腐殖酸鈉對(duì)腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌K88感染小鼠腸道損傷的保護(hù)作用

王 棟 何炎峻 柳可欣 鄧守翔 黃思琪 劉 云

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)是一類廣泛存在于自然界，并能引起人和動(dòng)物共同感染的重要人獸共患病病原[1]。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)K88是ETEC最常見(jiàn)的血清型，可導(dǎo)致新生兒和幼小動(dòng)物的腸道疾病和腹瀉[2]。腸道屏障在保護(hù)腸道免受病原微生物的侵襲和維持腸道穩(wěn)態(tài)方面具有重要的作用[3]。ETEC通過(guò)定殖于腸道上皮細(xì)胞分泌腸毒素破壞腸道屏障功能，增加腸道通透性和引起炎癥反應(yīng)，最終誘發(fā)炎癥性腸病[4]。此外，在畜牧生產(chǎn)中，大腸桿菌感染會(huì)降低動(dòng)物體重增加的速度和效率，增加死亡率，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。長(zhǎng)期以來(lái)抗生素被廣泛用于預(yù)防和治療大腸桿菌感染，然而，日益增長(zhǎng)的抗生素耐藥性和負(fù)面的公共衛(wèi)生后果引起了全世界的關(guān)注[6]。此外，我國(guó)也已經(jīng)全面停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑的商品飼糧。因此，尋找天然的抗生素替代品成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

腐殖酸(humic acids，HAs)是由泥炭和腐泥中腐爛的有機(jī)物分解轉(zhuǎn)化而成，含有羧基、酚基、酮基等活性基團(tuán)，具有多種藥理特性[7]。作為HAs的鈉鹽，腐殖酸鈉(sodium humate,HNa)在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史。HNa是一種有效的抗菌、抗炎、止瀉、止血和免疫調(diào)節(jié)的藥物，已被用作動(dòng)物消化不良、腹瀉和急性中毒的治療[8]。體內(nèi)外的毒理學(xué)研究均表明，適當(dāng)劑量的HAs無(wú)毒副作用[9]。研究表明，飼糧中添加HNa可有效降低ETEC感染仔豬腸道中大腸桿菌的黏附和定植，表明其具有潛在的抗菌活性[10]。對(duì)斷奶仔豬的研究表明，飼糧中添加HNa可以通過(guò)激活免疫系統(tǒng)和降低炎癥反應(yīng)緩解斷奶對(duì)仔豬造成的損傷[11]。此外，本實(shí)驗(yàn)室前期的研究也表明，HNa在體外能有效抑制大腸桿菌的增殖[12]。以上結(jié)果為HNa對(duì)動(dòng)物大腸桿菌感染的保護(hù)作用提供了證據(jù)。然而，HNa對(duì)ETEC K88感染引起腸道損傷的保護(hù)作用和相關(guān)機(jī)制尚待研究。因此，本研究旨在通過(guò)檢測(cè)腸道形態(tài)、腸道屏障、腸道組織炎性小體和大腸桿菌定植等，探究HNa能否緩解ETEC K88感染引起的小鼠腸道損傷，并揭示其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

選取無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)4周齡雌性昆明小鼠30只，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物有限公司，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)管理，飼養(yǎng)溫度22～24 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，室內(nèi)光照12 h/12 h晝夜交替，自由采食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

HNa(純度75%)由中國(guó)科學(xué)院山西煤炭化學(xué)研究所提供，成分包括75.00%的HAs(干物質(zhì)基礎(chǔ))、20.52%的燃燒殘?jiān)?干物質(zhì)基礎(chǔ))、14.22%的水(風(fēng)干基礎(chǔ))和4.48%的水溶性物質(zhì)(干物質(zhì)基礎(chǔ))。主要試劑包括總RNA提取試劑盒(Promega公司，美國(guó))，蘇木精-伊紅(HE)染液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(大連TaKaRa公司)，RIPA裂解液、生物素標(biāo)記兔抗鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、半胱天冬蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma/leukaemia-2-associated X protein，Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia-2，Bcl-2)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司)。閉合蛋白(Occludin)、封閉蛋白-1(Claudin-1)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens protein-1，ZO-1)、上皮型鈣黏蛋白(epithelial cadherin，E-cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、黏蛋白-2(mucin-2，MUC-2)和白細(xì)胞介素-18(interleukin-18，IL-18)抗體(北京優(yōu)維寧生物科技有限公司)。

