多枝檉柳內(nèi)生真菌Talaromyces stollii的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

肖同美 毛夢(mèng)佳 雷麗娟 許艷妮 鄭瑞芳 邢建國(guó) 司書毅 陳明華,,*

(1 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050；2 新疆維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830002；3 新疆藥物研究所，烏魯木齊 830002)

植物內(nèi)生真菌生長(zhǎng)在健康的植物組織中，并與宿主實(shí)現(xiàn)互惠互利、共生的一類真菌。植物為內(nèi)生真菌提供庇護(hù)和營(yíng)養(yǎng)，而內(nèi)生真菌投桃報(bào)李，產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)宿主的生長(zhǎng)和免受外界的侵襲[1]。Stierle等1993年首次從短葉紅豆杉內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae中獲得了抗腫瘤藥物紫杉醇[2]，激發(fā)了微生物天然產(chǎn)物科研工作者的極大熱情。除了能產(chǎn)生和宿主相同或者類似的化學(xué)成分，植物內(nèi)生真菌也能產(chǎn)生其他復(fù)雜新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)、活性廣泛的次生代謝產(chǎn)物，因此植物內(nèi)生真菌已成為發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新藥物先導(dǎo)物的一個(gè)重要資源[3-4]。

藍(lán)狀菌屬(Talaromycessp.)真菌隸屬于青霉屬有性型屬，近年來從該屬真菌獲得的次生代謝產(chǎn)物主要有聚酮類、萜類、生物堿類和聚酯類，其中一部分化合物在體外顯示出較強(qiáng)的生物活性[5-6]，嗜氮酮類衍生物talaraculone B能夠顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的生長(zhǎng)[7]；異戊烯基酮talaroxanthenone對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性是陽性對(duì)照石杉?jí)A甲的7倍[8]；蒽酮二聚體talaromannin A對(duì)多重耐藥葡萄球菌的MIC為4 μg/mL[9]；麥內(nèi)酯類型化合物thermolides A和B具有強(qiáng)效殺滅線蟲作用，作用與阿維菌素相當(dāng)[10]。因此，對(duì)藍(lán)狀菌屬真菌的深入研究有可能從中獲得創(chuàng)新藥物的重要先導(dǎo)物或者候選物。本課題組從新疆艾丁湖畔的多枝檉柳(Tamarix ramosissima)中獲得一株斯托爾籃狀菌Talaromyces stolliiCMH-215，并對(duì)其大米發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，從中分離得到7個(gè)化合物，分別鑒定為：penipyridone D(1)、penipyridone E(2)、penipyridone F(3)、berkeleyamide C(4)、chrodrimanin A(5)、(S)-pestalasin A (6)和peniazaphilin B(7)。通過與已報(bào)道類似化合物的旋光數(shù)據(jù)比較，首次確定了化合物6的絕對(duì)構(gòu)型，并糾正了以往文獻(xiàn)中對(duì)于化合物6的部分13C NMR數(shù)據(jù)的歸屬錯(cuò)誤。

