改良法處理人脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果及其與體外細(xì)胞的相容性研究

鄧霞　鐘惠蘭

[摘要]目的：研究經(jīng)改良法處理后的人脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果及其與體外細(xì)胞的相容性。方法：分別使用傳統(tǒng)方法與改良方法脫去健康人皮膚的細(xì)胞成分，觀察兩種方法制備的脫細(xì)胞真皮的外觀、HE染色結(jié)果、脫細(xì)胞效率、膠原纖維的完整度、體外降解時(shí)間、孔隙率、孔腔直徑、細(xì)胞毒性及體外細(xì)胞相容性，并進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果：改良法制備的脫細(xì)胞真皮柔韌度更好，塑形性更高;經(jīng)HE染色后，改良法制備的真皮孔隙均勻、結(jié)構(gòu)疏松、膠原纖維較傳統(tǒng)方法更為纖細(xì);改良法制備的脫細(xì)胞真皮的孔隙率及真皮網(wǎng)狀面孔隙直徑均優(yōu)于傳統(tǒng)方法，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;兩組脫細(xì)胞真皮的基底層孔隙直徑及體外降解時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;改良方法制備的脫細(xì)胞真皮8d內(nèi)連續(xù)檢測結(jié)果均顯示無細(xì)胞毒性。經(jīng)改良法制備的脫細(xì)胞真皮上的干細(xì)胞浸潤基底層，且浸潤范圍隨時(shí)間增加而擴(kuò)大，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而傳統(tǒng)方法制備的脫細(xì)胞真皮無明顯浸潤現(xiàn)象。結(jié)論：改良方法不僅操作簡單，且制備的脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果較好，無細(xì)胞毒性，體外相容性更佳。

[關(guān)鍵詞]脫細(xì)胞真皮;相容性;改良法;體外細(xì)胞;孔隙率

[中圖分類號(hào)]R329.2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）10-0102-03

Abstract： Objective? To study the acellular effect of human acellular dermis treated by modified method and its compatibility with cells in vitro. Methods The appearance， HE staining results， acellular efficiency， integrity of collagen fibers， degradation time in vitro， porosity， pore diameter， cytotoxicity and cytocompatibility of acellular dermis prepared by the two methods were observed and compared. Results? The modified acellular dermis had better flexibility and higher plasticity. After HE staining， the improved acellular dermis had uniform pore， loose structure and finer collagen fibers than the traditional method. The porosity and pore diameter of the acellular dermis prepared by the improved method were better than the traditional method， and the difference between the two groups was significant （P<0.05）. There was no significant difference in basal pore diameter and degradation time in vitro （P>0.05）. The acellular dermis prepared by the improved method showed no cytotoxicity within 8 days. Stem cells infiltrated the basal layer of the acellular dermis prepared by the improved method， and the infiltration range increased with time， and the number of cells increased significantly. However， the acellular dermis prepared by the traditional method had no obvious infiltration. Conclusion? The modified method is not only simple in operation， but also has better acellular effect， no cytotoxicity and better compatibility in vitro.

Key words： acellular dermis; compatibility; improved method; in vitro cell; porosity

無論是天然牙還是種植牙，牙齦缺損、過窄或過薄，都對(duì)美觀性產(chǎn)生影響，且不利于牙周健康。而脫細(xì)胞真皮是一種很好的牙齦替代物，能夠修復(fù)或重建天然牙、種植牙及義齒周圍牙齦的寬度及厚度[1]，幫助患者重新恢復(fù)功能及美觀性。脫細(xì)胞真皮是一種僅具有真皮基質(zhì)，且完整保留了細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)及形態(tài)、成分及基底膜等，為種子細(xì)胞的生長與分化提供所需環(huán)境的理想的支架材料[2]。脫細(xì)胞真皮能夠?qū)⒐w皮膚中易引起排斥反應(yīng)的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等成分脫出，僅保存完整的低抗原性細(xì)胞外基質(zhì)成分，且其獨(dú)有的三維結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供了一個(gè)生長代謝的立體框架，使細(xì)胞外基質(zhì)蛋白能促進(jìn)表皮細(xì)胞的附著與增生，促進(jìn)細(xì)胞相容性，使組織的生理性修復(fù)得到完成[3]。研究顯示，脫細(xì)胞真皮具有良好的生物相容性、極低的抗原性、快速血管化及較高穩(wěn)定性的特點(diǎn)[4]，能夠促進(jìn)機(jī)體表皮的再生及修復(fù)[5]。生物相容性是生物材料貫穿始終的主題，對(duì)生物醫(yī)用材料而言，脫細(xì)胞真皮的生物相容性直接決定了材料的應(yīng)用效果。脂肪干細(xì)胞是組織工程中廣泛應(yīng)用的一種種子細(xì)胞[6]。Ribeiro等使用異種脫細(xì)胞真皮對(duì)拔牙后的軟組織創(chuàng)面進(jìn)行修補(bǔ)，取得良好效果[7]。Basegmez等研究結(jié)果顯示，脫細(xì)胞真皮不僅不影響種植體與骨的結(jié)合，且手術(shù)創(chuàng)傷小、修復(fù)效果及美觀性良好[8]。但現(xiàn)有的脫細(xì)胞真皮方法復(fù)雜，且盡管去除了毛發(fā)、腺體、血管后，殘留有部分腔隙，但是孔隙率仍較低，細(xì)胞滲透性差，影響宿主細(xì)胞及血管的生長。本次實(shí)驗(yàn)采用改良方法進(jìn)行脫細(xì)胞真皮的制備，并將傳統(tǒng)方法與改良方法制備的脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果及體外細(xì)胞相容性進(jìn)行對(duì)比，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1? 材料和方法