ETEC K88由本實(shí)驗(yàn)室保存。將ETEC K88接種于LB培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)8 h，5 000×g離心10 min。將收集的菌體用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，之后，用PBS將菌體稀釋到5×1010CFU/mL。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將30只健康小鼠隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、模型組(ETEC組)和腐殖酸鈉干預(yù)組(ETEC+HNa組)，每組10只。參照Yu等[2]的方法進(jìn)行大腸桿菌感染小鼠腸炎模型的建立。試驗(yàn)第1～7天，對(duì)照組和ETEC組小鼠每天灌胃0.2 mL生理鹽水，ETEC+HNa組小鼠每天灌胃0.2 mL 5% HNa；試驗(yàn)第8天，ETEC和ETEC+HNa組小鼠灌胃0.2 mL 5×1010CFU/mL ETEC K88，對(duì)照組小鼠灌胃0.2 mL生理鹽水；試驗(yàn)第9～10天，ETEC+HNa組小鼠每天灌胃0.2 mL 5% HNa，對(duì)照組和ETEC組小鼠每天灌胃0.2 mL生理鹽水。試驗(yàn)期10 d。HNa濃度參考本課題組前期的研究結(jié)果[12]。ETEC K88感染前小鼠禁食12 h，禁水4 h，ETEC K88感染前1 h，小鼠腹腔注射西咪替丁(50 mg/kg)以減少胃酸對(duì)細(xì)菌的影響。ETEC K88感染前和試驗(yàn)結(jié)束后分別對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，分析ETEC K88感染對(duì)小鼠體重的影響。

1.3 樣品采集與指標(biāo)檢測(cè)

小鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢采血，經(jīng)異氟醚麻醉后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，無(wú)菌打開(kāi)腹腔，收集直腸糞便，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。分離空腸組織，用預(yù)冷的PBS進(jìn)行沖洗，一部分置于4%多聚甲醛中固定，一部分放入凍存管，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.1 病理組織學(xué)觀察

空腸組織預(yù)固定后，進(jìn)行乙醇梯度脫水，二甲苯透明和石蠟包埋，制備3～5 μm切片，進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，采用病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照和分析。

1.3.2 血液細(xì)胞計(jì)數(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)

將采集的血液一部分置于含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管，采用全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀(BC-5300，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)進(jìn)行血液白細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的計(jì)數(shù)；一部分置于不含抗凝劑的離心管，經(jīng)離心后收集血清；采用ELISA法進(jìn)行血清白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸(D-Lac)含量檢測(cè)，試劑盒購(gòu)于江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)

各試驗(yàn)組隨機(jī)選取6只小鼠的空腸組織用于mRNA檢測(cè)。采用總RNA提取試劑盒提取RNA，根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的cDNA用于qPCR檢測(cè)空腸組織Occludin、Claudin-1、ZO-1、E-cadherin、β-catenin和MUC-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量。qPCR引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為：含酶混合物5.0 μL，ROX液0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH2O 3.4 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，β-actin為內(nèi)參基因。

表1 qPCR引物序列

1.3.4 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)

稱取50 mg小鼠空腸組織，使用RIPA裂解液提取空腸組織蛋白，采用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，將蛋白樣品中比例加入PAGE loading buffer，混勻后煮沸，使蛋白變性。制備分離膠和濃縮膠，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)模、封閉、孵育一抗、孵育二抗和化學(xué)自發(fā)光等操作對(duì)空腸Occludin、Claudin-1、ZO-1、E-cadherin、β-catenin、MUC-2、Bax、Bcl-2、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.3.5 糞便微生物菌群檢測(cè)

采用qPCR法檢測(cè)小鼠直腸糞便中微生物菌群的組成。具體操作參考Sabat等[13]的方法。采用TIANamp Stool DNA Kit試劑盒提取直腸內(nèi)容物總細(xì)菌DNA，并檢測(cè)DNA的濃度和純度。將提取的總細(xì)菌DNA分別和不同濃度大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸菌的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行qPCR檢測(cè)，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度和Ct值做回歸分析，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將樣品Ct值帶入回歸方程計(jì)算目標(biāo)菌屬DNA拷貝數(shù)，結(jié)果用每克內(nèi)容物中細(xì)菌拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)[lg(拷貝數(shù)/g)]表示。微生物的特異性引物序列見(jiàn)表2。

表2 微生物的特異性引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行初步整理，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著時(shí)以LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HNa對(duì)ETEC K88感染小鼠體重的影響

