活性氧及抗病信號分子介導(dǎo)的向日葵抗黃萎病機(jī)制初探

張 鍵，曹 雄，楊劍鋒，賈 碩，劉 麟，阿德拉·曼德拉-俄羅摩，馮伊彤，趙 君

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)信息中心，內(nèi)蒙古 臨河 015000)

向日葵是繼大豆、油菜和花生之后的世界第四大油料作物，也是僅次于玉米的第二大雜交作物[1]。我國向日葵主要種植在東北三省、華北和西北地區(qū)，其種植面積僅次于大豆和油菜，年種植面積約為86.67萬hm2。內(nèi)蒙古是我國向日葵的主產(chǎn)區(qū)，其種植面積和產(chǎn)量分別占全國的50%和52%，位居榜首[2]。然而，由于向日葵種植效益較好，向日葵播種面積不斷擴(kuò)大，從而帶來了輪作倒茬的困難。向日葵的連年種植導(dǎo)致了向日葵病害發(fā)生嚴(yán)重。目前，向日葵黃萎病已經(jīng)成為我國向日葵種植區(qū)繼菌核病之后的又一主要病害，成為制約向日葵產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素[3]。

引起向日葵黃萎病的病原菌是大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)，其屬于半知菌亞門輪枝孢屬。該病原菌寄主范圍極廣，能夠侵染包括向日葵在內(nèi)的600余種植物[4]。向日葵被大麗輪枝孢菌侵染后最初癥狀表現(xiàn)為底層葉片中心或邊緣組織出現(xiàn)褪綠斑，隨后這些褪綠斑逐漸擴(kuò)大并連接在一起，最終導(dǎo)致葉肉組織的壞死[5]。同時(shí)，病原菌能夠在維管束中借助植物的蒸騰作用向上擴(kuò)展和蔓延，從而導(dǎo)致向日葵的上層葉片褪綠變色，最終導(dǎo)致植物整株枯死。生長后期發(fā)病嚴(yán)重植株的莖基部會出現(xiàn)縱向的黑色條斑，切開病莖后可見維管束組織變褐的現(xiàn)象。

在自然界中，植物總是受到各種病原物的侵襲。為了生存，植物在長期進(jìn)化過程中，逐漸建立了一系列復(fù)雜的防御機(jī)制來抵御病原菌的入侵[6]。植物的防御機(jī)制通常在病原物侵染后在不同水平上發(fā)揮作用，如組織學(xué)機(jī)制、生理生化機(jī)制以及分子機(jī)制，其中組織學(xué)機(jī)制主要體現(xiàn)在結(jié)構(gòu)抗性方面，而生理生化機(jī)制主要體現(xiàn)在植保素和抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生和積累、植物防御酶活性提高等方面，分子機(jī)制則主要表現(xiàn)在抗性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平提高以及抗病信號傳導(dǎo)等方面。

活性氧(ROS)的積累是植物受到生物和非生物的脅迫時(shí)寄主細(xì)胞內(nèi)的快速反應(yīng)，然而過多的活性氧也會對植物細(xì)胞造成一定的傷害[7]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)共同組成植物的ROS清除系統(tǒng)，植物通過這些ROS清除系統(tǒng)可以使細(xì)胞內(nèi)活性氧的濃度處于一個(gè)相對平衡的狀態(tài)[8]，從而降低ROS對細(xì)胞的傷害，增強(qiáng)植物對病害的抵抗能力。此外，在植物抵御病原物入侵過程中，水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)以及乙烯(ET)等一些信號分子發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用。SA一般介導(dǎo)活體營養(yǎng)型病原菌誘發(fā)植物抗性，而JA和ET介導(dǎo)死體營養(yǎng)型病原菌誘發(fā)植物抗性，上述信號分子往往通過拮抗方式調(diào)控寄主對活體和死體營養(yǎng)型病原菌的抗性水平[9]。

