飼養(yǎng)溫度對(duì)蠋蝽胰蛋白酶活性的影響及消化器官形態(tài)初步觀察

朱艷娟，殷焱芳，王 震，陳紅印，劉晨曦*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/中美生物防治實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.張北縣自然資源和規(guī)劃局，張北 076450）

捕食性蝽使用口外消化作為一種捕食策略，攝食前用細(xì)長(zhǎng)的針尖狀口器刺穿獵物組織，分泌強(qiáng)有力的水解唾液，注入消化酶，同時(shí)保持獵物角質(zhì)層的完整，這種高效的食物攝取和利用系統(tǒng)，對(duì)于肉食性昆蟲(chóng)尤為重要[1]。在口外完成初步消化后，吮吸液化的獵物組織到消化道內(nèi)[2,3]，進(jìn)一步消化和吸收[4]。消化酶活性直接影響著昆蟲(chóng)對(duì)食物消化、吸收的能力，消化酶的相關(guān)研究是營(yíng)養(yǎng)學(xué)和飼料學(xué)研究的主要內(nèi)容之一，是了解昆蟲(chóng)消化生理的重要內(nèi)容。根據(jù)消化物質(zhì)不同，消化酶被分為淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和纖維素酶等。其中，蛋白酶是一種極為重要的消化酶，能將食物中大量的蛋白質(zhì)進(jìn)行催化分解為小分子氨基酸被細(xì)胞吸收，從而用于昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育[5]。與植食性昆蟲(chóng)相比，肉食性昆蟲(chóng)分泌更多的蛋白酶[6,7]。胰蛋白酶（trypsin）是肉食昆蟲(chóng)中最重要的一種水解蛋白酶[1,6]，是絲氨酸蛋白酶的一種，以裂解堿性氨基酸羧基側(cè)蛋白鏈的形式進(jìn)行水解蛋白，參與了多種生理生化的過(guò)程，包括食物蛋白的消化，激素活化和免疫反應(yīng)[8]，在捕食性蝽的口外消化和腸道消化中起著關(guān)鍵作用，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[9]。

蠋蝽ArmachinensisFallou隸屬于半翅目Hemiptera蝽科Pentatomidae，可捕食鞘翅目、鱗翅目等多種農(nóng)林害蟲(chóng)，捕食范圍較廣，是一種控害能力很強(qiáng)的天敵昆蟲(chóng)。我國(guó)南北地區(qū)緯度跨度較大，氣溫差異顯著，蠋蝽在我國(guó)東北、華北、華中、華東和西南等地區(qū)均有分布[10]，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)。目前主要圍繞蠋蝽的生物學(xué)特性[11-18]、室內(nèi)擴(kuò)繁[19-25]及捕食范圍[26-27]等方面做了大量研究，而蠋蝽消化酶活性的研究尚缺少報(bào)道。有研究表示，昆蟲(chóng)的消化道是昆蟲(chóng)體內(nèi)與外界環(huán)境接觸的最主要的區(qū)域，蝽的消化酶起源于唾液腺?gòu)?fù)合體而不是中腸[28]。鑒于此，本試驗(yàn)圍繞蠋蝽的唾液腺和中腸兩個(gè)消化部位的胰蛋白酶活性進(jìn)行研究。根據(jù)我國(guó)南北方氣溫差異特點(diǎn)，設(shè)置了5個(gè)溫度梯度，測(cè)定不同溫度下蠋蝽唾液腺和中腸的胰蛋白酶活性，分析蠋蝽對(duì)飼養(yǎng)溫度的生理生化適應(yīng)性，探尋蠋蝽主要消化酶的適宜溫度，以期為蠋蝽的最適飼養(yǎng)溫度及不同地區(qū)田間釋放的最佳季節(jié)提供生理生化方面的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

蠋蝽飼養(yǎng)在人工氣候箱內(nèi)，環(huán)境條件設(shè)置為溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度（65±5）%，光周期16L:8D。用柞蠶蛹飼喂。柞蠶蛹購(gòu)于遼寧省西豐縣農(nóng)豐生防專業(yè)合作社。

