心房顫動病人血漿外泌體miR-320d表達(dá)與心房纖維化程度及復(fù)發(fā)的關(guān)系

周曉蘭，楊 帆，徐大春，黃建飛，盧 毅，劉建云

心房顫動是一種常見的心律失常，且發(fā)病率逐年升高，病人致死率和致殘率增加。有研究顯示，心房顫動的發(fā)生和維持與心房病理生理改變密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為心房重構(gòu)，心房纖維化是結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要特征[1]。心房纖維化是指細(xì)胞外基質(zhì)中膠原含量增加或(和)膠原成分發(fā)生改變，特征為心臟成纖維細(xì)胞合成增加，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過度沉積，導(dǎo)致心肌細(xì)胞外基質(zhì)纖維化[2]。近年來，導(dǎo)管射頻消融術(shù)已成為治療心房顫動的重要方法，但病人術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，需要再次消融比例為20%～30%[3]。miRNA是一類在生物進(jìn)化上高度保守的內(nèi)生性小分子單鏈RNA，近年來多種miRNA被發(fā)現(xiàn)在心房顫動病人心房纖維化過程中異常表達(dá)，且與心房纖維化程度有關(guān)。miR-320d是miR-320家族中的一員，近年來對miR-320家族的研究逐漸增多，膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中miR-320d表達(dá)顯著降低，過表達(dá)miR-320d可抑制癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲[4]。

B細(xì)胞淋巴瘤病人低表達(dá)miR-320d提示有較短的生存期[5]。miR-320d與癌癥關(guān)系的研究較多，但對心肌細(xì)胞的影響較少，外泌體是細(xì)胞外囊泡中的一種亞群，可在心肌細(xì)胞間充當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，近年來外泌體在心血管系統(tǒng)中的作用越來越受到重視。本研究檢測心房顫動病人血漿外泌體miR-320d表達(dá)水平，分析miR-320d與心房顫動病人心房纖維化程度及復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2020年7月南通市第六人民醫(yī)院收治的心房顫動病人108例作為研究組，其中男57例，女51例，年齡(56.13±10.02)歲；選取同期入院體檢的健康體檢者100名作為對照組，其中男52名，女48名，年齡(55.43±8.94)歲。病人納入標(biāo)準(zhǔn)：入院時(shí)行標(biāo)準(zhǔn)12導(dǎo)聯(lián)心電圖診斷為心房顫動；既往無心房顫動消融術(shù)病史；臨床資料完整；所有病人均知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并急性或終末期肝病、嚴(yán)重慢性阻塞性肺疾病、急性冠脈綜合征；合并惡性腫瘤；合并甲狀腺功能異常等自身免疫性疾病；安裝起搏器病人，嚴(yán)重心動過速或心動過緩。

1.2 研究試劑與儀器 Serum/plasma micro kit試劑(博奧派克，貨號：555000)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號：TR102-01/02)、Ⅰ型膠原羧基端前肽(PⅠCP)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號：EH0957)、Ⅲ型前膠原多肽(PⅢNP)ELISA試劑盒(上海鑫樂生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號：xl-Eh0453)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)ELISA試劑盒(南京賽鴻瑞生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號：SEA097Ov02)。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集與保存 采集所有研究對象空腹靜脈血4 mL，使用含EDTA-K2的真空采血管抗凝，以3 000 g離心5 min，分離血漿，將分離后的血漿轉(zhuǎn)移至無菌無酶的EP管中，置于-80 ℃保存。使用外泌體提取試劑盒提取血漿標(biāo)本中的外泌體，用于RNA提取。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測血清miR-320d水平 通過miRNeasy serum/plasma micro kit(博奧派克，美國)試劑提取血漿外泌體RNA，所有步驟均在冰上操作，預(yù)防RNA降解。采用試劑盒檢測血漿外泌體中miR-320d表達(dá)水平，取1 μg RNA按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，加入SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s變性；60 ℃ 1 min退火延伸，45個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，以U6作為內(nèi)參，以2-△△ct計(jì)算miR-320d的相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列(5′-3′)

