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    臘花組培快繁體系研究

    2022-07-08 23:10:08白艷榮蔣亞蓮王進(jìn)英
    關(guān)鍵詞:葉色外植體生根

    白艷榮,蔣亞蓮,王進(jìn)英

    (1昆明學(xué)院,昆明 650213;2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所,昆明 650214)

    0 引言

    臘花(Chamelaucium uncinatum)為桃金娘科(Mycinatum)植物,即淘金彩梅,又名杰拉爾頓臘花或風(fēng)臘花。臘花可作高檔鮮切花、綠化景觀樹(shù)、盆景、香精萃取等,具有較高的觀花、觀葉及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于蠟花雄蕊較長(zhǎng)伸出花外、雌蕊隱蔽于花心之內(nèi)導(dǎo)致不結(jié)實(shí)。目前,主要繁殖方式為扦插繁殖。扦插繁殖慢且生根率低,難以滿(mǎn)足生產(chǎn)需求。有關(guān)風(fēng)臘花組培的研究,錢(qián)仲秀等[4]以3年生當(dāng)年長(zhǎng)出的半木質(zhì)化嫩枝作為外植體,初代培養(yǎng)并獲得了成功;婁麗華等[5]采用半木質(zhì)化嫩莖頂芽作為外植體,成功建立了無(wú)菌體系;湯桂軍等[6]以春季抽伸的半木質(zhì)化嫩莖莖段作為外植體,生根率可達(dá)80%;但尚未解決生根率低的問(wèn)題,不能滿(mǎn)足生產(chǎn)上的需要。筆者以臘花的嫩芽嫩莖為繁殖材料,研究和完善臘花的組培快繁技術(shù)體系,旨在為臘花種苗工廠(chǎng)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    選取臘花半木質(zhì)化嫩枝頂芽做外植體。

    1.2 主要試劑

    試劑包括蔗糖、瓊脂、HCl、NaOH、75%酒精、2%次氯酸,激素KT、6-BA、IBA、NAA,MS、1/2MS培養(yǎng)基母液。

    1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.3.1 初代培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基,添加3%的蔗糖和0.62%的瓊脂,培養(yǎng)基pH 5.8~6.0。設(shè)置KT(0、2、3、4 mg/L)、NAA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L)濃度梯度組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。選取臘花半木質(zhì)化嫩枝頂芽做好消毒處理后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,設(shè)置9個(gè)處理、1個(gè)對(duì)照,每個(gè)處理接種3瓶,3次重復(fù),每瓶接種2個(gè)外植體,每個(gè)處理接種18個(gè)芽(>0.5 cm的芽),30天后分別統(tǒng)計(jì)不同激素濃度組合對(duì)臘花誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響,進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),篩選最佳激素濃度配比的培養(yǎng)基。

    1.3.2 增殖培養(yǎng) 以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加3%的蔗糖和0.62%的瓊脂,培養(yǎng)基pH 5.8~6.0。設(shè)置6-BA(0、0.5、1.0、1.5 mg/L)、NAA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L)濃度梯度組合的增殖培養(yǎng)基。選取生長(zhǎng)健壯的、長(zhǎng)勢(shì)一致的臘花無(wú)菌苗接種到增殖培養(yǎng)基上,設(shè)置9個(gè)處理、1個(gè)對(duì)照,每個(gè)處理接種3瓶,重復(fù)3次,每瓶處理接種3株,每個(gè)處理接種27個(gè)芽,培養(yǎng)45天后,分別統(tǒng)計(jì)組培苗的增殖情況,研究不同濃度激素梯度組合對(duì)試管苗增殖的影響,篩選最佳的增殖培養(yǎng)基。

    1.3.3 生根培養(yǎng) 以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將無(wú)菌芽接種到不同濃度IBA(0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L)的生根培養(yǎng)基上,添加3%的蔗糖、0.62%的瓊脂和0.1%的活性炭,pH 5.8~6.0,設(shè)置6個(gè)處理、1個(gè)對(duì)照,每個(gè)處理轉(zhuǎn)接3瓶,每瓶接種3株,重復(fù)3次,每個(gè)處理接種27株無(wú)菌苗,培養(yǎng)60天后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),研究不同濃度的IBA對(duì)組培苗生根的影響,篩選最佳的培養(yǎng)基配方。

    隨機(jī)每個(gè)處理取10株長(zhǎng)勢(shì)一致的臘花組培苗,將組培苗取出,用清水對(duì)根系進(jìn)行清洗,測(cè)量每株的根長(zhǎng),平均值即為根長(zhǎng)。以組培苗根基0.5 cm處的直徑作為根粗。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 培養(yǎng)基的配制 每個(gè)處理配制500 mL的培養(yǎng)基,裝9瓶,按上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)量取母液。在制備MS培養(yǎng)基時(shí),母液量取應(yīng)是大量元素和微量元素各5 mL/L;在制備1/2MS培養(yǎng)基時(shí),母液量取應(yīng)是按大量元素2.5 mL/L、微量元素5 mL/L和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑加入燒杯中,加入15 g蔗糖,再加入瓊脂攪拌均勻后定容,用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH 5.8~6.0,之后分裝到培養(yǎng)瓶中,每瓶裝55~60 mL的培養(yǎng)基,蓋上蓋子密封,添加到培養(yǎng)基中的激素或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都需提前滅菌,置于滅菌架上放到高壓蒸汽滅菌鍋中,在溫度為121℃下滅菌2 min,等溫度和壓力下降后取出培養(yǎng)基備用。