1.2 溫度對(duì)蠋蝽胰蛋白酶活性影響

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將試驗(yàn)處理溫度設(shè)置為15 ℃、20 ℃、26 ℃、30 ℃和35 ℃五個(gè)梯度。選取人工飼養(yǎng)的蠋蝽種群蛻皮后1 d的成蟲(chóng)接入直徑55 mm的硬質(zhì)塑料培養(yǎng)皿容器中，進(jìn)行單頭饑餓處理，為防止蠋蝽逃逸，培養(yǎng)皿上加蓋，蓋上打滿小孔，孔徑2 mm，增加容器內(nèi)透氣性。培養(yǎng)皿內(nèi)放置浸濕蒸餾水的脫脂棉塊為蠋蝽提供水源，在溫度（26±1）℃、光周期 16L:8D、相對(duì)濕度 65%±5%的飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)，經(jīng)饑餓處理24 h后，把蠋蝽放入300 mL硬塑料太空杯中，紗網(wǎng)封蓋杯口，用細(xì)橡皮筋固定，防止逃脫；在紗網(wǎng)上放置鮮活柞蠶蛹和一塊2 cm×2 cm方形脫脂棉浸足水分，為蠋蝽提供生長(zhǎng)充足的食物和水分。然后，分別放入預(yù)先設(shè)置好的5個(gè)溫度的培養(yǎng)箱內(nèi)，每個(gè)溫度處理設(shè)置3組重復(fù)，每組20頭。飼喂24 h。

1.2.2 組織樣品準(zhǔn)備 將不同溫度處理后的蠋蝽，先用蒸餾水沖洗干凈，然后用濾紙吸取表面水分，再用75%酒精消毒后放置于盛有預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.4）的解剖盤(pán)中，剪去雙翅及足部，在解剖顯微鏡下，用精細(xì)鑷子劃開(kāi)蠋蝽前胸腹板，用鑷子夾住身體固定，另一個(gè)鑷子夾住頭部輕拉，顯露出完整的唾液腺?gòu)?fù)合體及中腸，剝除腸道外壁粘連的脂肪體，在PBS拓展液中沖洗干凈，迅速分別放入預(yù)冷的1.5 mL的離心管中。每個(gè)溫度處理的樣品包括唾液腺和中腸兩個(gè)部位，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)收集20頭蠋蝽的組織。用液氮速凍，放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶液制備 將已備的組織樣本，分別液氮中研磨，稱取1 g，再將9 mL的PBS緩沖液（pH 7.2～7.4）加入1.5 mL的離心管中，用電動(dòng)研磨棒在冰上研磨充分成勻漿，離心20 min（2000～3000 r/min），吸取上清液作酶液，分裝待測(cè)。-80 ℃冰凍保存。測(cè)試前4 ℃下解凍。

1.2.4 胰蛋白酶活性測(cè)定 使用昆蟲(chóng)胰蛋白酶 Trypsin酶聯(lián)免疫分析試劑盒，利用雙抗體夾心法，用純化的昆蟲(chóng)胰蛋白酶抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入待測(cè)樣品，再與 HRP標(biāo)記的胰蛋白酶抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下終止反應(yīng)，形成最終的黃色，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中昆蟲(chóng)胰蛋白酶活性濃度。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.5 蠋蝽消化器官的初步觀察 從蠋蝽種群中選取新羽化24 h健康體壯的成蟲(chóng)，用蒸餾水沖洗干凈，后用濾紙吸取表面水分，放入預(yù)冷PBS緩沖液中，減緩蟲(chóng)體行動(dòng)，在立體顯微鏡下，將蠋蝽的口器、唾液腺及中腸完整解剖取出（解剖步驟見(jiàn)1.2.2），使用超景深三維顯微系統(tǒng)（vhx-2000）觀察及拍照口器全貌，用立體顯微鏡取出蠋蝽唾液腺觀察及拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Graphpad 7.0進(jìn)行方差分析，不同處理間的顯著差異性用LSD進(jìn)行檢驗(yàn)。文中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)胰蛋白酶活性的影響

