塞來昔布對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥的保護(hù)機(jī)制研究

王 彧，阿尖措，王德元

(青海紅十字醫(yī)院骨科二病區(qū)，青海 西寧 810000)

骨重塑是由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收所形成的動(dòng)態(tài)平衡[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是一種與衰老有關(guān)的常見病，主要發(fā)生于絕經(jīng)后婦女，由于雌激素缺乏導(dǎo)致骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)變化，易出現(xiàn)病理性骨折，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。針對(duì)骨吸收和骨形成介導(dǎo)的骨重塑是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的重要策略。目前，臨床上抑制骨吸收的藥物主要有雌激素、二膦酸鹽、降鈣素等，但這些藥物通常具有潛在的副作用，對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療并不理想，故臨床迫切需要尋找新的治療藥物[3-4]。

破骨細(xì)胞是一種造血干細(xì)胞/多核巨細(xì)胞的單核細(xì)胞，其刺激和分化主要由核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)的受體激活劑調(diào)節(jié)。RANKL主要通過各種信號(hào)通路(如NF-κB、AKT、MAPK和JNK)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，是一種調(diào)節(jié)骨代謝的重要細(xì)胞因子[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，活化T-細(xì)胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)是RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[7]。NFATc1可以誘導(dǎo)與破骨細(xì)胞分化有關(guān)的各種基因的轉(zhuǎn)錄，如組織蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRACP)和降鈣素受體(calcitonin receptor，CTR)等[7]。

塞來昔布是一種高度選擇性的環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制劑，可通過減少前列腺素的形成來發(fā)揮抗炎和鎮(zhèn)痛作用[8]。塞來昔布是唯一獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的COX-2抑制劑，臨床用于緩解骨關(guān)節(jié)炎和成人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的癥狀和體征，或治療成人急性疼痛。有研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布灌胃可以調(diào)節(jié)大鼠骨代謝穩(wěn)態(tài)[9]。但塞來昔布對(duì)骨代謝調(diào)節(jié)的具體作用和機(jī)制尚不清楚，因此，本研究探討塞來昔布對(duì)骨代謝穩(wěn)態(tài)的影響及其對(duì)骨質(zhì)疏松癥的保護(hù)作用，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑、細(xì)胞與動(dòng)物

塞來昔布購自湖北鑫潤德化工有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、α-極限必需培養(yǎng)基(α-minimum essential medium，α-MEM)均購自美國Hyclone公司；巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)購自美國Sigma公司；p-NF-κB、NF-κB、活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T-cells，NFAT)、GAPDH和辣根素過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記抗兔抗體均購自美國CST公司。RAW264.7和MC3T3-E1細(xì)胞均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，并培養(yǎng)于含10%FBS和100 U/mL青霉素/鏈霉素的α-MEM中。SPF級(jí)雌性C57BL/6J小鼠[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(青)2021-0003]30只，購自青海省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20210318086)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages，BMDM)分離于C57BL/6小鼠的股骨和脛骨骨髓，培養(yǎng)于α-MEM(含10%FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素/鏈霉素)中，并添加M-CSF。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

將BMDM培養(yǎng)于96孔板(6×103個(gè)/孔)中，加入M-CSF(25 ng/mL)培養(yǎng)，然后用不同濃度(0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的塞來昔布處理5 d。于第5天加入CCK-8并避光孵育2 h，然后用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)量吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4 破骨細(xì)胞形成檢測(cè)

將BMDM培養(yǎng)于24孔板(8×104個(gè)/孔)中，隨機(jī)分為對(duì)照組、RANKL組、RANKL+8 μmol/L組、RANKL+10 μmol/L組和RANKL+20 μmol/L組，對(duì)照組加入α-MEM培養(yǎng)基，其余各組加入含RANKL(50 ng/mL)的α-MEM培養(yǎng)基；RANKL+8 μmol/L組、RANKL+10 μmol/L組和RANKL+20 μmol/L組再分別加入不同濃度(8 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的塞來昔布干預(yù)。每2 d更換一次培養(yǎng)液，第5天固定細(xì)胞并進(jìn)行TRACP染色，拍照觀察破骨細(xì)胞生成情況(破骨細(xì)胞具有3個(gè)以上的細(xì)胞核)。

1.5 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)

