莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病的抑菌防病效果

劉 龍，榮 華，鄭童童，馬俊杰，郭慶元，2

（1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2新疆農(nóng)林外來(lái)入侵有害生物監(jiān)測(cè)預(yù)警與綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052）

0 引言

梨為薔薇科(Rosaceae)，蘋(píng)果亞科(Pomoideae)，梨屬(PyrusL.)多年生果樹(shù)。梨樹(shù)是中國(guó)種植范圍最廣的果樹(shù)之一[1]。梨樹(shù)腐爛病菌(Valsa canker of pear)屬于黑腐皮殼屬，主要危害梨樹(shù)的主干、主枝和側(cè)枝的樹(shù)皮，常造成樹(shù)體病疤累累，枝干殘缺不全，甚至造成死樹(shù)或毀園[2]。梨樹(shù)腐爛病在新疆庫(kù)爾勒地區(qū)所有梨園都有發(fā)生，梨樹(shù)腐爛病成為影響當(dāng)?shù)叵憷娈a(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要影響因子[3]。目前在生產(chǎn)實(shí)踐中針對(duì)梨腐爛病常用化學(xué)防治藥劑有苯醚甲環(huán)唑類、25%吡唑醚菌酯、43%戊唑醇、2.12%腐植酸銅水劑、43%戊唑醇[4]，長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑存在抗藥性、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題，利用具有生物活性代謝物的生防菌對(duì)植物進(jìn)行防治可以替代化學(xué)農(nóng)藥，符合綠色農(nóng)業(yè)和可持續(xù)發(fā)展的理念。芽孢桿菌(Bacillussp.)、假單胞菌(Pseudomonassp.)和鏈霉菌(Streptomycessp.)，已被廣泛應(yīng)用于各種細(xì)菌屬的生物防治策略[5]。芽孢桿菌廣泛的分布于根際土壤中，由于芽孢桿菌對(duì)不利環(huán)境條件的抗性、對(duì)多種病原菌的防治能力以及對(duì)植物根系的定殖活性，芽孢桿菌在生物防治方面表現(xiàn)出巨大的潛力，成為國(guó)內(nèi)外生防的研究熱點(diǎn)[6-8]，莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)就是其中之一。研究表明，大多數(shù)的莫海威芽孢桿菌都能產(chǎn)生特定的表面活性劑，如脂肽的衍生物，枯草芽孢桿菌非核糖體合成的環(huán)狀脂肽類抗生素，伊枯草菌素以及抗真菌活性的水解酶[9-10]。莫海威芽孢桿菌PS17對(duì)小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、厚孢鐮刀菌(Fusarium chlamydosporum)、豌豆殼二孢(Ascochyta pisi)、鏈格孢菌(Alternaria alternate)、菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)、黑附球菌(Epicoccum nigrum)都有抑制效果[12]。因?yàn)槟Ｍ挎邨U菌具有不同拮抗代謝產(chǎn)物譜，可抑制病原菌的種類很廣泛，在生物防治方面擁有很大的潛力。目前暫時(shí)沒(méi)有莫海威芽孢桿菌在梨腐爛病方面的研究。本試驗(yàn)將莫海威芽孢菌作為潛力生防菌，通過(guò)觀察莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病菌絲的影響，次生代謝產(chǎn)物對(duì)梨腐爛病菌生長(zhǎng)的影響，了解胞外酶產(chǎn)生情況，對(duì)梨樹(shù)離體枝條防效測(cè)定，初步獲得莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病菌的抗菌機(jī)理，明確其對(duì)梨腐爛病的預(yù)防和治療效果，為該菌在梨腐爛病防治研究及其他病害防治研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試枝條、病原菌和培養(yǎng)基

庫(kù)爾勒當(dāng)?shù)夭烧憷鏄?shù)1～2年生健康粗細(xì)基本一致枝條。3株香梨腐爛病病原菌(Valsa ceratosperma)由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)作物病害研究室從庫(kù)爾勒英下鄉(xiāng)，十分場(chǎng)、哈拉玉宮鄉(xiāng)香梨樹(shù)中分離并鑒定，代號(hào)為PYX-1、PSF-1、PHL-1。莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所提供。PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基、纖維素培養(yǎng)基、嗜鐵素培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行配制。

1.2 平板對(duì)峙培養(yǎng)

