耿馬甘蔗白葉病植原體昆蟲介體調(diào)查與檢測

李文鳳，王曉燕，倉曉燕，張榮躍，單紅麗，盧文潔，王長秘，尹 炯，黃應(yīng)昆

（1云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南開遠 661699；2云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，昆明 650205）

0 引言

甘蔗白葉病是由16S rXI 組植原體引起的檢疫性甘蔗病害[1]。甘蔗白葉病1954年在泰國首次發(fā)現(xiàn)[2]，現(xiàn)今在印度、巴基斯坦、越南等東南亞植蔗國家普遍發(fā)生、危害嚴重，給當?shù)卦斐删薮蠼?jīng)濟損失[3-5]。2013 年Li 等[6]首次檢測確定云南保山存在甘蔗白葉病，隨后云南臨滄和普洱主產(chǎn)蔗區(qū)也相繼發(fā)現(xiàn)甘蔗白葉病[7-9]，其暴發(fā)流行趨勢明顯，已嚴重影響到云南蔗糖產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。

甘蔗屬宿根栽培無性繁殖作物，甘蔗白葉病植原體主要由蔗種帶病傳播，在臺灣和泰國，還可通過細針葉蟬(Matsumuratettix hiroglyphicus)和條紋閉顏葉蟬(Yamatotettix flavovittatus)進行田間自然傳播，其他葉蟬介體還沒有被證實[10-13]。植原體的傳毒媒介及其機理是防病的基礎(chǔ)，目前云南蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體的傳毒媒介及其機理尚不明確，不利于此病害的科學防控。

2019年，對甘蔗白葉病發(fā)病最嚴重的云南耿馬蔗區(qū)植原體昆蟲介體進行調(diào)查，共采到昆蟲介體14份進行種類鑒定。參照Hanboonsong等[11]的方法分別提取昆蟲介體DNA，使用植原體通用引物對P1/P7[14]和R16F2n/R16R2[15]進行Nest-PCR檢測、克隆、測序，以分析明確云南耿馬蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體昆蟲介體及優(yōu)勢種群，旨在為云南甘蔗白葉病有效防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲介體調(diào)查采集

2019年5—6月，對甘蔗白葉病發(fā)病最嚴重的云南耿馬賀派和芒翁蔗區(qū)植原體昆蟲介體進行調(diào)查（北緯13°29′—23°36′，東經(jīng)99°22′—99°45′，海拔1100.00～1300.00 m）。選擇感病品種‘粵糖60 號’、‘新臺糖25號’、‘盈育91-59’、‘粵糖93-159’、‘新臺糖22號’發(fā)病嚴重地塊，采用尋集法和掃網(wǎng)法重點調(diào)查采集葉蟬、飛虱等植原體昆蟲介體，將采集到的昆蟲介體及時移入盛有75%酒精的離心管中保存，并記錄采集時間、地點，帶回實驗室進行種類鑒定。

1.2 DNA提取

參照Hanboonsong 等[11]的方法，使用動物基因組DNA提取試劑盒（生工生物公司）提取昆蟲介體DNA。

1.3 Nest-PCR檢測

采用植原體通用引物對為P1/P7[14](P1：5’-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3’，P7：5’-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3’) 和 R16F2n/R16R2[15](R16F2n：5’-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’，R16R2：5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’)，預(yù)期擴增產(chǎn)物長度為1240 bp，以抽提的昆蟲介體DNA 為模版，參照張榮躍等[8]的方法對各樣品進行Nest-PCR檢測。

1.4 測序

隨機選擇陽性擴增產(chǎn)物，使用全式金回收試劑盒回收目的片段，并進行連接轉(zhuǎn)化、克隆、測序。所得序列在GenBank 中作BLAST 檢索對比，使用DNAMAN v6.0分析核苷酸序列。

2 結(jié)果與分析

從甘蔗白葉病發(fā)病最嚴重的云南耿馬蔗區(qū)采集到14 份昆蟲介體樣品，經(jīng)實驗室種類鑒定為大青葉蟬Tettigoniella viridis6 份（其中若蟲2 份）和條紋平冠沫蟬Clovia conifer8份（其中若蟲2份）（表1）。

如表1、圖1所示，14份昆蟲介體樣品中2號、3號、5號、8號、9號、10號共6份樣品為陽性，其余8份樣品為陰性。其中，10號樣品（大青葉蟬若蟲）巢式PCR擴增條帶粗且明亮樣品中有高含量甘蔗白葉病植原體為強陽性，3號、9號樣品（大青葉蟬若蟲、成蟲）和2號、5號、8號樣品（條紋平冠沫蟬若蟲、成蟲）巢式PCR擴增條帶細且弱暗樣品中有低含量甘蔗白葉病植原體為弱陽性。