2.1.1 溫度對(duì)蠋蝽唾液腺胰蛋白酶活性的影響 通過(guò)方差分析得出，不同溫度下蠋蝽唾液腺胰蛋白酶活性存在顯著差異（F4,10＝35.33，P＜0.0001），26 ℃溫度飼養(yǎng)下的胰蛋白酶活性濃度最高，平均為1413.9 IU/L，其次濃度較高的是20 ℃，平均為863.6 IU/L，30 ℃和35 ℃溫度下的胰蛋白酶濃度略低于20 ℃，但無(wú)顯著差異，15 ℃時(shí)胰蛋白酶濃度最低，平均為289 IU/L（圖1）。

圖1 不同溫度下蠋蝽唾液腺的胰蛋白酶活性濃度Fig.1 Trypsin activity concentration in salivary glands of A.chinensis at different temperatures

2.1.2 溫度對(duì)蠋蝽中腸胰蛋白酶活性的影響 不同溫度下蠋蝽中腸胰蛋白酶活性存在顯著差異（F4,10＝52.55，P＜0.0001），26 ℃飼養(yǎng)下的胰蛋白酶活性濃度最高，平均為1029.2 IU/L，其次為20 ℃，胰蛋白酶平均濃度為711.8 IU/L，30 ℃時(shí)胰蛋白酶濃度略低于20 ℃時(shí)，但無(wú)顯著差異，35 ℃時(shí)顯著下降，15 ℃飼養(yǎng)下的胰蛋白酶濃度最低，平均為231.3 IU/L（圖2）。

圖2 不同溫度下蠋蝽中腸的胰蛋白酶活性濃度Fig.2 Trypsin activity concentration in midgut of A.chinensis at different temperatures

2.1.3 不同溫度下蠋蝽唾液腺與中腸間胰蛋白酶活性的比較 在不同飼養(yǎng)溫度下，蠋蝽唾液腺胰蛋白酶活性均高于中腸胰蛋白酶活性，其中26 ℃溫度下，唾液腺顯著高于中腸，但在15 ℃、20 ℃、30 ℃和35 ℃溫度條件下，兩個(gè)部位的胰蛋白酶濃度無(wú)顯著差異（圖3）。

圖3 不同溫度下蠋蝽唾液腺和中腸的胰蛋白酶活性濃度Fig.3 Trypsin activity concentration in salivary glands and midgut of A.chinensis at different temperatures

2.2 蠋蝽口器與唾液腺形態(tài)初步觀察

蠋蝽的口器：刺吸式，由上唇（labrum）、喙（proboscis）和口針束（stylet fascicle）三部分組成。不取食時(shí)，喙通常緊貼著前胸腹板正中，長(zhǎng)度至第三對(duì)足基節(jié)中間。上唇較短，與喙的近端口重合，被半包于喙基部第一節(jié)；喙呈細(xì)長(zhǎng)圓柱體狀，由4個(gè)關(guān)節(jié)組成，近端和遠(yuǎn)端都有開(kāi)口，里面包被著口針束；口針束細(xì)長(zhǎng)如絲，共4根，與喙長(zhǎng)度相近。取食時(shí)，喙從胸足間抽出，遠(yuǎn)端口伸出口針束，第一節(jié)與第二節(jié)折疊呈一定角度，與上唇和口針束重合處形成三角區(qū)（圖4）。

圖4 蠋蝽口器觀察圖Fig.4 Photos of the mouthpart of A.chinensis

蠋蝽的唾液腺：主要包括一對(duì)主唾液腺和主唾腺管、一對(duì)副唾液腺和副唾液腺管，主腺分前葉和后葉，內(nèi)容物在立體顯微鏡下觀察整體呈透明狀（圖5A）。

