外源水楊酸對高溫脅迫下菜豆種子萌發(fā)的影響

秦 堯，劉 暢，劉大軍，馮國軍，楊曉旭

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150000）

0 引言

作物生長過程中的溫度脅迫是造成作物減產(chǎn)的重要因素，且在整個(gè)生長過程中，種子最先受到不利影響[1]。高溫對植物幾個(gè)重要的生理過程產(chǎn)生負(fù)面影響。首先，高溫下植物體內(nèi)的反應(yīng)性氧物質(zhì)(ROS)的含量會上升，對植物膜、蛋白質(zhì)和其他大分子有害[2]。其次，高溫影響了植物的光合作用，降低了植物體內(nèi)的光合色素含量[3]，破壞了光合作用所需的質(zhì)膜系統(tǒng)[4-5]，降低了反應(yīng)所需酶的活性[6]，抑制了植物的碳同化反應(yīng)[7]。同時(shí)，高溫會破壞植物的源庫關(guān)系，從而影響有機(jī)物質(zhì)的運(yùn)輸與積累[8-9]。高溫同樣會對植物的呼吸作用產(chǎn)生影響，主要是通過影響呼吸酶的活性和質(zhì)膜的完整性來影響的。

通過穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定生物大分子物質(zhì)以及與植物激素和其他代謝途徑相互作用能夠緩解植物在逆境條件下的不利影響。水楊酸具有較強(qiáng)的活性氧(ROS)清除能力，在植物遭遇逆境時(shí)可以提高作物在干旱、鹽堿、高溫、重金屬等非生物脅迫下的抵抗力，從而減少作物因突發(fā)逆境而造成的減產(chǎn)以及生物量的損失[10]。前人研究已表明水楊酸作為一種植物激素參與了高等植物對溫度脅迫的響應(yīng)[11]，但對于不同的植物類型、不同的品種及不同的脅迫程度其作用效果不一[12-14]。靳路真等[15]發(fā)現(xiàn)高溫下大豆葉片中的各項(xiàng)營養(yǎng)物質(zhì)含量均呈下降趨勢，且抗氧化系統(tǒng)啟動(dòng)，MDA含量增高，正常的生長受到抑制。王維領(lǐng)的研究發(fā)現(xiàn)外源SA能顯著提高高溫脅迫下小麥葉片中抗氧化物酶的活性，降低葉片中的H2O2、MDA的含量，減弱膜脂過氧化反應(yīng)提高小麥的抗高溫脅迫的能力[16]。Kakon等[17]研究發(fā)現(xiàn)高溫提早了菜豆的花期，但隨著溫度的升高，菜豆的產(chǎn)量和產(chǎn)量品質(zhì)逐漸下降。王棟麟[18]對高溫下的金花菜生長的研究發(fā)現(xiàn)高溫下對照組金花菜的生長受到抑制，而外施水楊酸能提高抗氧化系統(tǒng)酶的活性，有效緩解高溫對金花菜的抑制作用。陳貴華等[19-20]研究發(fā)現(xiàn)外源水楊酸能有效促進(jìn)陳舊菜豆、茄子種子的萌發(fā)，且在低濃度范圍內(nèi)成正相關(guān)上升。

菜豆(Phaseolus vulgaris.L)，豆科菜豆屬，又名四季豆、蕓豆等，為一年生草本植物，富含包括賴氨酸、纖維素及抗性淀粉在內(nèi)的多種營養(yǎng)物質(zhì)，是中國重要的豆類蔬菜作物之一[21-22]。菜豆喜溫但不耐高溫，其種子的最適發(fā)芽溫度為25℃，低于此溫度或高于此溫度都會抑制菜豆種子的萌發(fā)[23]。隨著溫室效應(yīng)和設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，研究菜豆高溫危害生理與防御技術(shù)是近年菜豆研究的重要課題。研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的甜菜堿與谷胱甘肽預(yù)處理，均可以有效降低菜豆幼苗在高溫脅迫下的丙二醛含量，提高可溶性蛋白含量與保護(hù)酶活性，對高溫脅迫具有明顯的緩解作用[24]。目前，關(guān)于SA對菜豆在高溫脅迫下的研究較少，筆者選用耐熱性較強(qiáng)的‘A18’菜豆種子為試驗(yàn)材料,研究其經(jīng)不同濃度SA處理后在高溫下的生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律，明確外源SA對高溫脅迫下菜豆種子抗性的影響，以期提高菜豆的耐熱性，解決夏季生產(chǎn)和溫室生產(chǎn)中出現(xiàn)的實(shí)際問題，實(shí)現(xiàn)東北菜豆種植資源的溫帶推廣，為防御菜豆高溫危害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年8—9月于黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院園藝植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為大小一致、成熟飽滿的矮生菜豆品種‘A18’種子。所有參試種子均先用0.1%的升汞消毒3 min，再用蒸餾水沖洗3次，每培養(yǎng)皿中放置30粒種子。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)芽試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)對照組(CK1、CK2)、4個(gè)處理組(T1、T2、T3、T4)。

