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    一種改良的土壤線蟲(chóng)分離方法的效果評(píng)估

    2022-07-07 07:19:54陳玉秀王婭娟趙成法
    大理大學(xué)學(xué)報(bào) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:改良法貝爾曼篩網(wǎng)

    陳玉秀,王婭娟,張 發(fā),趙成法*

    (1.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院,云南大理 671003;2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,云南大理 671003)

    土壤線蟲(chóng)是指生活史的某個(gè)階段或終生生活于土壤中的線蟲(chóng),是土壤中最為豐富且生態(tài)功能最重要的動(dòng)物之一〔1-2〕。根據(jù)其生活方式差異可分為腐生線蟲(chóng)、食微生物線蟲(chóng)和寄生線蟲(chóng)。這類動(dòng)物具有個(gè)體小、種類多、繁殖快、比表面積大和代謝快的特點(diǎn)〔2-3〕,在土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)和能量循環(huán)等生態(tài)過(guò)程中扮演著重要的角色〔1,4-5〕,同時(shí)由于對(duì)土壤因子的改變極為敏感,其多樣性和豐富度不僅是衡量整個(gè)土壤生態(tài)系統(tǒng)狀況的重要指標(biāo),也是農(nóng)田土壤健康與否的主要評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)之一〔3,6-7〕。土壤植物寄生線蟲(chóng)就危害程度而言僅次于植物病原微生物的病原體,也是眾多科研工作者研究的重點(diǎn)對(duì)象〔8-10〕。如何準(zhǔn)確、快速地將線蟲(chóng)從土壤中分離出來(lái)是相關(guān)研究不可避免的基礎(chǔ)問(wèn)題,一個(gè)可靠、高效的分離方法是相關(guān)研究成功與否的關(guān)鍵。

    目前常用的土壤線蟲(chóng)分離方法主要有淺盤法、貝爾曼漏斗法和LUDOX TM 懸浮法等〔11-12〕。其中LUDOX TM 懸浮法雖具有較好的分離率,但操作繁瑣、成本較高,很難大規(guī)模使用。淺盤法操作簡(jiǎn)便、成本較低,但因其僅利用線蟲(chóng)的親水性進(jìn)行分離,導(dǎo)致分離率較低,難以用于精確的定量研究〔13〕。與淺盤法相比,貝爾曼漏斗法不僅利用線蟲(chóng)的親水性使之從土壤中游離出來(lái),而且在重力作用下下沉到收集管,使分離率有所提高,是目前使用最多的方法〔13〕,但該分離方法依然無(wú)法滿足定量研究的需要〔14〕。

    本研究在改良貝爾曼漏斗法〔15-16〕(簡(jiǎn)稱“改良法1”)的基礎(chǔ)上再次進(jìn)行改良(簡(jiǎn)稱“改良法2”),并對(duì)線蟲(chóng)分離率等進(jìn)行評(píng)估,旨在探索更簡(jiǎn)便、高效和低成本的土壤線蟲(chóng)分離方法。

    1 材料和方法

    1.1 儀器與材料高壓蒸氣滅菌鍋(致微(廈門)儀器有限公司);恒溫培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司);電子天平(上海光正醫(yī)療儀器有限公司);體式顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司);微量移液器(熱電(上海)儀器有限公司);培養(yǎng)皿(上海五一玻璃儀器廠);30、35、120、500 目(φ=65 mm)圓形不銹鋼濾網(wǎng)(紹興市上虞區(qū)豪泉篩具廠);三角漏斗(φ=90 mm)、錐形瓶、燒杯(上海申立玻璃儀器銷售有限公司);瓊脂、葡萄糖、液體硅膠(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)。

    全齒復(fù)活線蟲(chóng)(Panagrellus Redivivus)由大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院種質(zhì)資源庫(kù)提供;土壤采集自大理大學(xué)后山茶園,除去大顆粒后,取部分進(jìn)行間歇式高壓蒸氣滅菌處理(121 ℃、30 min)后備用。

    1.2 方法

    1.2.1 線蟲(chóng)及土壤處理方法 全齒復(fù)活線蟲(chóng)經(jīng)燕麥培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)6 d 后,采用貝爾曼漏斗法分離備用。

    人工添加定量線蟲(chóng)土壤樣品:土壤經(jīng)高壓滅菌,去除原有線蟲(chóng)。稱取土壤樣品15 份,每份10 g,體視顯微鏡下用移液器在每份樣品中準(zhǔn)確加入150條線蟲(chóng)。