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是多種缺血性心血管疾病共同的病理生理基礎(chǔ)，其發(fā)生發(fā)展與炎癥、脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)。KLF2(krueppellike factor 2)屬于鋅指家族DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的成員，因在肺高表達(dá)，故又被稱為肺kruupel樣轉(zhuǎn)錄因子2(LKLF2)，其C端為高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，便于結(jié)合到特定的DNA序列和核內(nèi)定位，N端為高度分散的非DNA結(jié)合區(qū)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制作用[11]。KLF2在血管功能和疾病中作為一關(guān)鍵的“分子開關(guān)”，起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[12]。KLF2具有多項(xiàng)機(jī)能負(fù)向調(diào)控炎癥因子的表達(dá)從而發(fā)揮抗炎作用，同時(shí)也有維持內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能、防止血栓形成和抗氧化等作用，與動(dòng)脈粥樣硬化有著密切關(guān)系[13-15]。因此，本課題組為從特境微生物中尋找抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥源分子，建立了KLF2的篩選模型，并對(duì)本文中的化合物1～7進(jìn)行了活性篩選，發(fā)現(xiàn)化合物5和6對(duì)KLF2的表達(dá)均有一定程度的上調(diào)活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：旋光測(cè)試儀Autopol Ⅳ-T(美國(guó)Rudolph公司)；核磁共振波譜儀Bruker AVⅢHD-600MHz(美國(guó)Bruker公司)；LC-MSD-Trap/SL液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀1100系列、分析型高效液相色譜儀Agilent1200(美國(guó)Agilent公司)；Shimadzu LC-10AT、LC-20AT(日本Shimadzu公司)；中壓快速制備色譜儀Flash RF150(環(huán)球香港科技有限公司)；超聲清洗機(jī)KQ5200E(昆山市超聲儀器有限公司)；低溫冷卻循環(huán)泵DLSB-20(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；循環(huán)水式真空泵SHZ-B-Ⅲ(鄭州恒巖儀器有限公司)；分析天平ML-T(瑞士梅特勒托利多公司)；蒸汽滅菌鍋BXM-30R(上?；茖?shí)業(yè)有限公司)；無菌操作臺(tái)VS-840-2(上海化科實(shí)業(yè)有限公司)；恒溫?fù)u床(上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱HPX-9162MBE(亞速旺上海商貿(mào)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELA N-1000D(上海EYELA Instruments公司)；多功能酶標(biāo)儀EnVision 2104(美國(guó)PerkinElmer公司)。

分離填料和主要試劑：反相半制備色譜柱Capcell Pak AQ(5 μm,10 mm× 250 mm)；Capcell Pak MGⅡ(5 μm,10 mm× 250 mm)；反相分析色譜柱Capcell Pak AQ(5 μm，4.6 mm× 150 mm)(日本資生堂公司)；Sephadex LH-20凝膠(美國(guó)GE公司)；硅膠填料100～200目、300～400目，以及GF254薄層色譜硅膠預(yù)制板(山東青島海洋化工廠)。

分析純乙酸乙酯、甲醇、乙醇和二氯甲烷等(北京通廣精細(xì)化工廠)；色譜純乙腈(Fisher公司)；色譜純?nèi)姿?北京百靈威科技有限公司)；氘代二甲基亞砜(Sigma-Aldrich公司)；實(shí)驗(yàn)用水(屈臣氏公司)。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和馬鈴薯葡萄糖瓊養(yǎng)基(PDB)(美國(guó)BD公司)；大米培養(yǎng)基：100 g糙米，100 mL蒸餾水，121℃高壓滅菌15 min。

1.2 菌株和細(xì)胞

真菌Talaromyces stolliiCMH-215分離自新疆艾丁湖畔多枝檉柳枝條中，其ITS基因GenBank登錄號(hào)為OL691078，經(jīng)對(duì)比其與Talaromyces stollii(GenBank No.CBS 408.93)的相似度為99.82%，菌株保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國(guó)家新藥(微生物)篩選室。體外藥理活性測(cè)試用COS-7細(xì)胞購買自美國(guó)模式生物保藏中心(ATCC)。

1.3 菌株發(fā)酵

在25℃條件下，把菌株Talaromyces stollii接種于PDA(葡萄糖20 g/L，馬鈴薯浸粉4 g/L，瓊脂15 g/L)培養(yǎng)基平皿上，培養(yǎng)時(shí)間7 d，然后將復(fù)蘇的菌株接種到500 mL的三角瓶?jī)?nèi)，三角瓶中事先加入滅菌后的PDB種子培養(yǎng)基100 mL(葡萄糖20g/L，馬鈴薯浸粉4 g/L)，在25℃的搖床中培養(yǎng)7 d，轉(zhuǎn)速180 r/min，將其作為種子培養(yǎng)液。接下來對(duì)種子液進(jìn)行放大發(fā)酵，準(zhǔn)備30個(gè)500 mL三角瓶，每瓶加入100 g大米和100 mL去離子水，封口放置浸泡過夜，然后將其用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌(121℃，30 min)，冷卻備用，最后在超凈臺(tái)中在每瓶大米培養(yǎng)基中加入10 mL種子培養(yǎng)液，在25℃環(huán)境下培養(yǎng)30 d。