蠋蝽的消化道：從食道開(kāi)始，與之相連的是嗉囊（crop），形狀膨大，下端連接中腸（midgut），中腸呈管狀，粗壯發(fā)達(dá)，可分為三部分，即中腸第一節(jié)、第二節(jié)、第三節(jié)，多為淺黃色內(nèi)容物（與取食獵物有關(guān)），與中腸第三節(jié)相連的是后腸（hindgut），較為短小，不好區(qū)分回腸、結(jié)腸、直腸，末端開(kāi)口于肛門(mén)（圖5B）。

圖5 蠋蝽消化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Structure of digestive system of A.chinensis

3 討論

本研究結(jié)果表明，飼養(yǎng)溫度的變化顯著影響著蠋蝽的生理代謝過(guò)程，不同溫度下蠋蝽體內(nèi)胰蛋白酶活性均不一樣，且唾液腺的酶活性均高于中腸的酶活性，26 ℃既是酶活性呈現(xiàn)最高值的溫度，又是兩個(gè)部位差異表現(xiàn)最顯著的溫度。在15～26 ℃，隨著溫度的升高蠋蝽唾液腺和中腸內(nèi)胰蛋白酶活性均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；26～35 ℃，隨著溫度的升高，胰蛋白酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在五個(gè)溫度梯度范圍內(nèi)，胰蛋白酶活性表現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，這與金銀花尺蠖Heterolochaaphaga[29]、黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor[30]等昆蟲(chóng)，以及刺參Apostichopusjaponicus[31]、波紋龍蝦PanulirusHomarus[32]等變溫動(dòng)物一樣，均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。這可能是酶參與昆蟲(chóng)的新陳代謝，在一定溫度范圍內(nèi)，酶在低溫時(shí)活化分子較少，催化分解作用速率低，隨著溫度上升，酶的活化分子逐漸增多，加速了催化反應(yīng)，催化活性隨之增強(qiáng)，超過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育的適溫區(qū)，高溫下酶蛋白發(fā)生變性，其催化活性隨之下降，昆蟲(chóng)體內(nèi)代謝失去平衡，生化機(jī)能受到明顯抑制。這一溫度范圍，與蠋蝽在我國(guó)分布區(qū)域的氣候條件相吻合，春夏季農(nóng)林作物生長(zhǎng)速率快，尤其在夏季雨季，作物和害蟲(chóng)快速生長(zhǎng)，而蠋蝽主要的消化酶活性恰好在 20～26 ℃呈現(xiàn)上升，食物需求量大，在此時(shí)期進(jìn)行蠋蝽的田間釋放，食物的大量需求，促使其捕食更多獵物，可有力遏制害蟲(chóng)數(shù)量，防止蟲(chóng)害大規(guī)模發(fā)生，極大地提高了生物防治效率。

適宜環(huán)境溫度下，蠋蝽唾液腺及中腸內(nèi)均具有較強(qiáng)的蛋白酶活性，尤其唾液腺?gòu)?fù)合體內(nèi)的胰蛋白酶活性顯著高于中腸，表明它的胰蛋白酶主要來(lái)自唾液內(nèi)，通過(guò)口外消化初步利用食物中的蛋白來(lái)源。Cohen[1]曾研究得出，胰蛋白酶從唾液腺通過(guò)唾液管分泌到食物中，再與食物一起攝入，并在腸道中使用，以繼續(xù)分解蛋白質(zhì)[1]。Oliveira[33]在黑刺益蝽Podisusnigrispinus唾液腺中檢測(cè)到重要的消化性蛋白酶。由此可見(jiàn)，捕食性半翅目昆蟲(chóng)具有口外消化特點(diǎn)，其唾液腺體中，常有胰蛋白酶，并被認(rèn)為是捕食性昆蟲(chóng)主要的唾液蛋白酶[1,4,34]。本試驗(yàn)測(cè)定了蠋蝽體內(nèi)基本的消化酶活性，為蠋蝽消化系統(tǒng)的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為蠋蝽的人工飼料酶類添加劑的研制提供了理論依據(jù)。