①常溫對照CK1：將種子于清水中浸泡6 h后取出，蒸餾水沖洗3次，濾紙吸干水分，置于放有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入30 mL蒸餾水，放置于25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。

②高溫對照CK2：將種子于清水中浸泡6 h后取出，蒸餾水沖洗3次，濾紙吸干水分，置于放有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入30 mL蒸餾水，放置于33℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。

高溫處理組(T1～4)：將種子分別于T1(0.005mmol/L)、T2(0.01 mmol/L)、T3(0.05 mmol/L)、T4(0.1 mmol/L)4個(gè)濃度的SA溶液中浸泡6 h后取出，蒸餾水沖洗3次，濾紙吸干水分，分別置于放有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入30 mL蒸餾水，放置于33℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。

每組設(shè)置3次重復(fù)。以胚根伸出種皮2 mm作為發(fā)芽標(biāo)志，統(tǒng)計(jì)5天內(nèi)每天的發(fā)芽數(shù)，并在第5天測量胚根長度。計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

1.3.2 生理試驗(yàn) 種子處理及培養(yǎng)方法與發(fā)芽實(shí)驗(yàn)相同。

于24、48 h后分別挑選生長狀態(tài)比較一致的種子，去除種皮后取子葉的部分進(jìn)行生理指標(biāo)的測定。

SOD活性測定參照NBT（氮藍(lán)四唑）法[25]；可溶性蛋白含量的測定參考考馬斯亮藍(lán)法[26]；MDA含量測定參考硫代巴比妥酸比色法[27]；O2-.產(chǎn)生速率測定參照Elstner and Heupel的方法[28]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有測定指標(biāo)均取3次重復(fù)的平均值，繪圖采用Excel，差異顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 20進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA浸種對高溫下菜豆種子發(fā)芽的影響

從表1可知，高溫下，不同外源SA濃度處理對于菜豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子活力指數(shù)全部均存在顯著性(P＜0.05)差異。與CK1相比，高溫下菜豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及種子活力指數(shù)分別下降41.94%、38.53%及62.13%，差異顯著。這說明菜豆在種子萌發(fā)階段遇到高溫條件，其萌發(fā)會受到顯著抑制。

表1 SA浸種對高溫下菜豆種子發(fā)芽的影響

經(jīng)各濃度SA浸種處理的菜豆種子在高溫下的萌發(fā)情況也存在顯著差異。其中，濃度T1、T2組各項(xiàng)指標(biāo)較CK2均得到提高，但仍低于CK1，且T2組處理指標(biāo)均高于T1，T2組較CK2其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及種子活力指數(shù)分別上升41.18%、29.83%及67.04%，說明0.005～0.01 mmol/L濃度SA處理能對熱脅迫有一定的緩解作用；T3、T4組的各項(xiàng)指標(biāo)與CK2相比均有下降，且與濃度呈反比趨勢，說明0.05～0.1 mmol/L的水楊酸對菜豆種子的萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用。綜上，適宜濃度的水楊酸可以緩解高溫對菜豆種子萌發(fā)的不利影響，提高其在高溫下的發(fā)芽率；與其他濃度相比，0.01 mmol/L的外源SA處理更佳，且高于0.05 mmol/L的SA處理使菜豆的生長受到抑制。