1.4 分離與純化

將上述Talaromyces stollii發(fā)酵后的大米發(fā)酵物分別使用95%乙醇超聲提取兩次，50%乙醇超聲提取一次，將提取液過濾并減壓濃縮濾液，得其粗提混懸水溶液，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，將萃取液進(jìn)行減壓濃縮得粗浸膏30.1 g。將粗浸膏用硅膠(300～400目)按質(zhì)量比1:1.5拌樣，干法上樣，進(jìn)行硅膠柱層析，選擇二氯甲烷-甲醇梯度(1:0～0:1，V/V)對(duì)其先進(jìn)行初步的分離純化，經(jīng)薄層色譜檢測(cè)，合并樣品得到16個(gè)組分(A～P)。

K組分用閃式C18柱分離，以甲醇:水為流動(dòng)相梯度洗脫，分成13個(gè)亞組分(K1-K13)。亞組分K-5經(jīng)半制備RP-HPLC(Capcell Pak MGⅡ 10 mm×250 mm；14%ACN-含0.1% TFA的H2O等度洗脫；2 mL/min)制備得化合物1(8 mg)；K-8經(jīng)半制備RP-HPLC(Capcell Pak MG Ⅱ 10 mm×250 mm；20% ACN-含0.1% TFA的H2O等度洗脫；2 mL/min)制備得化合物2(12 mg); K-9經(jīng)半制備RP-HPLC(Capcell Pak MGⅡ 10 mm×250 mm；31% ACN-含0.1% TFA的 H2O等度洗脫；2 mL/min)制備得化合物3(4 mg)；K-11經(jīng)半制備RP-HPLC(Capcell Pak MGⅡ 10 mm×250 mm；36% ACN-含0.1% TFA的 H2O等度洗脫；2 mL/min)制備得化合物4(13 mg)。

I組分用閃式C18反相柱分離，以甲醇/水為流動(dòng)相梯度洗脫，分成6個(gè)亞組分I1～I(xiàn)6，I3組分中有無色顆粒狀結(jié)晶生成，即化合物5(10 mg)。

G組分和J組分分別進(jìn)行Sephadex LH-20柱層析，均以二氯甲烷-甲醇(1:1)為流動(dòng)相等度洗脫，各得到兩個(gè)亞組分G1、G2和J1、J2。其中J2用閃式C18反相柱分離，以甲醇/水為流動(dòng)相梯度洗脫，分成8個(gè)亞組分J2-1～J2-8，J2-4經(jīng)半制備RP-HPLC(Capcell Pak AQ 10 mm×250 mm；23% ACN-H2O等度洗脫；2 mL/min)制備得化合物6(9 mg)。G2用正相硅膠柱分離，以石油醚:乙酸乙酯為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，分成12個(gè)組分(G2-1-G2-12)。G2-11經(jīng)閃式C18反相柱層析分離得3個(gè)亞組分G2-11-1～G2-11-3，G2-11-2經(jīng)半制備RP-HPLC(Capcell Pak AQ 10 mm×250 mm；35% ACN-含0.1% TFA的 H2O等度洗脫；2 mL/min)制備得化合物7(18 mg)。