1.3.3 超聲心動圖 采用多普勒超聲診斷儀對研究對象行心臟超聲心動圖檢查，包括左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic dimension，LVEDD)、左房內(nèi)徑(left atrial diameter，LAD)及左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.3.4 心房纖維化血清標(biāo)記物 采用ELISA檢測所有研究對象心房纖維化血清生化標(biāo)記物PⅠCP、PⅢNP、MMP-1水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒購自美國R&D Systems公司。

1.3.5 心房纖維化程度 按照心房顫動相關(guān)指南[6]中的環(huán)肺靜脈電隔離導(dǎo)管射頻消融術(shù)原則及方法，在CARTO-3三位標(biāo)測系統(tǒng)下構(gòu)建左房和各肺靜脈口三維電解剖圖，記錄左房前壁、后壁、頂部和間隔部電壓，重建左房電壓圖。記錄接觸壓力標(biāo)測圖(采點(diǎn)壓力5～10 g)，術(shù)中連續(xù)記錄肺靜脈等腔內(nèi)點(diǎn)位，消融導(dǎo)管阻抗、溫度、功率等，在CARTO-3標(biāo)測系統(tǒng)指導(dǎo)下實(shí)時(shí)顯示消融導(dǎo)管的接觸壓力(CF)，導(dǎo)管消融閾值為最大移動穩(wěn)定范圍2 mm，最小時(shí)間3 s，最小壓力6 g，常規(guī)設(shè)置FT1>300 g·s進(jìn)行標(biāo)測。消融順序：按照左側(cè)肺靜脈環(huán)形消融、右側(cè)肺靜脈環(huán)形消融、左房頂部線及二尖瓣峽部線消融、驗(yàn)證房頂線阻滯；定義正常心內(nèi)膜電壓振幅>1.5 mV，心內(nèi)膜低電壓<0.5 mV區(qū)域?yàn)镃ARTO圖像纖維化區(qū)域，根據(jù)CARTO左心房點(diǎn)解剖圖像，中線及二尖瓣將前后壁分為8個(gè)象限，≤2個(gè)象限出現(xiàn)低血壓為輕度心房纖維化，≥3個(gè)象限出現(xiàn)低電壓為重度心房纖維化。

1.3.6 隨訪 采取門診復(fù)查方式對病人進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為12個(gè)月，復(fù)查心臟彩色超聲心動圖及24 h動態(tài)心電圖，根據(jù)復(fù)查結(jié)果將心房顫動病人分為復(fù)發(fā)組(44例)和未復(fù)發(fā)組(64例)。

2 結(jié) 果

2.1 研究組和對照組血漿外泌體miR-320d表達(dá)與心功能指標(biāo)比較 與對照組比較，研究組血漿外泌體miR-320d表達(dá)水平和LVEF降低，LAD增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見表2。

表2 研究組和對照組血漿外泌體miR-320d表達(dá)與心功能指標(biāo)比較(±s)

2.2 血漿外泌體miR-320d表達(dá)水平與心房纖維化的關(guān)系 根據(jù)心房顫動病人血漿外泌體miR-320d表達(dá)水平分為miR-320d高表達(dá)組(56例)和miR-320d低表達(dá)組(52例)。與miR-320d高表達(dá)組比較，miR-320d低表達(dá)組心房纖維化程度、PⅠCP、PⅢNP、MMP-1水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見表3。

表3 不同血漿外泌體miR-320d表達(dá)水平病人心房纖維化指標(biāo)比較

2.3 不同復(fù)發(fā)情況病人臨床資料比較 復(fù)發(fā)組高血壓、重度心房纖維化比例高于未復(fù)發(fā)組(P<0.01)，miR-320d表達(dá)水平低于未復(fù)發(fā)組(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表4。

表4 不同復(fù)發(fā)情況病人臨床資料比較

2.4 心房顫動病人術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示：高血壓、重度心房纖維化、miR-320d水平是心房顫動病人術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 心房顫動病人術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素分析

2.5 血漿外泌體miR-320d對心房顫動復(fù)發(fā)的預(yù)測價(jià)值 ROC結(jié)果顯示，miR-320d預(yù)測心房顫動病人術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線下面積(AUC)為0.799，95%CI[0.716，0.881]，靈敏度為77.3%，特異度為70.3%。詳見圖1。