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)分子植物病理實(shí)驗(yàn)室前期通過抗性鑒定篩選出高抗黃萎病品種SC89和感黃萎病品種LD5009，本研究以這2個(gè)品種為材料，測定其接種黃萎病菌粗毒素后H2O2含量以及SOD、CAT、PAL、POD活性的變化，同時(shí)還在分子水平上檢測了JA路徑關(guān)鍵基因Pr5、SA路徑上游PAL合成關(guān)鍵基因Pal和ROS信號路徑的相關(guān)基因Sco、Sod及Cat等表達(dá)水平的變化，旨在為初步揭示向日葵黃萎病抗性機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試向日葵品種為抗黃萎病品種SC89和感黃萎病品種LD5009。

供試菌株為黃萎病菌株V89采集自內(nèi)蒙古五原縣，經(jīng)單孢分離和分子鑒定確定是大麗輪枝菌。

供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1 000 mL；查氏培養(yǎng)基(Cazpek)：NaNO32 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖30 g、水1 000 mL。

試劑及其配方為100 μmol/L H2O2：取30%分析純H2O257 μL，溶于100 mL丙酮，再稀釋100倍；5%(m/V)硫酸鈦：5 g硫酸鈦，溶于100 mL 2 mol/L硫酸。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種處理 參照任杰等[10]有關(guān)向日葵黃萎病的接種方法，利用20 mL 黃萎病菌粗毒素提取液(濃度為200 μg/mL)對向日葵幼苗進(jìn)行處理。將處理后的向日葵苗置于25 ℃條件下光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于接種后0，6，12，24，36，48，72 h進(jìn)行取樣(取樣部位為第2，3片真葉)，按照每份樣品0.1 g進(jìn)行稱量，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每個(gè)品種處理10株，共設(shè)置3次重復(fù)，并設(shè)清水處理作為對照。

1.2.2 H2O2和酶液的提取與測定 H2O2提取與定量參照卜浩宇[11]的方法進(jìn)行。SOD、CAT、PAL液提取及測定參照李合生[12]的方法進(jìn)行，POD液提取及測定參照郝再彬[13]的愈創(chuàng)木酚法。每個(gè)試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.2.3 植物總RNA的提取 按照BioFlux公司的RNA提取試劑盒(RNAiso Reagent)的說明書提取毒素處理0，6，12，24，36，48，72 h后的向日葵葉片RNA。并采用博日科技公司BioRT cNDA第一鏈合成試劑盒將提取的RNA合成cDNA。

1.2.4 抗性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的測定 采用RT-PCR技術(shù)對Pal、Pr5、Sod、Sco和Cat等6個(gè)抗性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定，基因的引物信息見表1。RT-PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括引物F/R各1.0 μL、10×TaqBuffer 2.5 μL、10 mmol/L到dNTP 0.5 μL、TaqDNA Polymerase 0.5 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 18.5 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，退火溫度(參照表1引物各自退火溫度)1 min，72 ℃延伸2 min，32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓90 V，持續(xù)30 min。利用Image Pro軟件對結(jié)果進(jìn)行量化比較，計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。

表1 PCR所用引物Tab.1 Sequences of the primers used in PCR

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗、感向日葵品種接種后H2O2含量變化

由圖1可知，抗病品種SC89在接種毒素后12，36 h出現(xiàn)2個(gè)峰值，分別為0.55,0.60 μmol/g，變化趨勢總體為先增加后降低，感病品種LD5009在接種種毒素后12 h出現(xiàn)峰值，達(dá)到0.17 μmol/g，隨后降低。雖然，在感病品種LD5009中H2O2的含量在接種后也出現(xiàn)了過量表達(dá)的峰值，但是在各個(gè)接種時(shí)間點(diǎn)H2O2的含量始終低于抗病品種SC89。由此可見，利用大麗輪枝菌的毒素進(jìn)行接種處理能夠誘導(dǎo)向日葵葉片中H2O2的積累，且抗病品種中積累的速度和積累的量均快于和高于感病品種。

不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level .