將3株梨腐爛病菌分別接種于PDA培養(yǎng)基中央，在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4天，待病菌鋪滿培養(yǎng)皿后放入4℃冰箱備用。挑取莫海威芽孢桿菌單菌落在LB固體培養(yǎng)基上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1天。利用直徑6 mm的無(wú)菌打孔器分別在3株梨腐爛病平板上打孔獲得菌餅，將菌餅放入PDA培養(yǎng)基中央，在距離菌餅中央3 cm四周利用接種環(huán)點(diǎn)接莫海威芽孢桿菌，空白對(duì)照組接梨腐爛病并點(diǎn)接無(wú)菌水，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)，待空白對(duì)照病原菌菌落接觸培養(yǎng)皿邊緣時(shí)利用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算病原菌菌落生長(zhǎng)抑制率，如式(1)。

1.3 莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病菌絲形態(tài)的影響

在PDA培養(yǎng)基中央放入無(wú)菌載玻片，在載玻片上利用移液槍吸取25 mL 50℃左右PDA覆蓋在載玻片上，將6 mm的梨腐爛病菌餅PYX-1放在載玻片中央，在載玻片四周邊緣放6 mm莫海威芽孢桿菌菌餅，空白對(duì)照不放莫海威芽孢桿菌菌餅，每處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)2天觀察菌絲形態(tài)。

1.4 莫海威芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)梨腐爛病菌的抑制效果

1.4.1 無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌性 接種莫海威芽孢桿菌于LB培養(yǎng)液中，利用恒溫?fù)u床180 r/min，30℃培養(yǎng)36 h，菌液OD600為1.5，將菌液于12000 r/min，離心15 min，收集上清液并用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，4℃冰箱保存待用。將無(wú)菌發(fā)酵液與PDA按10%，15%、25%、30%、40%配制，空白對(duì)照用液體LB代替濾液，將3株梨腐爛病6 mm菌餅分別放于不同濃度培養(yǎng)基中央，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)3天，利用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算病原菌菌落生長(zhǎng)抑制率，如式(1)。

1.4.2 揮發(fā)性產(chǎn)物抑菌作用 參考文獻(xiàn)[13]使用雙板法進(jìn)行測(cè)定。將3株6 mm梨腐爛病菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，在另一個(gè)相同大小的LB培養(yǎng)基上劃線接種莫海威芽孢桿菌，將兩者對(duì)扣在一起，用封口膜將接觸處密封，以未接種莫海威芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)3天，待對(duì)照培養(yǎng)基菌絲鋪滿培養(yǎng)皿時(shí)，分別測(cè)量劃線接種莫海威芽孢桿菌和對(duì)照培養(yǎng)梨腐爛病菌落的直徑，計(jì)算菌落相對(duì)抑制率。

1.5 莫海威芽孢桿菌胞外酶產(chǎn)生情況

將莫海威芽孢桿菌點(diǎn)接到蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基、纖維素酶培養(yǎng)基，幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3天后觀察培養(yǎng)基是否透明或者有無(wú)透明圈，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.6 離體枝條測(cè)定莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病的防效

1.6.1 實(shí)驗(yàn)用菌的制備 將莫海威芽孢桿菌挑入無(wú)菌蒸餾水中，濃度調(diào)至OD600為0.5（菌體濃度約109CFU/mL）作為接種液。梨腐爛病菌PYX-1接種于PDA平板上活化備用。

1.6.2 室內(nèi)預(yù)防性效果測(cè)定 香梨離體枝接種方法主要參考劉坤及古麗孜熱[14-15]的方法進(jìn)行并略作調(diào)整。將采摘的枝條截成25 cm長(zhǎng)，用水清洗干凈，在75%酒精中浸泡1 min后沖洗干凈，重復(fù)3次，晾干后利用固體石蠟兩端封口減少水分損失。在枝條中間位置用打孔器(Ф=6 mm)打孔，取約1 cm2滅菌脫脂棉蘸取細(xì)菌菌液貼在傷口部位，用保鮮膜固定保濕，48 h后取下，以無(wú)菌水接種為對(duì)照。在24 h后接種活化好的梨腐爛病菌菌餅(Ф=6 mm)PYX-1，每處理15個(gè)重復(fù)。將離體枝條放入鋪有紗布的鐵托盤(pán)中，滴入無(wú)菌水剛好浸透紗布，盤(pán)口覆蓋保鮮膜保濕，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，記錄梨腐爛病接種第4天與第7天發(fā)病率及病斑面積，發(fā)病初期病斑為橢圓斑時(shí)按式(2)，發(fā)病中后期病斑為非橢圓斑時(shí)按式(3)測(cè)量病斑面積，計(jì)算防治效果[式(4)]。后續(xù)觀察離體枝產(chǎn)分生孢子角情況。