2.2 高溫對菜豆種子萌發(fā)生理的影響

從圖1～4中可以看出，與CK1相比，高溫下菜豆種子中的超氧化物歧化酶SOD的酶活性在24 h和48 h分別下降15.12%、14.35%，差異顯著；高溫下菜豆種子中的活性氧含量、丙二醛及可溶性蛋白的含量均有增加，其中，與CK1相比，CK2組的活性氧產(chǎn)生速率在24 h和48 h分別高出39.62%、48.15%，丙二醛含量在24 h和48 h分別高出143.12%、98.16%，可溶性蛋白的含量在24 h和48 h分別高出23.87%、22.95%。由此可見，高溫顯著抑制了菜豆種子正常的生理活動(dòng)，對菜豆種子萌發(fā)有顯著的抑制作用。

圖1 高溫對菜豆種子中可溶性蛋白含量的影響

圖2 高溫對菜豆種子中SOD酶活性的影響

圖3 高溫對菜豆種子中活性氧產(chǎn)生速率的影響

圖4 高溫對菜豆種子中MDA含量的影響

2.3 SA浸種對高溫下菜豆種子超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

由圖5可看出，與高溫對照相比，T1～4處理組菜豆種子中的SOD活性均存在差異，其中24 h時(shí)，T1、T2 之間差異不顯著，CK2、T3、T4組間差異不顯著，但T2與CK2、T3、T4之間差異顯著。48 h時(shí)，T2與CK2、T3、T4之間依舊差異顯著。

圖5 SA浸種對高溫下菜豆種子SOD活性的影響

與CK2相比，T3、T4濃度的SA處理后SOD活性受到抑制，且在24 h時(shí)分別下降3.19%、5.17%，在48 h時(shí)分別下降3.27%、9.24%；；T1及T2濃度外源SA處理后其SOD活性較CK2相比有顯著上升，在24 h時(shí)分別增加6.58%、13.07%，在48 h時(shí)分別增加7.02%、11.54%。這說明適宜濃度的水楊酸可以通過提高SOD酶活性來緩解高溫在菜豆種子發(fā)芽過程中的熱害。

2.4 SA浸種對高溫下菜豆種子中可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，他們的增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。由圖6可看出，在24 h時(shí)，對照組CK2及T1～4處理組菜豆種子中的可溶性蛋白含量均存在顯著差異；在48 h時(shí)，對照組CK2與T1、T2、T4組存在顯著差異，但CK2與T3組之間差異不顯著。

圖6 SA浸種對高溫下菜豆種子中可溶性蛋白含量的影響

各處理組與CK2相比，T3、T4組的可溶性蛋白含量均有所下降，且在24 h時(shí)分別下降2.77%、21.59%，在48 h時(shí)分別下降1.33%、7.51%；T1、T2組可溶性蛋白含量較對照組CK2均有顯著上升，在24 h時(shí)分別上升7.01%、10.29%，在48 h時(shí)分別上升6.48%、11.91%。這說明適宜濃度的水楊酸可以通過提高菜豆種子中的可溶性蛋白含量來緩解高溫在菜豆種子發(fā)芽過程中的熱害。

2.5 SA浸種對高溫下菜豆種子活性氧產(chǎn)生速率的影響

研究發(fā)現(xiàn)，高溫條件導(dǎo)致菜豆種子中O2-產(chǎn)生速率加快，且差異顯著。

由圖7可看出，在24 h和48 h時(shí)，高溫對照組CK2及T1～4處理組菜豆種子中的活性氧產(chǎn)生速率均存在顯著差異。其中與CK2相比，T3、T4組的活性氧產(chǎn)生速率顯著增加，且在24 h時(shí)分別上升9.46%、22.97%，在48 h時(shí)分別上升1.25%、8.75%；T1、T2組的活性氧產(chǎn)生速率顯著低于CK2組，且在24 h時(shí)分別下降9.46%、13.51%，在48 h時(shí)分別下降11.25%、17.5%。這說明適宜濃度的水楊酸可以降低活性氧的產(chǎn)生速率，緩解高溫下菜豆種子發(fā)芽過程中的熱害。

圖7 SA浸種對高溫下菜豆種子活性氧產(chǎn)生速率的影響

2.6 SA浸種對高溫下菜豆種子丙二醛(MDA)含量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，高溫條件導(dǎo)致菜豆種子中的丙二醛(MDA)含量累積（見圖8），其中24 h時(shí)，T4與其他組相比差異顯著，CK2與T3之間、T2與T1之間都存在差異，但不顯著；48 h時(shí)，T4、T3、CK2之間差異顯著，但T2與T1之間存在不顯著的差異。