2.2 抗、感向日葵品種接種后植物防御酶活性的變化

由表2可知，接種前(0 h)，抗、感品種SOD活性沒有顯著差異。接種后，抗、感品種向日葵葉片中SOD活性均呈現(xiàn)先升高后逐漸降低的趨勢，但是抗病品種中出現(xiàn)2個(gè)峰值，而感病品種僅出現(xiàn)一個(gè)峰值，且峰值出現(xiàn)時(shí)間滯后于抗病品種。相比感病品種，抗病品種在接種后SOD活性增加更顯著，如接種12 h后，抗病品種SC89的SOD活性達(dá)到高峰56.96 U/(g·min)，隨后降低到接種24 h的47.91 U/(g·min)，接著在接種48 h后又達(dá)到另一個(gè)高峰60.93 U/(g·min)，相比接種前(0 h)SOD活性28.39 U/(g·min)升高了32.13 U/(g·min)，增加113.17%；而感病品種LD5009在接種36 h后才達(dá)到高峰49.13 U/(g·min)，隨后開始下降，相比接種前(0 h) 28.80 U/(g·min)，接種36 h后SOD活性增加了20.33 U/(g·min)，增加比例為70.59%。

由表2可知，在接種前(0 h)，SC89中的CAT活性略高于LD5009；但在接種后其他時(shí)間點(diǎn)，SC89葉片的CAT活性一直高于LD5009。接種后，SC89的CAT活性均呈現(xiàn)上升趨勢，并在接種24 h出現(xiàn)一個(gè)峰值，但是在隨后的時(shí)間點(diǎn)，CAT活性略有下降后一直維持一個(gè)較高水平；而LD5009在接種24 h和48 h后酶活性達(dá)到2個(gè)小的峰值，隨后降低到接種起始點(diǎn)水平。SC89在接種24 h后，CAT活性達(dá)到峰值0.11 U/(g·min)，相比接種起始點(diǎn)，酶活性增加83.33%；而LD5009同樣在接種24 h后，達(dá)到最高峰0.07 U/(g·min)，酶活性增加75%。

由表2可知，接種前(0 h)，抗病品種葉片的 POD 活性高于感病品種。接種后，抗病品種的 POD 活性呈現(xiàn)上升—下降—略上升—下降—略上升的趨勢，并在接種12 h出現(xiàn)一個(gè)高峰值，隨后在36，72 h又出現(xiàn)2個(gè)小峰值；而感病品種在12 h達(dá)到一個(gè)峰值，隨后在36 h出現(xiàn)一個(gè)小峰值。相比不同時(shí)間點(diǎn)酶活性水平，SC89接種后水平一直顯著高于LD5009(P<0.05)。接種12 h后SC89 POD活性達(dá)到峰值3.46 U/(g·min)，相比接種前(0 h)升高1.86 U/(g·min)，酶活性增加116.25%；而接種后相同時(shí)間點(diǎn)，LD5009 中POD活性為1.78 U/(g·min)，相比接種前升高0.53 U/(g·min)，酶活性增加42.4%；在接種24 h后，SC89中 POD活性略有下降并保持較高活性；LD5009的 POD 活性與SC89的變化趨勢一致，但活性較低。

由表2可知，接種前(0 h)，抗感病品種中PAL活性基本一致。接種后，抗、感品種PAL的活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且抗病品種升高的幅度略高于感病品種；在接種24 h后，抗、感品種中的PAL活性同時(shí)達(dá)到最高峰17.87，13.80 U/(g·min)，相比接種前，SC89中PAL活性升高 10.14 U/(g·min)，增加131.18%，而LD5009中PAL活性僅升高了6.36 U/(g·min)，增加85.48%。

表2 抗、感向日葵品種接種毒素后植物防御酶活性變化Tab.2 Changes of defense enzyme activity in sunflower varieties with V.dahliae toxin U/(g·min)