1.6.3 室內(nèi)治療性效果測(cè)定 接種方式與預(yù)防性效果接種方法一致。接種順序相反，即在中間位置打孔處先接種梨腐爛病，待枝條有明顯發(fā)病癥狀后再接種莫海威芽孢桿菌，以接種無(wú)菌水為對(duì)照，每處理15個(gè)重復(fù)。記錄枝條接種莫海威芽孢桿菌后第3天與第7天病斑長(zhǎng)度并計(jì)算病斑面積。后續(xù)觀察離體枝產(chǎn)分生孢子角情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病的拮抗作用

莫海威芽孢桿菌可較強(qiáng)的抑制梨腐爛病菌落的擴(kuò)展，培養(yǎng)4天后，莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病菌絲有強(qiáng)烈的抑制效果，菌絲抑制率為68%。如圖1所示。

圖1 莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病菌的抑菌效果

通過(guò)光學(xué)顯微鏡可以觀察到，正常生長(zhǎng)梨腐爛病菌落邊緣菌絲量少，看著很稀疏，菌絲呈線性平滑生長(zhǎng)。受到莫海威芽孢桿菌抑制的菌落邊緣菌絲量大，發(fā)出分支較多，看上去較致密，菌絲扭曲，生長(zhǎng)明顯受到抑制。如圖2所示。

圖2 莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病菌絲的影響

2.2 莫海威芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)梨腐爛病的抑制作用

莫海威芽孢桿菌無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)梨腐爛病菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制效果，隨著濾液濃度的增加，菌絲生長(zhǎng)被抑制的越明顯，如圖3所示。

圖3 不同濃度無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)梨腐爛病菌的抑制作用

當(dāng)莫海威芽孢桿菌的無(wú)菌發(fā)酵濾液與培養(yǎng)基混合濃度達(dá)到40%時(shí)，梨腐爛病菌菌絲的生長(zhǎng)完全被抑制，見(jiàn)表1。抑菌回歸方程見(jiàn)表2。

表1 濾液對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制結(jié)果

表2 菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

通過(guò)雙板法實(shí)驗(yàn)，表明莫海威芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)梨腐爛病菌具有抑制效果（圖4），3株菌株菌絲平均相對(duì)抑制率為22.6%。

圖4 莫海威芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)梨腐爛病菌菌落的影響

2.3 基于莫海威芽孢桿菌拮抗代謝產(chǎn)物種類測(cè)定的抗菌機(jī)理初步分析

通過(guò)平板檢測(cè)拮抗代謝產(chǎn)物結(jié)果顯示：莫海威芽孢桿菌可以分解蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素并具有結(jié)合Fe3+的能力，但是不能分解幾丁質(zhì)。初步表明莫海威芽孢桿菌可以產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和嗜鐵素（如圖5所示），不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。所產(chǎn)生的這些酶類都是生防相關(guān)酶類物質(zhì)，可抑制病原菌的生長(zhǎng)。嗜鐵素可與Fe3+結(jié)合，與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)從而達(dá)到抑制病原菌生長(zhǎng)的目的[16-17]。

圖5 莫海威芽孢桿菌拮抗代謝產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

2.4 莫海威芽孢桿菌對(duì)離體枝條防效測(cè)定結(jié)果

通過(guò)預(yù)防性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種莫海威芽孢桿菌6天，接種梨腐爛病3天，2/3離體枝條發(fā)病且病斑面積較小，CK離體枝條基本都發(fā)病。莫海威芽孢桿菌接種7天，腐爛病菌接種4天離體枝條與CK離體枝條全部發(fā)病，接種梨腐爛病菌4天的防效為52%，接種梨腐爛病菌7天的防效為41.7%，見(jiàn)表3。在接種梨腐爛病第16天，預(yù)防枝條與CK枝條基本都產(chǎn)生了分生孢子角。

表3 離體枝實(shí)驗(yàn)中莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病預(yù)防效果

治療性試驗(yàn)結(jié)果表明，莫海威芽孢桿菌接種3天的防效為49%，接種7天的防效為44.6%，莫海威芽孢桿菌對(duì)已經(jīng)被梨腐爛病危害的枝條有一定的治療效果，見(jiàn)表4。在接種梨腐爛病第16天，CK枝條未產(chǎn)生分生孢子角，治療枝條80%都產(chǎn)生了分生孢子角，如圖6。