將BMDM培養(yǎng)于6孔板(1×105個(gè)/孔)中，給予M-CSF(25 ng/mL)和RANKL(50 ng/mL)處理，然后加入不同濃度(8 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的塞來昔布干預(yù)5 d。將MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板(1.5×105個(gè)/孔)中，隨機(jī)分為對(duì)照組、8 μmol/L組、10 μmol/L組和20 μmol/L組，分別加入α-MEM培養(yǎng)基以及8 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L的塞來昔布干預(yù)48 h。根據(jù)說明書用Trizol裂解液提取細(xì)胞總RNA，按照說明書用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)說明書采用SYBR染料試劑盒進(jìn)行熒光定量，AB StepOne plus RT-PCR system儀器于95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參。引物均由上海生工生物工程有限公司合成和提供，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)

根據(jù)說明書將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NF-κB和NFAT熒光素酶報(bào)告基因的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于48孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組、RANKL組、RANKL+8 μmol/L組、RANKL+10 μmol/L組和RANKL+20 μmol/L組。對(duì)照組加入α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行處理；RANKL組加入RANKL(50 ng/mL)處理24 h;RANKL+8 μmol/L組、RANKL+10 μmol/L組和RANKL+20 μmol/L組預(yù)先用不同濃度(8 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的塞來昔布處理1 h，然后加入RANKL(50 ng/mL)處理24 h，檢測(cè)NF-κB和NFAT活性。

1.7 Western blot

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NF-κB和NFAT熒光素酶報(bào)告基因的RAW264.7細(xì)胞按照1.6步驟處理，采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中p-NF-κB、NF-κB、NFAT的表達(dá)水平。細(xì)胞裂解后提取細(xì)胞總蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下將膜于5%脫脂牛奶中封閉1 h，然后將其與一抗(p-NF-κB、NF-κB、NFAT和GAPDH，按1∶1 000稀釋)于4 ℃搖晃孵育過夜，與二抗(HRP標(biāo)記抗兔抗體，按1∶10 000稀釋)于室溫孵育2 h，然后用ECL試劑曝光顯影。

1.8 去卵巢骨質(zhì)疏松癥小鼠模型構(gòu)建及放射學(xué)分析

雌性C57BL/6J小鼠30只隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、塞來昔布低劑量(12.5 mg/kg)組、塞來昔布中劑量(25 mg/kg)組和塞來昔布高劑量(50 mg/kg)組，每組6只。參考文獻(xiàn)[10]用10%水合氯醛麻醉小鼠，并切除卵巢，術(shù)后1周對(duì)照組和模型組灌胃0.9%生理鹽水，塞來昔布低劑量組灌胃12.5 mg/kg塞來昔布，塞來昔布中劑量組灌胃25 mg/kg塞來昔布，塞來昔布高劑量組灌胃50 mg/kg塞來昔布，每天1次，連續(xù)6周。對(duì)小鼠進(jìn)行安樂死，分離脛骨，固定在4%多聚甲醛中24 h。采用微計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro-CT，Skycan，比利時(shí))進(jìn)行放射學(xué)分析，每個(gè)像素的電壓、電流和分辨率分別設(shè)置為50 kV、400 μA和8.88 μm，定量計(jì)算骨體積/總體積(bone volume/tissue volume，BV/TV)值、骨小梁分離度(trabecular bone separation，Tb.Sp)和骨小梁數(shù)目(trabecular bone number，Tb.N)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 塞來昔布對(duì)BMDM細(xì)胞活力和破骨細(xì)胞形成的影響

BMDM細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0 μmol/L)比較，不同濃度(2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的塞來昔布處理5 d不影響細(xì)胞活力，因此選取最高的3個(gè)濃度(8 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)用于后續(xù)研究，見圖1a。TRACP染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RANKL可誘導(dǎo)BMDM生成破骨細(xì)胞；但相較于RNAKL組，RANKL+8 μmol/L組、RANKL+10 μmol/L組和RANKL+20 μmol/L組的破骨細(xì)胞生成明顯減少，見圖1b～f。

a:BMDM細(xì)胞活力；b:對(duì)照組；c:RANKL組；d:RANKL+8 μmol/L組；e:RANKL+10 μmol/L組；f：RANKL+20 μmol/L組 黑色箭頭：破骨細(xì)胞圖1 塞來昔布對(duì)BMDM細(xì)胞活力和破骨細(xì)胞形成的影響

2.2 塞來昔布抑制RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)