    自然農(nóng)田土壤樣品(含不定量線蟲(chóng)):稱取未滅菌土壤樣品15 份,每份5 g。

    1.2.2 不同分離方法線蟲(chóng)分離率的測(cè)定 用人工添加定量線蟲(chóng)的土壤樣品,按以下不同方法分離土壤線蟲(chóng),記數(shù)并計(jì)算分離率,每種方法重復(fù)3 次。

    線蟲(chóng)分離率= (分離出的線蟲(chóng)數(shù)/總線蟲(chóng)數(shù))×100%。

    淺盤法:參照毛小芳等〔13〕報(bào)道的土壤線蟲(chóng)分離方法,并在其基礎(chǔ)上將淺盤改為培養(yǎng)皿,篩網(wǎng)和擦鏡紙換為1 層80 目尼龍紗網(wǎng)和2 層擦鏡紙。

    貝爾曼漏斗法:按文獻(xiàn)〔16〕的土壤線蟲(chóng)分離方法進(jìn)行分離。

    LUDOX TM 懸浮法〔14〕:將土壤樣品放入燒杯加入100 mL 沸水,冷卻后倒入35 目篩網(wǎng)(下接120目、500 目篩網(wǎng))組合中,用流水緩慢沖洗至水流澄清。依次移除35 目和120 目篩網(wǎng)后,再用流水將500 目篩網(wǎng)內(nèi)物質(zhì)緩慢沖洗至流水澄清,最后用密度為1.18 g/mL 的硅膠溶液將500 目篩網(wǎng)內(nèi)的物質(zhì)完全沖至500 mL 燒杯中,攪拌均勻后靜置1.5 h,將燒杯中的上清液再次倒回500 目篩網(wǎng),留在篩網(wǎng)上的物質(zhì)用流水完全沖至樣品瓶中即為土壤線蟲(chóng)濾液。重復(fù)3 次操作后將線蟲(chóng)濾液混合并計(jì)數(shù)。

    改良法1:參照鐘雪超〔16〕報(bào)道的土壤線蟲(chóng)分離方法,在該方法的基礎(chǔ)上修改而成,漏斗與紗網(wǎng)間增加不銹鋼網(wǎng)篩以支撐樣品。

    改良法2:由改良法1 進(jìn)一步調(diào)整改良。主要區(qū)別在于:(1)在乳膠收集管末端注入1~2 mL 含0.04 g/mL 葡萄糖的瓊脂以定向吸引線蟲(chóng);(2)將整個(gè)裝置置于27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中以增強(qiáng)線蟲(chóng)的活力〔17〕。裝置見(jiàn)圖1。

    圖1 貝爾曼漏斗改良法2 操作裝置

    1.2.3 不同分離方法測(cè)定自然農(nóng)田土壤線蟲(chóng)分離的數(shù)量 按“1.2.2”項(xiàng)下方法分離和測(cè)定含不定量線蟲(chóng)的自然農(nóng)田土壤中線蟲(chóng)的數(shù)量,每種方法重復(fù)3 次。

    1.2.4 不同分離方法分離時(shí)長(zhǎng)與成本估算 記錄本研究的3 位參與者獨(dú)立完成1 份土壤樣品處理的實(shí)際操作時(shí)長(zhǎng)即為操作耗時(shí)。分離成本為一次性耗材(擦鏡紙、葡萄糖、瓊脂、液體硅膠等)成本,按照市場(chǎng)價(jià)進(jìn)行估算。

    1.3 數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)用Excel 軟件進(jìn)行整理,用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同分離方法線蟲(chóng)分離率以人工添加定量線蟲(chóng)的土壤樣品為實(shí)驗(yàn)材料,淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1、改良法2 和LUDOX TM 懸浮法的分離 率 分 別 為(61.77±2.20)%、(72.44±1.37)%、(80.66±1.09)%、(94.89±2.27)%、(91.11±2.20)%。與其他4 種方法相比,改良法2 對(duì)線蟲(chóng)的分離率分別提高了33.12%、22.45%、14.23%和3.78%。改良法2與淺盤法、貝爾曼漏斗法和改良法1 相比,線蟲(chóng)分離率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    2.2 不同分離方法線蟲(chóng)分離數(shù)量以自然農(nóng)田土壤樣品(含不定量線蟲(chóng))為實(shí)驗(yàn)材料,淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1、改良法2 和LUDOX TM 懸浮法分離得到的線蟲(chóng)數(shù)量分別為(53.00±3.27)、(71.00±2.05)、(83.00±1.63)、(92.00±2.05)、(92.00±3.30)條。與淺盤法、貝爾曼漏斗法和改良法1 等三種方法相比,改良法2 分離出的線蟲(chóng)數(shù)量分別增加了39、21、9 條,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.3 不同分離方法的耗時(shí)與成本操作單份樣品時(shí),淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1 和改良法2 均可在5 min 內(nèi)完成,LUDOX TM 懸浮法則需30~45 min;在分離成本方面,淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1 和改良法2 分離1 份樣品的成本均在1.0 元以內(nèi),而LUDOX TM 懸浮法的分離成本為7.5 元。結(jié)合線蟲(chóng)分離率,改良法2 在操作耗時(shí)與成本方面具備更多優(yōu)勢(shì)。見(jiàn)表1。