如圖1所示，大腸桿菌ETET K88感染后，與對(duì)照組相比，ETEC組小鼠體重顯著降低(P<0.05)。與ETEC組相比，ETEC+HNa組體重顯著升高(P<0.05)，表明HNa干預(yù)緩解了ETEC K88感染引起的體重下降，促進(jìn)了小鼠體重的恢復(fù)。

Control：對(duì)照組；ETEC：ETEC組；ETEC+HNa：ETEC+HNa組。數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 HNa對(duì)ETEC K88感染小鼠腸道形態(tài)的影響

如圖2所示，ETEC K88感染后，ETEC組空腸絨毛有一定的損傷，表現(xiàn)為絨毛縮短和斷裂。與病理組織學(xué)觀察一致，與對(duì)照組相比，ETEC組空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度顯著降低(P<0.05)；與ETEC組相比，ETEC+HNa組空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度顯著升高(P<0.05)，表明HNa干預(yù)緩解了空腸絨毛的損傷。

圖2 HNa對(duì)ETEC K88感染小鼠腸道形態(tài)的影響

2.3 HNa對(duì)ETEC K88感染小鼠炎癥因子的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，ETEC組血液白細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞數(shù)量及血清IL-6、TNF-α、DAO、D-Lac含量顯著增加(P<0.05)，血清IL-4和IL-10含量顯著降低(P<0.05)。與ETEC組相比，ETEC+HNa組血液白細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞數(shù)量及血清IL-6、TNF-α、DAO、D-Lac含量顯著降低(P<0.05)，血清IL-4和IL-10含量顯著增加(P<0.05)，表明HNa干預(yù)降低了小鼠血清炎癥相關(guān)因子含量，增加了小鼠血清抗炎因子含量。

2.4 HNa對(duì)ETEC K88感染小鼠腸道屏障的影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比，ETEC組空腸Occludin、Claudin-1、E-cadherin和MUC-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，空腸Claudin-1、ZO-1、E-cadherin、β-catenin和MUC-2的蛋白表達(dá)量也顯著降低(P<0.05)。與ETEC組相比，ETEC+HNa組空腸Occludin、Claudin-1、E-cadherin和MUC-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，空腸Claudin-1、ZO-1、E-cadherin和MUC-2的蛋白表達(dá)量也顯著升高(P<0.05)，表明HNa干預(yù)上調(diào)了部分緊密連接和黏附連接的mRNA和蛋白表達(dá)，對(duì)ETEC K88感染引起的腸道屏障損傷具有保護(hù)作用。

Occludin：閉合蛋白；Claudin-1：封閉蛋白-1；ZO-1：閉鎖小帶蛋白-1 zonula occludens protein-1；E-cadherin：上皮型鈣黏蛋白 epithelial cadherin；β-catenin：β-連環(huán)蛋白；MUC-2：黏蛋白-2 mucin-2；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白；ETEC：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌 enterotoxigenic Escherichia coli；HNa：腐殖酸鈉 sodium humate。

2.5 HNa對(duì)ETEC K88感染小鼠腸道上皮細(xì)胞凋亡的影響

由圖5可知，與對(duì)照組相比，ETEC組空腸促細(xì)胞凋亡蛋白Bax的蛋白表達(dá)量和Bax/Bcl-2顯著增加(P<0.05)，空腸抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與ETEC組相比，ETEC+HNa組空腸Bax的蛋白表達(dá)量和Bax/Bcl-2顯著降低(P<0.05)，空腸Bcl-2的蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，說(shuō)明HNa干預(yù)逆轉(zhuǎn)了小鼠腸道上皮細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)。

Bax：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白 B-cell lymphoma/leukaemia-2-associated X protein；Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 B-cell lymphoma/leukaemia-2；β-肌動(dòng)蛋白；ETEC：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌 enterotoxigenic Escherichia coli；HNa：腐殖酸鈉 sodium humate。

2.6 HNa對(duì)ETEC K88感染小鼠腸道NLRP3炎性小體的影響

為了探究HNa對(duì)ETEC K88感染小鼠腸道的保護(hù)作用是否通過(guò)下調(diào)NLRP3炎性小體實(shí)現(xiàn)，檢測(cè)了空腸NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白的表達(dá)。由圖6可知，與對(duì)照組相比，ETEC組空腸NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。與ETEC組相比，ETEC+HNa組空腸NF-κB、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，表明HNa干預(yù)抑制了ETEC K88感染對(duì)空腸NLRP3炎性小體的激活。