與對(duì)照組比較，RANKL組細(xì)胞中NFATc1、TRACP、CTSK和CTR mRNA水平顯著增加(P<0.001)；與RANKL組比較，RANKL+10 μmol/L組和RANKL+20 μmol/L組細(xì)胞中NFATc1、TRACP、CTSK和CTR mRNA水平顯著下降(P<0.001)，RANKL+8 μmol/L組中細(xì)胞TRACP、CTSK和CTR mRNA水平顯著下降(P<0.001)，見圖2。

a：BMDM細(xì)胞中NFATc1 mRNA水平；b:BMDM細(xì)胞中TRACP mRNA水平；c:BMDM細(xì)胞中CTSK mRNA水平；d:BMDM細(xì)胞中CTR mRNA水平 ###:與對(duì)照組比較，P<0.001；***:與RNAKL組比較，P<0.001圖2 塞來昔布對(duì)破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3 塞來昔布抑制RANKL誘導(dǎo)NF-κB和NFAT的表達(dá)

熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RANKL組細(xì)胞中NF-κB和NFAT活性明顯增強(qiáng)(P<0.001)；但相較于RANKL組，RANKL+8 μmol/L組、RANKL+10 μmol/L組和RANKL+20 μmol/L組細(xì)胞中NF-κB和NFAT活性明顯降低(P<0.001)，見圖3a、b。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RANKL組細(xì)胞中p-NF-κB和NFAT蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)；但相較于RANKL組，RANKL+8 μmol/L組、RANKL+10 μmol/L組和RANKL+20 μmol/L組細(xì)胞中p-NF-κB和NFAT蛋白表達(dá)明顯降低，見圖3c。

a:RAW264.7細(xì)胞中NF-κB活性；b:RAW264.7細(xì)胞中NFAT活性；c:RAW264.7細(xì)胞中p-NF-κB和NFAT的蛋白表達(dá) ###:與對(duì)照組比較，P<0.001；**:與RANKL組比較，P<0.01；***:與RANKL組比較，P<0.001圖3 塞來昔布對(duì)NF-κB和NFAT活性和表達(dá)的影響

2.4 塞來昔布對(duì)成骨細(xì)胞增殖和成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，用不同濃度(8 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的塞來昔布處理MC3T3-E1細(xì)胞可以明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，見圖4a。與對(duì)照組比較，10 μmol/L組和20 μmol/L組細(xì)胞中BMP-2、Runx2和ALP mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.001)，8 μmol/L組僅ALP mRNA表達(dá)水平升高(P<0.01)，見圖4b～d。

a:MC3T3-E1細(xì)胞活力；b:MC3T3-E1細(xì)胞中BMP-2 mRNA水平；c:MC3T3-E1細(xì)胞中Runx2 mRNA水平；d:MC3T3-E1細(xì)胞中ALP mRNA水平 **:與對(duì)照組比較，P<0.01;***:與對(duì)照組比較，P<0.001圖4 塞來昔布對(duì)成骨細(xì)胞增殖和成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5 塞來昔布對(duì)去卵巢小鼠骨丟失的影響

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠BV/TV和Tb.N顯著減小(P<0.001)，Tb.Sp顯著增加(P<0.001)；但與模型組比較，塞來昔布低劑量組、塞來昔布中劑量組和塞來昔布高劑量組小鼠BV/TV和Tb.N顯著增加(P<0.01)，Tb.Sp顯著減小(P<0.01)，見圖5。

a:各組小鼠miro-CT圖片；b:BV/TV；c:Tb.Sp；d:Tb.N ###:與對(duì)照組比較，P<0.001；**:與模型組比較，P<0.01；***:與模型組比較，P<0.001圖5 塞來昔布對(duì)去卵巢小鼠骨丟失的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松癥主要與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收間的穩(wěn)態(tài)有關(guān)，通常是由破骨細(xì)胞的骨吸收超過成骨細(xì)胞的骨形成而引起[11]。破骨細(xì)胞的過度骨吸收是由較高的RANKL水平和相關(guān)下游基因的表達(dá)增強(qiáng)引起的，該途徑已成為治療溶骨性疾病的主要靶標(biāo)[12]。二膦酸鹽通過抑制破骨細(xì)胞的功能來保護(hù)骨骼，但具有下頜骨壞死和腎功能衰竭等風(fēng)險(xiǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，多種中草藥活性成分可抑制破骨細(xì)胞的分化并緩解骨質(zhì)疏松癥，但其成藥性比較緩慢[13]。塞來昔布是一種選擇性COX-2抑制劑，已被批準(zhǔn)用于臨床治療骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，有研究發(fā)現(xiàn)塞來昔布可以調(diào)節(jié)骨代謝穩(wěn)態(tài)[9]。本研究結(jié)果顯示，塞來昔布可以抑制破骨細(xì)胞形成，并能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥具有潛在的治療作用。