    表1 不同分離方法的操作耗時(shí)和成本

    3 討論

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,改良法2 和LUDOX TM 懸浮法的線蟲(chóng)分離率無(wú)顯著差異,但顯著高于其他3 種方法(P<0.01)。LUDOX TM 懸浮法是蔗糖懸浮法的改進(jìn)〔18〕,其分離原理相似,均利用蟲(chóng)體與溶液的密度差進(jìn)行分離〔15〕,但LUDOX TM 懸浮法很好地克服了高滲溶液易使蟲(chóng)體脫水變形,不利于后續(xù)線蟲(chóng)鑒定的缺點(diǎn)〔11,14,19〕。與改良法2 相比,LUDOX TM懸浮法在過(guò)篩懸浮前需加入熱水,通過(guò)高溫殺死土壤中的線蟲(chóng),因此該方法不能區(qū)分土壤中的線蟲(chóng)活體與死體,對(duì)于需計(jì)數(shù)活體線蟲(chóng)或需做后續(xù)活體線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)的研究不適用,加之該方法較為繁瑣,操作耗時(shí)和成本較高,不宜大規(guī)模使用。而改良法2 具有操作簡(jiǎn)便、操作耗時(shí)少、成本低且分離出的線蟲(chóng)大部分為活體的優(yōu)點(diǎn),是LUDOX TM 懸浮法較好的替代方法。

    貝爾曼漏斗法利用線蟲(chóng)親水性使之從土壤中游離出來(lái),然后在重力的作用下下沉到收集管中而達(dá)到分離線蟲(chóng)的目的。該方法具有操作簡(jiǎn)便、分離出的線蟲(chóng)懸液雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn),是眾多線蟲(chóng)研究者最常用的方法〔12,14〕。但由于該方法在操作時(shí)擦鏡紙等過(guò)濾層會(huì)緊貼于漏斗內(nèi)壁,增加了漏斗壁上的線蟲(chóng)存留,不利于線蟲(chóng)的下沉。因此對(duì)該方法進(jìn)行了改良,產(chǎn)生了改良法1。該方法以圓形不銹鋼篩網(wǎng)支撐樣品,一方面減少了漏斗壁上的線蟲(chóng)存留,另一方面增加了樣品與水的接觸面積,從而提高了線蟲(chóng)分離率〔15-16〕。在此基礎(chǔ)上,基于24~30 ℃是線蟲(chóng)活力最強(qiáng)的溫度的理論〔17〕和線蟲(chóng)的趨化特性,改良法2 在收集管的末端加入了葡萄糖瓊脂定向吸引線蟲(chóng),同時(shí)將整個(gè)分離裝置置于27 ℃環(huán)境下增加線蟲(chóng)的活力,使之更快地從土壤中游離出來(lái)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,改良法2 雖然略微增加了操作耗時(shí)和成本,但對(duì)線蟲(chóng)的分離率明顯高于改良法1,是改良法1 良好的替代方法。

    基于改良法2 的分離原理,由于不同類型的線蟲(chóng)對(duì)物質(zhì)的趨化性不同,當(dāng)需要分離某一特定類群時(shí)需對(duì)添加的趨化物做一定的調(diào)整。如CuSO4對(duì)甜菜孢囊線蟲(chóng)的二齡幼蟲(chóng)有極強(qiáng)的吸引作用〔20〕;秀麗隱桿線蟲(chóng)對(duì)氯化鈉或異戊醇均有趨向性,且化學(xué)趨向性隨著溫度的增加而增強(qiáng)〔21〕。因此,在實(shí)際操作中可根據(jù)需求,選擇相應(yīng)的趨化物來(lái)提高對(duì)特定線蟲(chóng)的分離率。

    4 結(jié)論

    改良法2 是在改良法1 基礎(chǔ)上改進(jìn)得到的,其繼承了改良法1 操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),在穩(wěn)定環(huán)境溫度提高線蟲(chóng)游離速度的基礎(chǔ)上,通過(guò)趨化物的定向吸引使線蟲(chóng)分離率得到提高。無(wú)論是基于分離率還是操作耗時(shí)及成本方面的考量,改良法2 均具備明顯優(yōu)勢(shì),有較高應(yīng)用價(jià)值。

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