圖1 miR-320d對心房顫動復(fù)發(fā)診斷價(jià)值的ROC曲線

3 討 論

心房顫動是全球范圍內(nèi)常見的心律失常，確切的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，心房纖維化、氧化應(yīng)激等均是心房顫動發(fā)生的相關(guān)因素[7]。持續(xù)的心房顫動可能引起心房結(jié)構(gòu)改變，如心房心肌肥大、細(xì)胞排列紊亂及心肌間質(zhì)纖維化等，稱為心房結(jié)構(gòu)性重構(gòu)，最終導(dǎo)致心房擴(kuò)大[8]。心房纖維化作為心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的標(biāo)志性改變，是心房顫動發(fā)生和維持的基礎(chǔ)，結(jié)締組織纖維化過程包括纖維成分變化和重新分布，心肌實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡和被替代，這一過程既是對受損傷部位的修復(fù)過程，也是調(diào)節(jié)心肌幾何結(jié)構(gòu)適應(yīng)新的生理功能狀態(tài)，減少新的機(jī)械、化學(xué)及電刺激過程[9]。心房顫動病人心房纖維化可增加遠(yuǎn)期心腦血管病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[10]，因此，對心房纖維化程度的判斷可預(yù)測心房顫動復(fù)發(fā)。

miR-320d屬于miR-320家族成員，定位于13號染色體(13q14.11)，miR-320家族編碼基因較少發(fā)生變異[11]。有研究表明，其與多種腫瘤有密切關(guān)系，miR-320在一些腫瘤中可抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展，但在某些腫瘤中又促進(jìn)腫瘤生長[12]。有研究顯示，miR-320b是頸動脈粥樣硬化和易損斑塊的特異性血清標(biāo)志物[13]。miR-320d已證實(shí)是主動脈夾層的生物標(biāo)志物，可調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞凋亡[14]。另有研究證實(shí)，miR-320d在心房顫動小鼠中表達(dá)降低，其低表達(dá)與心房顫動心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[15]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，研究組血漿外泌體miR-320d表達(dá)水平、LVEF降低，LAD增大。提示血漿外泌體中miR-320d可能參與心房顫動發(fā)生，且心房顫動病人LAD增大，左心房增大，存在心房纖維化。同時(shí)結(jié)果顯示，與miR-320d高表達(dá)組相比，miR-320d低表達(dá)組心房纖維化程度、PⅠCP、PⅢNP、MMP-1水平升高。提示miR-320d低表達(dá)與重度心房纖維化有關(guān)，心房纖維化血清生物標(biāo)志物水平升高提示心房纖維化程度加重，miR-320d可抑制心肌細(xì)胞凋亡，其低表達(dá)引起心肌細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞活力降低，參與心房纖維化的發(fā)展過程。復(fù)發(fā)組高血壓、重度心房纖維化比例高于未復(fù)發(fā)組，miR-320d表達(dá)水平低于未復(fù)發(fā)組，提示miR-320d水平與病人預(yù)后有關(guān)，miR-320d低表達(dá)、高血壓、重度心房纖維化可能提示心房顫動病人術(shù)后復(fù)發(fā)高風(fēng)險(xiǎn)。Logistic回歸分析結(jié)果顯示：高血壓、重度心房纖維化、miR-320d水平是心房顫動病人術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，表明miR-320d低表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)，應(yīng)關(guān)注miR-320d低表達(dá)、高血壓及重度心房纖維化病人預(yù)后情況。ROC結(jié)果顯示：miR-320d診斷心房顫動病人術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC為0.799，靈敏度為77.3%，特異度為70.3%，提示血漿外泌體miR-320d表達(dá)水平對心房顫動病人術(shù)后復(fù)發(fā)具有一定預(yù)測價(jià)值，可作為預(yù)測心房顫動病人術(shù)后復(fù)發(fā)的潛在生物學(xué)標(biāo)志。

綜上所述，心房顫動病人血漿外泌體miR-320d呈低表達(dá)，miR-320d低表達(dá)與重度心房纖維化及病人術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，是心房顫動復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，miR-320d對心房顫動病人術(shù)后復(fù)發(fā)具有一定預(yù)測價(jià)值，可作為預(yù)測病人預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志。本研究存在不足，對miR-320d分子層面的作用機(jī)制尚未涉及，仍需進(jìn)一步進(jìn)行深入探討。