肢毛發(fā)用動物剃毛器清除，然后俯臥位固定，在左下肢大腿處墊上紗布，在該大腿上方垂直豎立一根45 cm長管道，將200 g砝碼從管道上端口放入，使其自由落體砸在大鼠左大腿肌肉豐厚處，重復(fù)6次，觀察造模部位出現(xiàn)瘀斑并明顯腫脹即造模成功，若造模時有皮膚破損或出血，明顯骨折等情況，則淘汰。

2.2 治療方法

造模1 h后開始給藥，蘸取藥液涂抹患處，0.5mL/次，3次/d，連續(xù)4 d。簡陽、昌吉紅花高低劑量組給對應(yīng)濃度的紅花酊，云南白藥組給云南白藥酊，模型組給0.9%生理鹽水。

2.3 指標(biāo)檢測

在末次給藥24 h后，將大鼠麻醉，腹主動脈取血制備抗凝血，進行血流變學(xué)檢測。另取未抗凝血2 mL，制備血清，在4℃，離心力746×g條件下離心15 min制備血清，ELISA法檢測血清中的TNF-α和IL-10水平；處死大鼠，在固定位置取大鼠損傷部位肌肉組織，肉眼觀察后，將其浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定，HE染色行病理組織學(xué)觀察。

2.4 統(tǒng)計方法

3 實驗結(jié)果

3.1 對大鼠血液流變學(xué)的影響

與正常組相比，在6個不同的切變率下，模型組的全血粘度升高，紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，昌吉紅花高、低劑量組，云南白藥組的全血黏度均降低，昌吉紅花高劑量組、云南白藥組紅細(xì)胞聚集指數(shù)降低，昌吉紅花低劑量組卡松黏度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)如表 1所示。

表1 大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)

3.2 對大鼠血清炎癥因子的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清TNF-α水平、IL-10水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表示造模成功，與模型組相比較，簡陽紅花高劑量、昌吉紅花高劑量、昌吉紅花低劑量、云南白藥組TNF-α水平降低，昌吉紅花作用最強；云南白藥組、簡陽紅花低劑量組、昌吉紅花高劑量組IL-10水平降低，簡陽紅花低劑量組作用最強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且如表 2所示。

表2 大鼠血清炎癥因子

3.3 對大鼠損傷軟組織形態(tài)學(xué)的影響

造模后大鼠腿部肌肉細(xì)胞形態(tài)異常，肌間明顯水腫增寬、大量炎癥細(xì)胞(以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主)浸潤，有明顯出血；與模型組比較，各給藥組組織未見明顯出血，且炎性細(xì)胞浸潤減輕，組織間隙的水腫有所減輕，呈現(xiàn)較好的量-效正相關(guān)。

4 討論

軟組織損傷是由各種急性或者慢性勞損以及自身疾病等原因?qū)е碌娜梭w皮膚、皮下筋膜、肌肉、韌帶、肌腱、關(guān)節(jié)囊及周圍神經(jīng)血管組織的病理損害。臨床主要表現(xiàn)為局部組織的青紫、瘀斑、腫脹、疼痛[3]。軟組織損傷在中醫(yī)學(xué)屬傷筋范疇，主要病機為血瘀氣滯，脈絡(luò)不和，治療當(dāng)以活血化瘀、消腫止痛為主[4]。急性軟組織損傷處常因出血、局部組織缺血或缺氧導(dǎo)致無菌性炎癥反應(yīng)，激發(fā)炎癥介質(zhì)和促進炎癥細(xì)胞因子的釋放，引起血管壁通透性改變和血管收縮，組織液在組織間隙大量聚集，從而引起水腫、疼痛，毛細(xì)血管的破裂也會導(dǎo)致皮膚下出現(xiàn)青紫和瘀斑。

急性軟組織損傷的治療主要包括外治和內(nèi)治，內(nèi)治中西醫(yī)主要口服非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥，如阿司匹林、吲哚美辛腸溶片等，這類藥物通過抑制環(huán)氧合酶的活性，干擾花生四烯酸的代謝，從而阻斷前列腺素的生成[5-6]。這類藥也做成外用制劑使用，如吲哚美辛巴布膏、吲哚美辛凝膠等。中醫(yī)藥治療軟組織損傷有獨特優(yōu)勢，可采用中藥、《黃帝內(nèi)經(jīng)》，發(fā)展至今有敷貼、薰洗、濕敷、搽擦等不同方法，酊劑、酒劑是常用制劑[7]。此方針灸推拿和聯(lián)合療法等。中藥外治法最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，發(fā)展至今有敷貼、薰洗、濕敷、搽擦等不同方法，酊劑、酒劑是常用制劑[7]。此方法具有療效顯著、治療方便、毒副作用小等優(yōu)點，在日常的軟組織損傷治療中得到廣泛應(yīng)用。