2.3 抗性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化

由圖2可知，抗病品種中JA路徑中關(guān)鍵基因Pr5本底水平高于感病品種；并且接種后，抗病品種中Pr5基因誘導(dǎo)表達(dá)迅速，并在接種后36 h達(dá)到最高值，隨后在接種后72 h降低至本底水平(圖2-A)。而感病品種接種后雖然Pr5也能夠被誘導(dǎo)，但誘導(dǎo)的程度明顯低于抗病品種。Pal基因作為SA合成路徑中的關(guān)鍵基因，在接種處理后能迅速被上調(diào)，但是在抗病品種中誘導(dǎo)的水平明顯高于感病品種(圖2-B)。Sod、Sco和Cat基因是H2O2代謝途徑中的關(guān)鍵基因，接種后，盡管抗病品種SC89中Sod的本底水平顯著高于感病品種LD5009(P<0.05)，但是接種后，抗病品種Sod基因轉(zhuǎn)錄水平在接種后48 h出現(xiàn)一個(gè)明顯的峰值，而感病品種在同一時(shí)間點(diǎn)卻沒有升高的趨勢(圖2-C)。Sco基因接種后在抗、感品種均可以被誘導(dǎo)，但是抗病品種誘導(dǎo)的水平略高于感病品種，且高水平表達(dá)的時(shí)間也比感病品種要長(圖2-D)。Cat基因編碼過氧化氫酶(CAT)，能夠?qū)2O2降解成為H2O及O2。接種處理后，抗、感品種中Cat基因的表達(dá)均被誘導(dǎo)，且在接種36 h后達(dá)到最高點(diǎn)，抗性品種中該基因誘導(dǎo)的水平顯著高于感病品種(圖2-E)。上述結(jié)果預(yù)示，H2O2、JA和SA信號路徑參與向日葵對黃萎病抗性的建立過程。

A.Pr5基因相對表達(dá)量；B.Pal基因相對表達(dá)量；C.Sod基因相對表達(dá)量；D.Sco基因相對表達(dá)量；E.Cat基因相對表達(dá)量。A.Relative expression of Pr5 gene；B.Relative expression of Pal gene；C.Relative expression of Sod gene；D.Relative expression of Sco gene；E.Relative expression of Cat gene.

3 結(jié)論與討論

植物的防衛(wèi)反應(yīng)是復(fù)雜的細(xì)胞生理活動的結(jié)果，其生理反應(yīng)是通過一系列的酶催化過程來實(shí)現(xiàn)的。自Fridovich[14]提出生物超氧離子自由基學(xué)說以來，細(xì)胞防御酶系統(tǒng)與植物抗病性的關(guān)系引起了人們的普遍關(guān)注。宋培玲等[15]將油菜黑脛病菌接種至不同抗性水平的油菜中發(fā)現(xiàn)，抗感品種中POD、PPO、CAT、PAL和SOD等5種防御酶活性顯著升高，且抗病品種中防御酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于感病品種。汪紅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，不同抗性品種的棉花在接種黃萎病菌后，POD、PPO、PAL等防御酶活性被誘導(dǎo)升高，且抗病品種反應(yīng)速度和強(qiáng)度都要高于感病品種。本實(shí)驗(yàn)室前期通過對向日葵不同品種接種黃萎病菌毒素，發(fā)現(xiàn)在接種72 h感病品種已經(jīng)呈現(xiàn)非常明顯的發(fā)病癥狀。因此，推測防御酶系的變化應(yīng)該在出現(xiàn)癥狀之前發(fā)生。本研究中，抗、感向日葵黃萎病品種中的4種防御酶活性在本底水平(0 h)并無太大差異，但在接種之后其活性卻表現(xiàn)出很大差異，說明病原菌毒素處理后會誘導(dǎo)植物體內(nèi)防御酶活性的升高。本試驗(yàn)中，抗病品種SC89在接種12 h后，SOD活性達(dá)到第一個(gè)高峰，同時(shí)POD活性也升至最高，且抗病品種中這2種酶活性均明顯高于感病品種。SOD、POD通過酶促反應(yīng)能將植物體內(nèi)超氧陰離子等氧自由基轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，H2O2能夠誘發(fā)植物細(xì)胞的程序性死亡。CAT是植物體內(nèi)重要的活性氧清除酶類，能夠維持體內(nèi)的活性氧代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，從而使植物能在一定程度上忍耐、減緩或抵抗逆境脅迫[17]。本研究中，接種病原菌毒素之后，抗、感向日葵品種中的CAT活性均呈先上升后逐步降低的趨勢?？共∑贩N在接種24 h后，CAT活性達(dá)到高峰，在時(shí)間點(diǎn)上略晚于SOD及POD活性變化速度，這可能是由于超氧陰離子等氧自由基等首先需要通過SOD、POD等酶轉(zhuǎn)化成H2O2，之后才能夠通過CAT等活性氧清除酶類將H2O2降解成為H2O及O2的原因。