為了研究塞來昔布對(duì)破骨細(xì)胞分化的作用和機(jī)制，本研究首先提取了小鼠BMDM細(xì)胞，結(jié)果顯示，塞來昔布可抑制BMDM向破骨細(xì)胞分化，但不影響B(tài)MDM細(xì)胞活力。RANKL屬于腫瘤壞死因子，是破骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵細(xì)胞因子[14]。RANKL與受體RANK結(jié)合后可以激活NF-κB、TRAF和NFATc1等信號(hào)通路，并調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化[15]。NF-κB信號(hào)通路是RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的重要途徑，RANKL與RANK結(jié)合后可促進(jìn)IKKα和IKKβ磷酸化，從而誘導(dǎo)IκB降解并引起NF-κB活化[16]。本研究結(jié)果顯示，塞來昔布通過抑制NF-κB磷酸化來抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，表明塞來昔布可以抑制經(jīng)典的NF-κB通路。NFATc1是破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB激活后可誘導(dǎo)NFATc1活化，NFATc1也可調(diào)節(jié)和控制破骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因(如CTSK、TRACP和CTR等)的表達(dá)[17]。本研究結(jié)果顯示，塞來昔布可以抑制NFATc1的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性。目前尚不能確定塞來昔布是否可直接抑制NFATc1的活性或間接抑制NF-κB的活性。但本研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布可以顯著降低破骨細(xì)胞相關(guān)蛋白NFATc1、CTSK、TRACP和CTR mRNA的表達(dá)。上述結(jié)果表明塞來昔布可通過阻斷NF-κB和NFATc1介導(dǎo)的信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞的分化。

不同濃度的塞來昔布可促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖，具有促進(jìn)骨形成作用。Runx2是RUNXX家族的成員之一，作為成骨細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)成骨細(xì)胞的分化和成熟具有重要作用[18]。Runx2基因敲除在小鼠生長過程中可以誘導(dǎo)體內(nèi)骨骼完全喪失。Runx2與成骨細(xì)胞的主要細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)密切相關(guān)，如堿性磷酸酶、骨鈣素、Ⅰ型膠原、骨唾液蛋白和骨橋蛋白[19]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，BMP和Runx2信號(hào)通路可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和分化，并在骨形成中起關(guān)鍵作用，且成骨細(xì)胞還可通過調(diào)節(jié)骨保護(hù)素表達(dá)調(diào)節(jié)骨吸收，以維持骨穩(wěn)態(tài)[20]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的塞來昔布可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞BMP-2、Runx2和ALP表達(dá)，說明塞來昔布可通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和成熟分子的表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，其可能具有潛在的抗骨質(zhì)疏松癥活性。因此，本研究采用卵巢切除術(shù)構(gòu)建去卵巢骨質(zhì)疏松癥小鼠模型，探討塞來昔布抗骨質(zhì)疏松癥的體內(nèi)活性。

卵巢切除術(shù)動(dòng)物是一種常見的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥體內(nèi)研究模型，廣泛應(yīng)用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的病理和藥物干預(yù)研究[21]。骨穩(wěn)態(tài)失調(diào)可以觸發(fā)骨礦物質(zhì)密度的丟失，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。去卵巢誘導(dǎo)的小鼠表現(xiàn)出明顯降低的骨礦物質(zhì)密度和異常的骨小梁結(jié)構(gòu)特性[22]。因此，本研究構(gòu)建去卵巢小鼠模型探究塞來昔布抗骨質(zhì)疏松癥的體內(nèi)活性，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠BV/TV和Tb.N顯著減小，Tb.Sp顯著增加，說明本研究成功建立了骨質(zhì)疏松癥小鼠模型；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布明顯改善了去卵巢小鼠的骨微結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果說明塞來昔布具有抗骨質(zhì)疏松癥的體內(nèi)活性，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成間的代謝平衡有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑塞來昔布具有潛在的抗骨質(zhì)疏松癥活性，并與調(diào)節(jié)骨代謝有關(guān)。但塞來昔布治療骨質(zhì)疏松癥的具體靶點(diǎn)或直接的信號(hào)通路尚不清楚，仍需進(jìn)一步探討。