圖1 急性軟組織損傷大鼠局部軟組織形態(tài)學(xué)HE染色圖(40×，Bar=200 μm)

TNF-α是促炎癥因子，在中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的活化和趨化，黏附分子的表達(dá)等炎癥反應(yīng)中起重要作用[8]。可由激活的巨噬細(xì)胞、突觸成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生[9]，能促進IL-1、IL-6等的產(chǎn)生，擴大炎癥反應(yīng)，誘發(fā)機體產(chǎn)生超氧化物，釋放出溶酶體而損傷細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)[10]；造模后血清TNF-α顯著上升，給藥后血清TNF-α水平出現(xiàn)明顯下降，且昌吉紅花酊對TNF-α的降低有更顯著的療效。

IL-10主要由激活的單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞等產(chǎn)生，是機體內(nèi)重要的抑炎癥因子[11]。IL-10具有多項免疫調(diào)節(jié)功能，能抑制Th0、Th1、TH2等多種T細(xì)胞的分泌功能，減少使白細(xì)胞聚集的炎性因子和細(xì)胞黏附分子的產(chǎn)生，阻止炎癥細(xì)胞的活化和聚集，還能抑制巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞活化功能，從而直接或間接抑制炎癥反應(yīng)[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組IL-10水平比空白組高，分析是機體應(yīng)對急性軟組織損傷時產(chǎn)生大量促炎癥因子所產(chǎn)生的代償反應(yīng)[13]，通過增加IL-10的釋放來減輕炎癥反應(yīng)；給藥組因給予紅花酊劑后炎癥減輕，從而代償性升高的IL-10水平降低。

血液流變性是研究血液、血細(xì)胞、血漿的流動性和變形性以及這種特性對循環(huán)和全身功能代謝的影響。全血黏度是血液流變性的綜合反映，全血黏度增高表示血液流變性質(zhì)異常，組織血液灌流障礙[14]。軟組織損傷后，炎性物質(zhì)釋放導(dǎo)致微循環(huán)障礙，毛細(xì)血管通透性增加，導(dǎo)致血流減慢，瘀阻，纖維蛋白原含量增高，血細(xì)胞電泳時間延長，血漿黏度和全血黏度增高[15]。本實驗中，不同切變率下的全血黏度給藥組均小于模型組，表示紅花酊外用可降低急性炎癥引起的血液黏度，從實驗結(jié)果看昌吉紅花比簡陽紅花作用更強；HE病理檢測結(jié)果表明，紅花酊劑可減輕急性損傷部位軟組織的炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞間隙水腫，以昌吉紅花效果略好。

本實驗顯示，昌吉紅花對軟組織損傷的治療作用較優(yōu)。紅花中化學(xué)成分主要包括黃酮類、生物堿類、聚炔類、木脂素類、有機酸類、烷基二醇類以及甾體類等化合物[16]，研究表明，紅花活血化瘀功效的主要有效物質(zhì)之一是羥基紅花黃色素A(HSYA)，是藥用紅花中起效作用最強的水溶性成分[17]。董文彬等[18]采用大鼠心肌缺血及血瘀模型進行研究，發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A能明顯減少心肌缺血大鼠的心肌梗死面積，顯著減少血清肌酸激酶MB型(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)的產(chǎn)生，抑制二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集，降低心肌缺血大鼠的血液黏度，還可一定程度延長血漿凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血活酶時間(APTT)，顯著降低大鼠血漿纖維蛋白原含量。HSYA可顯著改善血液流變學(xué)指標(biāo)，如全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞變形性和聚集性，但對紅細(xì)胞壓積無明顯影響，其作用機制可能與其抑制血栓形成、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)前列環(huán)素/血栓素(PGI2/TXA2)及改變血液流變學(xué)有關(guān)[19]。宋玉龍等[20]通過對不同產(chǎn)地的紅花質(zhì)量分析研究發(fā)現(xiàn)，伊犁、塔城、昌吉地區(qū)紅花的羥基紅花黃色素A含量較大為1.55%～2.32%，新疆和田、四川、云南地區(qū)紅花的羥基紅花黃色素A含量較小為1.08%～1.68%。徐山[21]研究發(fā)現(xiàn)，新疆紅花中羥基紅花黃色素A含量均值規(guī)律為昌吉州(2.42%)>塔城地區(qū)(2.18%)>伊犁地區(qū)(1.92%)，提示這可能是昌吉紅花酊劑對急性軟組織損傷大鼠的血流變和炎癥因子的改善作用優(yōu)于四川紅花的原因之一。