圖6 治療離體枝條產(chǎn)分生孢子角情況

表4 離體枝實(shí)驗(yàn)中莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病治療效果

3 結(jié)論與討論

新疆冬季寒冷，梨樹(shù)受凍后易發(fā)生腐爛病[18]，且目前對(duì)于梨腐爛病無(wú)單一防效顯著的化學(xué)藥劑，無(wú)明顯癥狀卻攜帶梨腐爛病菌[19]，這對(duì)防治梨腐爛病加大了難度,大量使用化學(xué)藥劑對(duì)其進(jìn)行防治，不符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和環(huán)保安全的理念。利用自然界中的有益微生物防治植物病害具有無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)污染、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[20]。芽孢桿菌屬是目前研究最廣泛的生防劑之一，可作為植物根際細(xì)菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中作為商品化殺菌劑和生防劑具有很大潛力[21-22]。

目前已報(bào)道梨腐爛病生防拮抗菌有芽孢桿菌(Bacillusspp.)，貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)，多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)等，而未有莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)對(duì)梨腐爛病防治的相關(guān)報(bào)道。劉坤[14]研究的多黏類芽孢桿菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)梨腐爛病菌絲抑制EC50(v/v)為0.2156，而本試驗(yàn)EC50(v/v)為0.166，無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌效果比其好很多。古麗孜熱[15]研究的貝萊斯芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病離體枝的保護(hù)性與治療性防效分別為77.71%和66.71%，本試驗(yàn)保護(hù)性與治療性防效分別為41.7%和44.6%，影響結(jié)果的原因是古麗孜熱所用的接種液是發(fā)酵液，發(fā)酵液中不僅含有生防菌還含有已產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)以及培養(yǎng)基成分，而本試驗(yàn)所用的接種液中僅含有生防菌。現(xiàn)有大量芽孢桿菌產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌的報(bào)道，宗英[23]研究貝萊斯芽孢桿菌可產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)，禾烷酮、2-壬酮和2-壬醇抑制禾谷鐮刀菌生長(zhǎng),抑制率為27.7%。GOTOR-VILA等[24]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)（1,3-戊二烯、3-羥基-2-丁酮和噻吩）對(duì)采摘后櫻桃3種病害病原菌Monilinia laxa、M.fructicola和Botrytis cinera具有較好的抑制作用。本試驗(yàn)?zāi)Ｍ挎邨U菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)梨腐爛病菌絲抑制率為22.6%，但具體物質(zhì)還需后續(xù)研究。在本試驗(yàn)中，治療離體枝條第16天未產(chǎn)生分生孢子角，而對(duì)照80%枝條都產(chǎn)生了分生孢子角，說(shuō)明莫海威芽孢桿菌可以減緩梨腐爛病的傳播，不足之處未記錄治療離體枝條產(chǎn)生分生孢子角時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果表明，莫海威芽孢桿菌可以產(chǎn)蛋白酶，淀粉酶，纖維素酶以及嗜鐵素生防因子，對(duì)生防其他病原菌具有借鑒意義。由于梨樹(shù)腐爛病菌的細(xì)胞壁成分主要為幾丁質(zhì)[25]，幾丁質(zhì)酶對(duì)治療梨樹(shù)腐爛病至關(guān)重要，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)莫海威芽孢桿菌不能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，這與DIABANKANA等[12]的試驗(yàn)結(jié)果一致，但其實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)莫海威芽孢桿菌產(chǎn)糖苷水解酶家族18蛋白和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，這些是參與幾丁質(zhì)降解的酶，所以莫海威芽孢桿菌在治療梨腐爛病上具有一定的潛力。通過(guò)試驗(yàn)表明莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病菌的抑制因子主要來(lái)源于代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已報(bào)道多種生防菌對(duì)梨腐爛病菌有拮抗作用，建議今后可以將多種生防菌混合搭配進(jìn)行防治，探索對(duì)梨腐爛病最佳生防效果。

莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病保護(hù)性與治療性防效分別為41.7%和44.6%，具有一定的生防潛力，但最大發(fā)揮其功效需要其具有很強(qiáng)的抗逆能力，可以在植物組織上大量繁殖及定殖存活，后期還需對(duì)莫海威芽孢桿菌在田間梨樹(shù)上的繁殖及定殖存活能力進(jìn)行研究，并通過(guò)大田試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其防治效果。