NF-κB：核因子-κB nuclear factor kappa B；NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3；ASC：凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白 apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD；Caspase-1：半胱天冬蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β interleukin-1β；IL-18：白細(xì)胞介素-18 interleukin-18；β-肌動(dòng)蛋白；ETEC：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌 enterotoxigenic Escherichia coli；HNa：腐殖酸鈉 sodium humate。

2.7 HNa對(duì)ETEC K88感染小鼠糞便微生物菌群的影響

由圖7可知，與對(duì)照組相比，ETEC組糞便大腸桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)，而乳酸菌數(shù)量則顯著降低(P<0.05)。與ETEC組相比，ETEC+HNa組糞便大腸桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)，表明HNa干預(yù)降低了小鼠腸道大腸桿菌的增殖。

圖7 HNa對(duì)ETEC K88感染小鼠糞便微生物菌群的影響

3 討 論

ETEC是一種常見(jiàn)的環(huán)境病原體，可導(dǎo)致新生兒和幼畜急性水樣腹瀉，并伴有發(fā)燒、嘔吐和脫水[16]。研究表明，大腸桿菌感染是導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)性能降低和死亡率升高的主要原因之一[5]。因此，在本研究中，我們探究了HNa對(duì)ETEC K88感染小鼠的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。本研究的結(jié)果表明，ETEC K88感染會(huì)引起小鼠體重的顯著下降，而HNa干預(yù)則緩解了小鼠體重下降的這一趨勢(shì)。完整的腸道結(jié)構(gòu)對(duì)于維持腸道屏障功能至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染后通過(guò)黏附素定殖于腸道上皮細(xì)胞進(jìn)行繁殖并分泌腸毒素，破壞腸道結(jié)構(gòu)，引起腸道絨毛的萎縮和斷裂[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，ETEC K88感染后小鼠空腸絨毛稀疏、萎縮和斷裂，此外，空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度也顯著降低。這表明ETEC K88感染導(dǎo)致了嚴(yán)重的腸道損傷。HNa干預(yù)則有效緩解了ETEC K88感染引起的小鼠腸道結(jié)構(gòu)的損傷。Yasar等[18]研究也表明，喂服HAs可以通過(guò)提高大鼠回腸絨毛高度和降低隱窩深度改善腸道形態(tài)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高生長(zhǎng)性能。為了進(jìn)一步探究HNa對(duì)腸道的保護(hù)作用，我們分析了腸道上皮細(xì)胞緊密連接、黏附連接和MUC-2的mRNA和蛋白表達(dá)。

腸道屏障是抵御病原體和毒素侵襲的重要功能性屏障，緊密連接、黏附連接和黏蛋白是腸道屏障的重要組成部分，腸道緊密連接主要包括Claudin-1、ZO-1和Occludin，黏附連接主要包括E-cadherin和β-catenin[19]。之前的研究表明，大腸桿菌黏附于腸道上皮細(xì)胞會(huì)損傷腸道黏液層，降低緊密連接和黏附連接的蛋白表達(dá)，破壞黏膜屏障結(jié)構(gòu)，增加腸道通透性[4]。與之前的研究一致，本研究結(jié)果表明，ETEC K88感染顯著下調(diào)了小鼠空腸Occludin、Claudin-1、E-cadherin和MUC-2的mRNA和蛋白表達(dá)。血清DAO和D-Lac是腸上皮細(xì)胞成熟、完整和功能狀態(tài)的重要標(biāo)志物，其在血清中的含量與腸道通透性呈正相關(guān)[20]。因此，我們進(jìn)一步檢測(cè)了血清DAO和D-Lac含量，結(jié)果表明，ETEC組小鼠血清DAO和D-Lac含量顯著高于其他各組。研究發(fā)現(xiàn)，HNa能通過(guò)增加腹瀉仔豬空腸緊密連接蛋白的表達(dá)，改善腸道屏障功能，進(jìn)而降低腹瀉率[21]。對(duì)斷奶仔豬[10]的研究也表明，飼糧中添加HNa可降低血清DAO和D-Lac含量，增加腸道屏障功能，降低腸道通透性，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，以上的研究均表明HNa可以有效緩解ETEC K88感染引起的小鼠腸道屏障結(jié)構(gòu)的損傷。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，ETEC釋放的腸毒素會(huì)引起腸道上皮細(xì)胞凋亡[16]。我們通過(guò)分析促細(xì)胞凋亡蛋白Bax和抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)進(jìn)一步探究了HNa能否緩解ETEC K88感染引起的腸道上皮細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明，HNa顯著下調(diào)了Bax和上調(diào)了Bcl-2的蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了HNa可以通過(guò)上調(diào)腸道緊密連接和黏附連接相關(guān)蛋白的表達(dá)以及抑制腸道上皮細(xì)胞凋亡來(lái)改善ETEC K88感染引起的小鼠腸道屏障的損傷。