1.5 體外上調(diào)KLF2活性測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用KLF2篩選模型，以KLF2-COS7細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COS7細(xì)胞，10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基稀釋并細(xì)胞計(jì)數(shù)5×105個(gè)/mL，同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染KLF2質(zhì)粒，96孔板接種，150 μL/孔，4～6 h待細(xì)胞貼壁后，更換為5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基200 μL/孔，再分別加入1 μL化合物，18～24 h后檢測(cè)。以熒光素酶為報(bào)告基因，EnVision多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶與底物反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，用相對(duì)發(fā)光單位(relative luminescence unit,RLU)的數(shù)值來表示。實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)置空白對(duì)照孔，加藥孔與空白對(duì)照孔熒光強(qiáng)度的比值就是藥物上調(diào)KLF2的倍數(shù)值，上調(diào)倍數(shù)大于1.5的化合物被認(rèn)定為具有上調(diào)KLF2的活性。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)及波譜數(shù)據(jù)(圖1)

圖1 化合物1～7的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of 1～7

化合物1為白色無定形粉末，易溶于甲醇，[α]24D+22(c 0.8,MeOH)，ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z289[M+H]+，分子式為C15H16N2O4。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6): δH7.33 (2H,d,J=7.2 Hz,H-1/5),7.39 (2H,dd,J=7.2,7.2 Hz,H-2/4),7.32 (dd,J=7.2 Hz,H-3)],5.90(1H,s,H-7),6.37 (1H,s,H-9),8.44 (1H,s,H-12),4.13(1H,dt,J=14.4,5.4 Hz,H-14a),4.04 (1H,dt,J=14.4,5.4 Hz,H-14b),3.47 (2H,m,H-15),7.43 (1H,brs,NHa-13),9.50 (1H,brs,NHb-13);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6):δC126.9 (C-1/5),128.6 (C-2/4),128.0 (C-3),140.6 (C-6),70.0 (C-7),153.9 (C-8),119.4 (C-9),176.6 (C-10),117.7 (C-11),147.8 (C-12),165.2 (C-13),54.6 (C-14),60.3 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為penipyridone D。

化合物2為白色無定形粉末，易溶于甲醇，[α]24D+ 22.3 (c 1.2,MeOH)，ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z331 [M+H]+，分子式為C17H18N2O5。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6): δH7.38～7.45 (5H,overlap,H-1～5),6.94 (1H,s,H-7),6.45 (1H,s,H-9),8.47 (1H,s,H-12),4.05 (2H,m,H-14),3.60 (1H,m,H-15a),3.50 (1H,m,H-15b),7.50 (1H,d,J=3.6 Hz,NHa-13),9.38 (1H,d,J=3.6 Hz,NHb-13),2.17 (3H,s,H-17);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6): δC127.7 (C-1/5),129.1 (C-2/4),129.2(C-3),135.7 (C-6),71.1 (C-7),149.7 (C-8),119.1 (C-9),176.3 (C-10),118.2 (C-11),148.1 (C-12),164.9 (C-13),55.0 (C-14),60.0 (C-15),169.3 (C-16),20.7 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為penipyridone E。

化合物3為白色無定形粉末，易溶于甲醇，[α]24D+ 9.0 (c 0.4,MeOH)，ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z373 [M+H]+，分子式為C20H24N2O5。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6): δH7.33～7.41 (5H,overlap,H-1～5),5.92 (1H,d,J=3.0 Hz,H-7),6.52 (1H,s,H-9),8.56 (1H,s,H-12),4.17 (1H,dt,J=15,4.8 Hz,H-14a),4.09 (1H,dt,J=15,4.8 Hz,H-14b),3.46 (2H,m,H-15),2.60 (2H,d,J=7.2 Hz,H-2'),2.07 (1H,m,H-3'),0.92 (6H,d,J=6.6 Hz,H-4',5'),12.93 (1H,s,NH-13),5.12 (1H,brs,OH-5);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6): δC126.9 (C-1/5),128.6 (C-2/4),128.1 (C-3),140.3 (C-6),69.9 (C-7),154.9 (C-8),119.7 (C-9),176.6 (C-10),115.6 (C-11),149.4 (C-12),162.5 (C-13),54.9 (C-14),60.1 (C-15),173.5 (C-1'),46.6 (C-2'),24.5 (C-3'),22.3 (C-4'/5')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為penipyridone F。