昆蟲(chóng)消化系統(tǒng)由唾液腺和消化道組成，昆蟲(chóng)消化道主要由三部分組成：前腸、中腸及后腸，前腸又分為咽喉、食道、嗉囊和前胃四個(gè)部分[35]；中腸具有胃盲囊和胃；后腸包括回腸、結(jié)腸和直腸[36]。研究發(fā)現(xiàn)，蠋蝽消化系統(tǒng)與其他半翅目昆蟲(chóng)一樣，較為復(fù)雜，唾液腺是由不同的葉狀體及附管組成的復(fù)合體，主要包括一對(duì)主唾液腺和一對(duì)細(xì)管狀副唾液腺[34-38]，這些腺體的內(nèi)容物是透明和含水的，這為它們作為水回收器官的作用提供了支持[1,39,40]，副腺體可能參與消化過(guò)程的水循環(huán)，保障大量的唾液流動(dòng)，稀釋并初步分解被攝取的獵物，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收[1]。蠋蝽消化道大體分為食道、嗉囊、中腸和后腸，食道是一條管道，后端膨大形成的嗉囊是儲(chǔ)存場(chǎng)所，暫存著經(jīng)過(guò)口外初步消化的食物及唾液腺分泌的唾液；中腸是消化食物和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要區(qū)域[36,41,42]，多呈管狀，是分泌消化酶和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所。經(jīng)解剖觀察發(fā)現(xiàn)，蠋蝽的中腸較長(zhǎng)，呈管狀，粗壯發(fā)達(dá)，說(shuō)明蠋蝽中腸消化能力較強(qiáng)。蠋蝽中腸可分為三個(gè)部分，這與半翅目昆蟲(chóng)的中腸常劃分為 3～4段[43]相一致。第一部分消化功能最強(qiáng)，其內(nèi)消化酶濃度最高；中腸第二節(jié)含有一定的消化酶，會(huì)對(duì)食糜物再次消化吸收；中腸第三節(jié)多呈膨大狀，內(nèi)容物多為食物殘?jiān)?，其?nèi)消化酶大量減少。鑒于此，在對(duì)半翅目蝽科昆蟲(chóng)的消化生理研究時(shí)，可選擇中腸的第一、第二節(jié)作為重點(diǎn)研究部位，研究相關(guān)排泄系統(tǒng)時(shí)，可增加中腸第三節(jié)部分。

蠋蝽口器作為昆蟲(chóng)攝食源頭的功能器官，對(duì)其研究是理解其生態(tài)的重要途徑。Coronado等[44]也認(rèn)為，昆蟲(chóng)口器的結(jié)構(gòu)影響其取食模式及被消化的食物類型。半翅目昆蟲(chóng)是典型的刺吸式口器，特化為針狀結(jié)構(gòu)，有利于口器在獵物體內(nèi)組織間穿刺，從而特異性地吸食獵物營(yíng)養(yǎng)豐富的體液[45]。觀察發(fā)現(xiàn)，蠋蝽口器的喙由4個(gè)關(guān)節(jié)組成，這與其他蝽科昆蟲(chóng)的喙有3節(jié)組成不同[37]。蠋蝽的口針束同時(shí)刺入獵物體內(nèi)后，口針在獵物體內(nèi)可分散穿向不同方位進(jìn)行吸取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能很好地反映捕食性蝽的取食機(jī)制[46-49]，研究中發(fā)現(xiàn)蠋蝽更喜取食固態(tài)物質(zhì)，可能因?yàn)榱髻|(zhì)食物稀釋了捕食者的口外分泌物，且很難恢復(fù)它們注入人工獵物體內(nèi)的消化酶[41]，阻礙正常消化。本文通過(guò)對(duì)蠋蝽的口器進(jìn)行初步的顯微鏡觀察，探討口器結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為探索蠋蝽口器的取食控害過(guò)程，為天敵昆蟲(chóng)的人工飼料固液形態(tài)的研發(fā)提供參考。