ETEC K88黏附于腸道黏膜會(huì)激活免疫細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22]。促炎因子如IL-6和TNF-α是響應(yīng)ETEC K88感染的重要指標(biāo)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，ETEC K88感染顯著增加了小鼠血液白細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量和血清IL-6、TNF-α含量。炎性小體主要由模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)、Caspase-1和ASC組成，是參與天然免疫反應(yīng)的多蛋白復(fù)合物[24]。NLRP3炎性小體是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLR)家族中具有代表性的炎性小體，在細(xì)胞監(jiān)視、防御、識(shí)別病原體和炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[25]。NLRP3炎性小體的活化依賴雙信號(hào)模式：1)啟動(dòng)信號(hào)，NLRP3炎性小體受Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑或某些細(xì)胞因子被刺激后，通過(guò)NF-κB通路啟動(dòng)NLRP3和白細(xì)胞介素-1β前體(pro-IL-1β)等前體蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；2)激活信號(hào)，病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和宿主來(lái)源的危險(xiǎn)信號(hào)分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)參與介導(dǎo)，推動(dòng)NLRP3炎性小體的組成和激活，當(dāng)NLRP3被激活后，可以將Caspase-1裂解為有活性的Caspase-1，活化的Caspase-1將白細(xì)胞介素前體如pro-IL-1β、白細(xì)胞介素-18前體(pro-IL-18)等進(jìn)行分解剪切，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的成熟和分泌，從而引起炎癥反應(yīng)[26-27]。研究表明，大腸桿菌黏附于腸黏膜可以直接或者通過(guò)NF-κB信號(hào)通路間接激活NLRP3炎性小體，引起腸道炎癥反應(yīng)[28]。本研究的結(jié)果表明，ETEC K88感染通過(guò)上調(diào)NF-κB的蛋白表達(dá)激活了NLRP3炎性小體，增加了促炎因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌，加劇了腸道炎癥反應(yīng)。Brandts等[29]對(duì)歐洲鱸魚(yú)的研究發(fā)現(xiàn)，HNa具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的特性，推測(cè)可能與其富含酚羥基、羧基、巰基和羰基等活性基團(tuán)有關(guān)。本研究也表明，HNa有效抑制了NLRP3炎性小體的激活，降低了促炎因子IL-1β的分泌，增加了抗炎因子IL-4和IL-10的分泌。因此，我們推測(cè)HNa緩解腸道損傷的機(jī)制與其抑制腸道組織炎性小體的激活和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

穩(wěn)定的腸道微生物群在維持腸道健康、調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答、保護(hù)宿主免受病原體侵害等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[30]。大腸桿菌感染可擾亂腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)，破壞腸道微環(huán)境[6]。研究表明，HNa會(huì)通過(guò)改變大腸桿菌細(xì)胞膜通透性、抑制對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分裂、使細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)空泡等抑制大腸桿菌生長(zhǎng)[31]。研究表明，飼糧中添加HNa降低了大腸桿菌感染仔豬的腹瀉率和死亡率，改變了腸道微生物組成，降低了腸道致病性大腸桿菌的豐度，增加了乳酸菌的豐度[10]。對(duì)肉仔雞的研究也表明，飼糧中添加腐殖質(zhì)增加了腸道有益菌群的豐度，減少了腸道寄生蟲(chóng)的增殖[32]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HNa對(duì)大腸桿菌的抑制作用，我們分析了各組小鼠糞便中大腸桿菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)ETEC+HNa組小鼠糞便大腸桿菌數(shù)量顯著低于ETEC組，表明HNa有效抑制了大腸桿菌的增殖。由于HNa具有很強(qiáng)的吸附能力，因此，除了抑制大腸桿菌增殖外還可以有效吸附大腸桿菌產(chǎn)生的毒素，減輕腸道損傷。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，HNa可以通過(guò)抑制腸道組織炎性小體的激活、腸道上皮細(xì)胞凋亡、大腸桿菌定殖以及上調(diào)腸道緊密連接、黏附連接和MUC-2的mRNA和蛋白表達(dá)等途徑緩解ETEC K88感染引起的小鼠腸道損傷。