化合物4為白色無定形粉末，易溶于甲醇，[α]24D+ 37.9 (c 1.3,MeOH)，ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z415 [M+H]+，分子式為C22H26N2O6。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6): δH7.34～7.44 (5H,overlap,H-1～5),6.95 (1H,s,H-7),6.59 (1H,s,H-9),8.58 (1H,s,H-12),4.09 (1H,m,H-14),3.54 (1H,dt,J=13.2,4.8 Hz,H-15a),3.47 (1H,dt,J=13.2,4.8 Hz,H-15b),2.60 (2H,d,J=7.2 Hz,H-2'),2.07 (1H,m,H-3'),2.18 (3H,s),0.91(6H,d,J=7.2 Hz,H-4',5'),12.80 (1H,s,NH-13);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6): δC127.8 (C-1/5),129.1(C-2/4),129.4 (C-3),135.3 (C-6),71.0 (C-7),149.6 (C-8),119.4 (C-9),176.4 (C-10),116.0 (C-11),150.6 (C-12),162.3 (C-13),55.4 (C-14),59.7 (C-15),169.3 (C-16),20.7 (C-17),173.5 (C-1'),46.6 (C-2'),24.5 (C-3'),22.3 (C-4'/5')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為 berkeleyamide C。

化合物5為無色針狀結(jié)晶，易溶于甲醇，[α]24D+ 3.9(c 0.7,MeOH)，ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z443 [M+H]+，分子式為C25H30O7。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6): δH11.08 (1H,s,OH-4'),7.38 (1H,d,J=10.2 Hz,H-1),6.28 (1H,s,H-5'),5.89 (1H,d,J=10.2 Hz,H-2),5.67 (1H,d,J=6.6 Hz,OH-7'),5.05 (1H,d,J=3.6 Hz,OH-7),4.66 (1H,dd,J=6.6,1.8 Hz,H-7'),4.63 (1H,ddd,J=8.4,6.6,1.8 Hz,H-8'),4.02 (1H,dt,J=8.4,3.0 Hz,H-7),3.13 (1H,dd,J=15,5.4 Hz,H-11β),2.58 (1H,t,J=15 Hz,H-11α),2.18 (1H,m,H-6α),2.16 (1H,d,J=5.4 Hz,H-5),2.12 (1H,dd,J=13.2,5.4 Hz,H-9),1.68(1H,ddd,J=13.8,3.0,1.8 Hz,H-6β),1.43 (3H,d,J=6.6 Hz,H-9'),1.34 (3H,s,H-15),1.17 (3H,s,H-12),1.05 (3H,s,H-14),1.03 (3H,s,H-13);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6): δC158.4 (C-1),126.4 (C-2),203.5 (C-3),44.5 (C-4),42.4 (C-5),28.0 (C-6),70.6 (C-7),79.9(C-8),42.1 (C-9),38.7 (C-10),21.0 (C-11),21.5 (C-12),21.6 (C-13),27.4 (C-14),27.4 (C-15),112.6 (C-1'),142.2 (C-2'),101.1 (C-3'),161.1 (C-4'),103.9 (C-5'),160.3 (C-6'),62.2 (C-7'),78.1 (C-8'),16.5 (C-9'),169.9(C-10')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物 5 為 chrodrimanin A。