PAL是催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶，也是聯(lián)系初級代謝和次級代謝的限速酶和關(guān)鍵酶[18]，苯丙烷類代謝的中間產(chǎn)物酚類物質(zhì)和終產(chǎn)物黃酮、異類黃酮、木質(zhì)素等物質(zhì)參與植物的抗病原菌侵入過程，從而防御病原生物的侵染[19-20]。本研究中，抗、感向日葵品種接種后，PAL的活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并且抗病品種PAL的活性明顯高于感病品種。這一結(jié)果與馬鈴薯感染晚疫病、小麥感染白粉病和稈銹病后，PAL活性變化結(jié)果相一致[21-22]。

在植物的抗病反應(yīng)建立過程中，植物內(nèi)源信號分子如SA、JA以及ET等信號分子發(fā)揮著非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。JA一方面能夠通過誘導(dǎo)植物次生代謝物質(zhì)的積累提高植物的抗性，另一方面JA還能激活許多抗逆基因如PDF1.2和Thi2.1[23-24]。本試驗(yàn)中，檢測了一些抗黃萎病相關(guān)的基因的表達(dá)，特別是接種前后SA和JA信號路徑中關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。如JA路徑的關(guān)鍵基因Pr5，在毒素處理后，抗、感品種均有誘導(dǎo)表達(dá)，且在抗病品種中誘導(dǎo)表達(dá)的水平顯著高于感病品種，表明JA路徑參與了向日葵抗性建立過程。SA作為植物產(chǎn)生局部抗病反應(yīng)與系統(tǒng)獲得抗性反應(yīng)(Systemic acquired resistance，SAR)的重要信號分子在植物抗性建立過程中發(fā)揮著重要的作用[25]。本研究中，Pal作為SA合成路徑中的關(guān)鍵元件，在接種后抗感品種中該基因均能被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且抗病品種中Pal基因的上調(diào)更為顯著，表明SA的合成路徑參與了向日葵抗性建立。

H2O2作為信號分子參與植物體內(nèi)各種代謝過程，同時(shí)也是寄主植物受到病原物侵染后植物抗性建立的顯著標(biāo)志。研究表明，在病原菌侵染早期，寄主植物的侵染點(diǎn)部位會產(chǎn)生大量的活性氧即“氧爆發(fā)”，形成大量的氧自由基和H2O2。本研究通過檢測接種前后抗、感品種中H2O2含量以及H2O2形成有關(guān)的基因如Sod、Sco以及Cat轉(zhuǎn)錄水平的變化，發(fā)現(xiàn)抗病品種中H2O2形成能夠顯著被病原菌所誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)的水平明顯高于感病品種。這一結(jié)果表明，在向日葵與黃萎病菌互作的過程中，H2O2的積累和向日葵抗性建立密切相關(guān)。同時(shí)，抗病品種中ROS清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)等酶活性的變化與H2O2的積累具有高度一致性。因此認(rèn)為，在向日葵抗性建立過程中活性氧作為一個(gè)非常重要的信號分子發(fā)揮著重要的作用。

本研究結(jié)果表明，POD、SOD、CAT及PAL等4種防御酶活性變化與向日葵的品種抗性有關(guān)，且接種黃萎病菌毒素后，SA、JA以及H2O2等信號分子在向日葵抗性建立過程中均發(fā)揮著重要的作用，特別是SA和JA信號路徑在向日葵抗性建立過程中呈現(xiàn)協(xié)同作用。然而，SA和JA是如何協(xié)同作用增強(qiáng)向日葵抗性，SA 和JA信號路徑和H2O2信號分子是如何應(yīng)答等問題還需在未來的研究中進(jìn)行進(jìn)一步探究。