    1.4.2 滅菌與接種 剪去相對(duì)幼嫩的半木質(zhì)化枝條頂芽作為外植體,長(zhǎng)度為1~2 cm,剪好后的材料用洗潔精浸泡2 min,用自來(lái)水清洗干凈后用自來(lái)水流動(dòng)沖洗2 h,之后到接種室用75%酒精清洗30 s后用無(wú)菌水清洗3次,每次清洗時(shí)間為25~30 s。用4%氯酸鈉溶液浸泡15 min后,用無(wú)菌水清洗5遍,每次30 s,清洗好的外植體放到無(wú)菌接種盤(pán)用無(wú)菌紙把水分吸干,把無(wú)菌外植體接種到臘花誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

    將接種后的臘花外植體在培養(yǎng)架中進(jìn)行培養(yǎng),其培養(yǎng)的溫度為(23±2)℃,光強(qiáng)為1500~2000 lx,光照時(shí)間為12~14 h/d。在培養(yǎng)的過(guò)程中每隔7天觀察一次培養(yǎng)瓶中苗的生長(zhǎng)狀況,誘導(dǎo)培養(yǎng)30天后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,增殖培養(yǎng)45天后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,生根培養(yǎng)60天后對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析,篩選出最適宜臘花生長(zhǎng)的誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基。

    1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用單因素方差分析和Duncan’s多重比較分析不同處理之間的差異,差異顯著性水平為P=0.05。所有的統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 24中完成。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同激素(KT、NAA)濃度組合對(duì)臘花誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

    由表1可見(jiàn),不同濃度的激素(KT、NAA)濃度組合對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響有差異。當(dāng)KT 3 mg/L、NAA 0.2 mg/L(A5處理)時(shí),在此濃度組合下誘導(dǎo)效果是最理想的,發(fā)生個(gè)數(shù)達(dá)到16個(gè),發(fā)生率達(dá)到88.83%,植株生長(zhǎng)健壯,葉色為深綠色;A5與A1、A4、A6對(duì)比,雖然A1、A4、A6植株生長(zhǎng)健壯,但是發(fā)生數(shù)和發(fā)生率不理想;A2、A3植株生長(zhǎng)較為緩慢,但是苗生長(zhǎng)健壯,有一定的利用價(jià)值;A7、A8雖然發(fā)生率不低,但是苗生長(zhǎng)緩慢,且植株矮小細(xì)弱;A9、A10、A11苗生長(zhǎng)緩慢且矮小細(xì)弱,出現(xiàn)玻璃化苗的情況,3個(gè)處理誘導(dǎo)出的苗基本無(wú)利用價(jià)值。

    表1 風(fēng)蠟花誘導(dǎo)培養(yǎng)基(KT和NAA濃度配比)研究結(jié)果

    激素KT、NAA在中等水平對(duì)臘花誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最有利。處理A1~A3 KT濃度不斷上升,但是NAA濃度較低,臘花誘導(dǎo)效果都不理想;A4、A6、A7濃度梯度比較接近中等水平,誘導(dǎo)率處于中等水平;A8、A9處理,隨著激素濃度梯度不斷增大,發(fā)生率下降;A10、A11培養(yǎng)基中不添加KT、NAA,誘導(dǎo)率最低。激素濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于臘花的誘導(dǎo)培養(yǎng),在激素KT濃度 2、3、4 mg/L,NAA 濃度 0.1、0.2、0.3 mg/L,KT:NAA為3:1時(shí),臘花誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最好。

    2.2 不同激素(6-BA、NAA)濃度組合對(duì)臘花增殖培養(yǎng)效果的影響

    由表2可得,不同激素(6-BA、NAA)濃度組合對(duì)臘花增殖效果有顯著不同。6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L(B2處理)時(shí),增殖效果最為理想,增殖系數(shù)達(dá)到3.6倍,增殖倍數(shù)達(dá)到4.17倍,植株生長(zhǎng)健壯,芽較多,葉色深綠色;B3、B4處理雖然增殖系數(shù)和增殖倍數(shù)較高,但是植株生長(zhǎng)細(xì)弱、葉色淺綠,不是特別理想;B1、B7處理植株生長(zhǎng)健壯、葉色深綠,表現(xiàn)為中等水平,增殖系數(shù)和倍數(shù)較B2處理低,但增殖的苗可以利用,其中,B1有一部分苗生長(zhǎng)欠佳,但是B7的苗相對(duì)于B1來(lái)看生長(zhǎng)健壯、葉色深綠,則B7比B1增殖效果稍好;B5、B6、B10處理增殖系數(shù)、增殖倍數(shù)都較低,但是增殖苗生長(zhǎng)健壯,葉色深綠、營(yíng)養(yǎng)充足,增殖苗可利用;B3、B4處理雖然增殖系數(shù)以及增殖倍數(shù)都較高,但是增殖苗長(zhǎng)勢(shì)較弱,葉色不正,增殖苗營(yíng)養(yǎng)不良;增殖效果最差的是B8、B9、B11處理,增殖系數(shù)比較低,而且苗幾乎不生長(zhǎng),45天增殖苗已經(jīng)開(kāi)始老化,B11增殖倍數(shù)在所有處理中最高,但是增殖苗植株微型化、玻璃花,培育的苗無(wú)利用價(jià)值。