化合物6為黃色無定形粉末，易溶于甲醇，ESIMS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z265[M+H]+，分子式為C14H16O5。1H NMR (600 MHz,CDCl3): δH7.53 (1H,brt,J=1.2 Hz,H-4),6.43 (1H,d,J=2.4 Hz,H-5),6.63 (1H,d,J=2.4 Hz,H-7),4.16 (1H,m,H-2'),3.92 (3H,s,OCH3-8),3.83 (3H,s,OCH3-6),2.81 (1H,ddd,J=14.4,4.2,1.2 Hz,H-1'a),2.61 (1H,ddd,J=14.4,8.4,1.2 Hz,H-1'b),1.28 (3H,d,J=6.0 Hz,H-3');13C NMR (150 MHz,CDCl3): δC162.3 (C-2),127.3 (C-3),141.4 (C-4),99.8(C-5),156.5 (C-6),102.6 (C-7),148.1 (C-8),138.1 (C-9),119.9 (C-10),41.0 (C-1'),66.8 (C-2'),23.7 (C-3'),55.9 (OMe-6),56.4 (OMe-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的pestalasin A基本一致，但是通過2D NMR實(shí)驗(yàn)，在HMBC譜中H-5和H-7均與δC131.8存在遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，因此該碳的化學(xué)位移應(yīng)該歸屬在C-9，H-11與δC131.8和δC119.9存在遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，因此C-10的化學(xué)位移為δC119.9，故文獻(xiàn)[19]對(duì)pestalasin A、pestalasin C和3-hydroxymethyl-6,8-dimethoxycoumarin中的C-9和C-10的化學(xué)位移歸屬有誤，C-9的化學(xué)位移應(yīng)分別為δC138.1、138.0和138.1；而C-10應(yīng)分別為δC119.9、119.8和119.9。此外，文獻(xiàn)中并未對(duì)化合物pestalasin A的絕對(duì)構(gòu)型進(jìn)行確定，化合物6和文獻(xiàn)[20]報(bào)道的talacoumarin A在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別在于化合物6的C-8位是甲氧基取代，而talacoumarin A是羥基取代，因此該位置上的差別并不會(huì)影響它倆的旋光正負(fù)性，化合物6的比旋度為[α]24D+35.4(c 0.9,MeOH)，而talacoumarin A的比旋度為[α]20D+ 56.0(c 0.5,MeOH)，說明化合物6的C-2'為S構(gòu)型，故鑒定化合物6為(S)-pestalasin A。

化合物7為白色無定形粉末，易溶于甲醇，[α]24D- 41.8 (c 1.8,MeOH),ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z209 [M+H]+，分子式為C11H12O4。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6): δH6.36 (1H,d,J=1.8 Hz,H-7),6.25 (1H,d,J=1.8 Hz,H-5),4.40 (1H,m,H-3),3.73 (3H,s,H-10),2.80 (1H,dd,J=16.2,3.0 Hz,H-4a),2.69 (1H,dd,J=16.2,11.4 Hz,H-4b),1.30 (3H,d,J=6.0 Hz,H-9);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6): δC162.8 (C-1),72.9 (C-3),35.4 (C-4),143.9 (C-4a),106.2 (C-5),161.2 (C-6),98.4(C-7),162.7 (C-8),104.6 (C-8a),20.3 (C-9),55.5 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為peniazaphilin B。

2.2 化合物1～7在KLF2模型上的活性測(cè)定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用KLF2篩選模型，KLF2(Krueppellike factor 2)在內(nèi)皮細(xì)胞中控制多種對(duì)抗炎、抗血栓形成、抗氧化和抗增殖作用的基因，而且是巨噬細(xì)胞自噬-溶酶體通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，因此KLF2上調(diào)劑對(duì)于維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和抑制泡沫細(xì)胞形成有積極作用。化合物5和6顯示出了一定的KLF2的上調(diào)活性，分別在100和50 μmol/L時(shí)對(duì)KLF2的表達(dá)上調(diào)了2倍。其他化合物在100 μmol/L時(shí)均沒有體現(xiàn)出上調(diào)KLF2活性。