圖1 14份昆蟲介體樣品甘蔗白葉病巢式PCR檢測電泳圖

表1 14份昆蟲介體樣品甘蔗白葉病巢式PCR檢測結(jié)果

測序結(jié)果顯示，2 號和10 號樣品2 個陽性擴增產(chǎn)物片段大小為1247 bp，序列間的核苷酸一致性為100%。BLASTN分析結(jié)果表明，本研究獲得的2條序列（Genbank 登錄號MT649297 和MT649298）與云南臨滄和斯里蘭卡甘蔗白葉病植原體分離物16S rRNA基因序列（Genbank 登錄號KR020691 和MN174860）的核苷酸序列一致性為100%。

3 結(jié)論與討論

國內(nèi)目前已報道的與植原體相關(guān)的病害有100余種[16]，甘蔗白葉病是近年云南蔗區(qū)快速蔓延開來的植原體新病害，現(xiàn)已嚴重影響到云南甘蔗產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效和蔗農(nóng)增收。自然條件下，葉蟬、飛虱、木虱、蚜蟲、粉虱以及椿類等是植原體的傳毒媒介[17-18]。在中國臺灣和泰國，細針葉蟬(Matsumuratettix hiroglyphicus)和條紋閉顏葉蟬(Yamatotettix flavovittatus)自然傳播甘蔗白葉病植原體，其他葉蟬介體尚未得到證實[11-14]。研究表明噴施殺蟲劑對降低SCWL 的發(fā)生率效果不理想[19-21]，甘蔗種莖用熱水處理不能有效清除種莖中的SCWL植原體[22]。而通過組織培養(yǎng)繁育健康甘蔗苗被認為是消除甘蔗體內(nèi)SCWL植原體最有效的方法，大量推廣使用甘蔗無病組培苗及其種莖控制SCWL 在泰國收到很好的效果[23]。目前云南蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體傳毒媒介及其機理不明，不利于此病害的科學防控。本研究結(jié)果顯示，從甘蔗白葉病發(fā)病最嚴重的云南耿馬蔗區(qū)采集到的大青葉蟬(T.viridis)和條紋平冠沫蟬(C.conifer)2 種昆蟲介體均被檢測為陽性，是甘蔗白葉病植原體的自然攜帶者，說明2 種葉蟬可能為甘蔗白葉病植原體潛在昆蟲介體，而10號樣品大青葉蟬若蟲巢式PCR 擴增條帶粗且明亮樣品中有高含量甘蔗白葉病植原體呈強陽性，初步確定為優(yōu)勢種群，有待對其進一步作獲毒、持毒及傳毒期和傳毒方式、傳毒效率等傳毒特性測試驗證。本次調(diào)查，從甘蔗白葉病發(fā)病最嚴重的云南耿馬蔗區(qū)僅采到昆蟲介體14份樣品，種類單一、數(shù)量極低，這可能與多年來國內(nèi)蔗區(qū)推廣應(yīng)用吡蟲啉、噻蟲嗪及其復(fù)配制劑有效防控甘蔗綿蚜、葉蟬、薊馬等蟲媒介體有關(guān)[24-25]，這在一定程度上也減緩了甘蔗白葉病植原體的田間自然傳播。研究結(jié)果豐富了甘蔗植原體病害相關(guān)理論和技術(shù)基礎(chǔ)，有助于制定適用于甘蔗白葉病的綜合防控措施。本研究僅對云南耿馬局部蔗區(qū)和5—6月甘蔗生長早期進行調(diào)查，存在調(diào)查范圍和時期及重復(fù)性不足，應(yīng)擴大調(diào)查范圍、延長調(diào)查時期、增加調(diào)查次數(shù)，并對蟲媒介體優(yōu)勢種群進行

獲毒、持毒及傳毒期和傳毒方式、傳毒效率等系統(tǒng)性傳毒特性測試，以期全面明確中國甘蔗白葉病植原體蟲媒介體及傳毒特性，揭示國內(nèi)甘蔗白葉病主要發(fā)生區(qū)蟲媒介體對病害發(fā)生流行的影響。

甘蔗白葉病是可造成甘蔗絕產(chǎn)絕收的一種植原體病害[1]。目前云南蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體傳播方式主要是帶毒蔗種[26]，主栽品種種莖的SCWL 陽性檢出率均在90%以上[27]，在田間還存在大青葉蟬和條紋平冠沫蟬自然傳播，準確選擇無病健康蔗株作種苗和有效防控蟲媒介體尤為重要。建立甘蔗無病健康種苗繁育基地，加強甘蔗白葉病監(jiān)測，及時銷毀病株，病田避免宿根連作；同時，從切斷植原體自然傳播途徑入手，及時殺滅蔗園中的葉蟬等昆蟲傳播介體。