    表2 臘花叢生芽增殖培養(yǎng)基(6-BA和NAA不同濃度配比)研究結(jié)果

    當(dāng)6-BA濃度過(guò)高、NAA濃度低有利于芽的分化,但不利于芽的生長(zhǎng);當(dāng)6-BA濃度過(guò)低、NAA濃度過(guò)高不利于芽的分化,但能促進(jìn)芽的生長(zhǎng)。只有6-BA:NAA=10:1時(shí),既能促進(jìn)芽的分化又有利于幼芽的生長(zhǎng),獲得好的增殖苗。

    2.3 不同濃度的IBA對(duì)臘花生根效果的影響

    由表3可知,激素IBA濃度為0.6 mg/L(C3處理)時(shí),臘花生根培養(yǎng)效果最佳,接種的無(wú)菌苗生根率100%,平均每株生根條數(shù)為6.84條,平均根長(zhǎng)為6.86 cm,植株生根時(shí)間最早,且生長(zhǎng)健壯、葉色深綠。C2、C4處理生根數(shù)中等,植株生長(zhǎng)健壯,但是C4比C2生根時(shí)間晚,且長(zhǎng)勢(shì)稍弱。較為一般的是C1處理,植株生長(zhǎng)健壯,葉色深綠,但是生根時(shí)間較晚,且單株生根數(shù)較少。處理CK生根時(shí)間較晚,且平均每株生根數(shù)較少,此處理不適合生根培養(yǎng)。激素IBA濃度為0.6 mg/L最適宜臘花的生根培養(yǎng),IBA濃度過(guò)高或過(guò)低都達(dá)不到最佳的生根效果。從表中可以看出,不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑無(wú)菌苗也能生根,但是根系細(xì)小,植株矮小,營(yíng)養(yǎng)不良,不利于生根培養(yǎng)。

    表3 不同濃度的IBA對(duì)臘花生根效果的研究結(jié)果

    3 結(jié)論

    (1)在臘花誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,最適宜臘花誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為MS+KT 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L+瓊脂6.2 g/L+蔗糖30 g/L,pH 5.8,發(fā)生率達(dá)到88.8%,苗生長(zhǎng)健壯,長(zhǎng)勢(shì)良好,葉色深綠。

    (2)在臘花增殖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,最適宜臘花增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.2 g/L,pH 5.8,增殖系數(shù)達(dá)到3.6倍,增殖倍數(shù)達(dá)到4.2倍,植株生長(zhǎng)健壯,葉色深綠。

    (3)在臘花生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,最適宜臘花生根培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA0.6 mg/L+瓊脂6.2 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭0.1 g/L,pH 5.8,最早生根時(shí)間為15天,平均每株生根數(shù)為6.8條,平均根長(zhǎng)為6.9 cm,,生根率100%,植株生長(zhǎng)健壯,葉色深綠。

    4 討論

    臘花組織培養(yǎng)常用的外植體有莖尖、芽、莖段、葉片、花粉。一般幼嫩的組織材料褐變相對(duì)于較老化的組織材料來(lái)說(shuō)較輕;另外,減小組織切口面積以及縮短組織暴露在空氣中的時(shí)間有利于減輕褐化。在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和活性炭等都可以有效預(yù)防褐化的發(fā)生。有效的預(yù)防組織褐化方法有5種。(1)選擇適宜的外植體,一般以臘花的嫩莖、頂芽最為理想;(2)加入抗氧化劑或吸附劑,能有效減少褐化;(3)連續(xù)轉(zhuǎn)移外植體,對(duì)于新接種的外植體,將其快速轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上2~3次,在某些情況下可以減輕褐化,這段時(shí)間外植體的切口愈合,外滲停止;(4)對(duì)外植體進(jìn)行消毒預(yù)處理;(5)給接種后的外植體適宜的暗處理。

    錢(qián)仲秀等[4]以嫩莖為外植體,加入0.7%的PVP(聚乙烯聚吡氯烷酮)能有效防止褐變,平均發(fā)生率高達(dá)80%,最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA 0.5 mg/L,平均每株生根數(shù)4~5條,生根率為77.8%。本實(shí)驗(yàn)加入了0.1 g/L的活性炭,增強(qiáng)了培養(yǎng)基的吸附能力,更有利于臘花植株的生長(zhǎng)。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,IBA濃度過(guò)高或過(guò)低對(duì)臘花生根培養(yǎng)都無(wú)優(yōu)勢(shì),IBA0.6 mg/L最適宜臘花的生根培養(yǎng)。

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