3 討論

多枝檉柳Tamarix rasissimaLedeb.，又名紅柳，為檉柳科檉柳屬植物，廣泛分布于我國(guó)西北地區(qū)，其不僅是名貴中藥管花肉蓯蓉的寄主，而且其細(xì)嫩枝條和花具有疏風(fēng)解表和透疹解毒之功效，在寧夏民間常用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[22]。Tamaractam是從多枝檉柳中獲得的一種新內(nèi)酰胺，可誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞凋亡[23]。多枝檉柳中的鞣花酸、咖啡酸和阿魏酸等多種酚酸類化合物也具有較強(qiáng)的抗炎作用[22]。在多枝檉柳中也發(fā)現(xiàn)了查爾酮和黃烷類化合物，其中2',4'-二羥基查爾酮具有較好的抗耐甲氧西林金葡菌和抗甲氧西林敏感金葡菌的活性[24]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，多枝檉柳枝條提取物對(duì)革蘭陽性菌和陰性菌均具有較好的抑制作用[25]。

雖然對(duì)多枝檉柳的化學(xué)成分有了一定研究，但目前并未發(fā)現(xiàn)有報(bào)道其內(nèi)生真菌中的次生代謝產(chǎn)物。本文首次對(duì)多枝檉柳枝條中1株內(nèi)生真菌Talaromyces stolliiCMH-215的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，借助多種色譜-波譜等技術(shù)分離鑒定了7個(gè)化合物，其中化合物1～4為少見的芐基取代的4-吡啶酮類化合物，該類化合物目前從Aspergillussp.[26-27]、Penicilliumsp.[16,28-30]、Pestalotiopsissp.[31]和Cladosporiumsp.[32]中僅發(fā)現(xiàn)17個(gè)，部分化合物包括本文中的2和4在體外具有顯著地降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集、總膽固醇和甘油三酯的水平[16]。另外，分離得到一個(gè)混原萜類化合物5，一個(gè)香豆素類化合物6和一個(gè)異香豆素類化合物7，化合物5和6對(duì)與抗動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)基因靶標(biāo)KLF2具有一定上調(diào)作用，提示通過對(duì)它們的結(jié)構(gòu)修飾或者結(jié)構(gòu)改造，可能獲得抗動(dòng)脈粥樣硬化的先導(dǎo)物。

該工作豐富了藍(lán)狀菌屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物種類。文獻(xiàn)[5]中也總結(jié)了近年從藍(lán)狀菌屬發(fā)現(xiàn)的107個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物，代表性類型主要包括聚酮類54個(gè)、萜類17個(gè)、大環(huán)內(nèi)酯14個(gè)、生物堿14個(gè)，其中一些化合物顯示出了較強(qiáng)的抗炎、降血糖、細(xì)胞毒和抗菌作用。近期也有學(xué)者從Talaromyces funiculosus中分離得到一個(gè)獨(dú)特的二聚苯并呋喃酮類化合物funitatin A，該化合物對(duì)Proteussp.和Escherichia coli具有顯著的抑制作用，MIC值均為3.13 μmol/L[33]。在軟珊瑚來源的Talaromycessp.SCSIO 041201中，發(fā)現(xiàn)了一類二苯醚類化合物能夠顯著抑制E.coli、MRSA、S.aureus和E.faecalis的生長(zhǎng)，MIC在0.45～15.6 μg/mL[34]。南極海綿來源的Talaromycessp.HDN1820200產(chǎn)生了一類復(fù)雜的籠狀新骨架類化合物talarodrides A～F，它們含有一個(gè)特殊的籠狀雙環(huán)[4.3.1]-癸-1,6-二烯，并具有橋頭烯烴和馬來酸酐的核心骨架，其中talarodride A 和talarodride B能夠選擇性的抑制Proteus mirabilis和Vibrio parahemolyticus，MIC值為3.13～12.5 μmol/L[35]。因此，籃狀菌屬真菌顯示出次級(jí)代謝的多樣性及代謝產(chǎn)物廣泛的生物活性，隨著對(duì)籃狀菌屬真菌的深入研究，有可能從中獲得創(chuàng)新藥物的先導(dǎo)化合物或者藥物候選物，對(duì)促進(jìn)人類健康具有重要意義。