圖8 SA浸種對高溫下菜豆種子中丙二醛含量的影響

與高溫對照CK2相比，T3、T4組的MDA含量顯著上升，且在24 h時(shí)分別上升3.77%、23.77%，在48 h時(shí)分別上升16.03%、33.88%；T1、T2組在24 h與48 h時(shí)的MDA含量均顯著低于高溫對照CK2，在24 h時(shí)分別降低33.96%、38.49%，在48 h時(shí)分別下降24.04%、31.69%。這說明適宜濃度的水楊酸能夠降低菜豆種子中MDA的含量，降低細(xì)胞質(zhì)膜的損傷，緩解熱脅迫。

3 討論

研究表明，水楊酸(SA)在多種逆境條件下均能增強(qiáng)植物抗逆性，且其本身也參與植物的重要生理過程，能調(diào)控植物的正常生長[29-30]。本研究中，高溫抑制了菜豆種子的萌發(fā)，這種不利的影響能夠通過添加適宜濃度的SA的到緩解，這一結(jié)果與前人在辣椒[31]、蝴蝶蘭[32]、金線蘭[33]、水稻[34]等作物上施用水楊酸緩解逆境脅迫的結(jié)果和結(jié)論一致。本研究中，與常溫相比，高溫下菜豆種子內(nèi)的O2-·物質(zhì)和MDA含量均顯著升高，這說明高溫脅迫使種子中活性氧物質(zhì)累積，使種子內(nèi)細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)受到破壞，給種子帶來較強(qiáng)的氧化損傷，降低種子的活力。SOD作為植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能將 O2-·歧化為 O2和 H2O2，減輕 O2-·對細(xì)胞的傷害。本研究中，SA溶液浸種提高了菜豆種子的SOD活性，從而將過量的O2-·迅速分解為O2和H2O2，減少了菜豆種子中的O2-·及MDA降低了種子在高溫下受到的損傷，這與李同根、張鳳姣在皖貝母和金蓮花中的研究結(jié)果也相一致[35-36]，這說明外源水楊酸也可以提高超氧化物歧化酶的活性來提高菜豆種子對高溫脅迫的抗性。

可溶性蛋白對種子萌發(fā)也很重要，其含量增加不僅能夠使種子保持較低的滲透勢，利于種子吸水萌發(fā)，而且會增強(qiáng)種子對逆境的適應(yīng)能力。本研究中，高溫下對照組菜豆種子中的可溶性蛋白含量較常溫對照相比增多，而適宜濃度水楊酸處理又大大提高種子中可溶性蛋白的含量，這與其他作物得出的結(jié)果相一致[37]。高溫脅迫條件下，菜豆種子中可溶性蛋白含量增加，一方面可能是種子中熱激蛋白的作用，提高了其耐熱性；另一方面可能是受高溫脅迫后啟動(dòng)了保護(hù)酶系統(tǒng)，高溫傷害得到了緩解從而使蛋白質(zhì)降解減少。由此表明，可溶性蛋白在菜豆種子抵御高溫脅迫過程中起到積極的作用。但在高溫脅迫下，SA處理后菜豆種子中熱激蛋白是否起到作用和其機(jī)理，還有待于進(jìn)一步研究。

本研究中的外源水楊酸是采用浸種的方式應(yīng)用到菜豆種子的培養(yǎng)過程，對于菜豆幼苗的作用需進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。本研究所用品種‘A18’為東北地區(qū)品種，因此，本研究的結(jié)果對東北地區(qū)菜豆種質(zhì)資源的推廣和利用有指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

適宜濃度的水楊酸可提高因高溫脅迫而降低的SOD酶的活性，降低高溫脅迫下菜豆種子中的O2-·及MDA含量，減少氧化損傷；同時(shí)，適宜濃度的SA浸種能提高菜豆種子中的可溶性蛋白含量，提高種子對逆境的抗性，緩解高溫脅迫對菜豆種子的不利影響。0.005～0.01 mmol/L的SA浸種能提高菜豆種子在熱脅迫下的萌發(fā)狀況，0.05～0.1 mmol/L的SA浸種則抑制了菜豆種子的萌發(fā)，綜合來看0.01 mmol/L的SA浸種效果最佳。研究結(jié)果可為水楊酸提高菜豆耐熱性在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。