1.1 材料：選取本院整形外科行常規(guī)皮膚移植術(shù)后多余的臀部皮膚組織作為皮膚樣本，入選者年齡24～44歲，均無傳染性疾病及皮膚病變等。本次研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 脫細(xì)胞真皮的制備[9]：①傳統(tǒng)法：無菌狀態(tài)下將所選皮膚組織的皮下脂肪減除，放入1mol/L的氯化鈉溶液（上海玉博生物科技有限公司）中37℃作用24h，然后除去表皮，放入2%的氫氧化鈉溶液中37℃進(jìn)行搖床處理16h，使用鏈霉素磷酸鹽緩沖液（PBS，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）將溶液沖洗至中性。將所得皮片按照-80℃冷凍、37℃水浴箱復(fù)溫、洗滌，反復(fù)凍融4次，每次4h。完成后使用冷凍干燥機(jī)凍干，將所得脫細(xì)胞真皮4℃密封備用;②改良法：將所選皮膚組織的皮下脂肪組織在無菌狀態(tài)下剪除，放入1mol/L的氯化鈉溶液中37℃作用24h將表皮去除，然后放入2%的氫氧化鈉溶液中45℃進(jìn)行搖床處理4h，使用PBS將溶液沖洗至中性。進(jìn)行冷凍干燥后4℃密封備用。

1.2.2 染色：兩種方法均先使用4%的多聚甲醛固定24h，再用石蠟包埋，然后進(jìn)行切片、HE染色，用樹脂進(jìn)行封片，在顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.3 性狀檢測：①孔隙率：將脫細(xì)胞真皮冷凍干燥后，進(jìn)行稱重（W1）;加入50ml 75%的乙醇離心管，抽真空至不再有氣泡溢出，連同含有乙醇及支架材料的離心管一起進(jìn)行稱重（W2）;將含有乙醇支架材料取出，對(duì)剩余的乙醇及離心管稱重（W3）;所有稱重結(jié)果均精確至0.001g?？紫叮≒）率：P（%）=（W2-W3-W1）/（W2-W3）×100%;②體外降解時(shí)間：稱取冷凍干燥后的脫細(xì)胞真皮0.02g，使用1.0ml膠原酶37℃滴入，記錄消化至液體完全澄清所用時(shí)間;③孔腔直徑：使用3%的戊二醛將脫細(xì)胞真皮固定4℃過夜，然后使用PBS進(jìn)行沖洗，每次10min，連續(xù)3次，使用梯度乙醇+六甲基二硅氨烷脫乙醇進(jìn)行脫水后，進(jìn)行冷凍、干燥、噴金，拍照記錄，使用Image J測量孔隙直徑;④細(xì)胞毒性：參照《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)》中的方法提取脫細(xì)胞真皮浸潤液。3cm2表面積（雙面）加入1ml RPMI1640+10% FBS培養(yǎng)基，加入二氧化碳培養(yǎng)箱孵育24h后收集浸潤液;體積比0.64%苯酚作為陽性對(duì)照，聚乙烯浸潤液作為陰性對(duì)照，RPMI1640+10% FBS則作為空白對(duì)照;將5×104/ml的P3脂肪干細(xì)胞以100μl接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24h后再以陽性、陰性及空白三組浸潤液以100μl/孔進(jìn)行培養(yǎng)，并連續(xù)8d使用MTT法對(duì)細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測，每日檢測4孔/組。

1.3 細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《非直接接觸血液的醫(yī)用生物材料生物性能測試標(biāo)準(zhǔn)》中的6級(jí)毒性分級(jí)法進(jìn)行評(píng)定：0級(jí)，細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）≥100%;1級(jí)，RGR為75%～99%;2級(jí)，RGR為50%～74%;3級(jí)，RGR為25%～49%;4級(jí)，RGR為1%～24%;5級(jí)，RGR為0%。評(píng)分在2級(jí)及2級(jí)以上者，說明材料存在細(xì)胞毒性[10]。

1.4 細(xì)胞相容性：以每孔2×104個(gè)細(xì)胞將P4脂肪干細(xì)胞接種于浸泡過完全培養(yǎng)基48h的脫細(xì)胞真皮中，孵育8d后用甲醛進(jìn)行固定，使用HE染色后觀察兩種脫細(xì)胞真皮上脂肪干細(xì)胞生長及浸潤程度。

1.5 觀察與評(píng)價(jià)指標(biāo)：觀察兩種方法制備的脫細(xì)胞真皮的外觀、染色結(jié)果、孔隙率、孔腔直徑、體外降解時(shí)間及細(xì)胞毒性，并進(jìn)行對(duì)比分析;對(duì)比兩種方法制備的脫細(xì)胞真皮的體外相容性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x?±s）表示，使用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，使用χ2檢驗(yàn);不同濃度脫細(xì)胞真皮浸潤液及空白對(duì)照吸光度間比較采用單因素方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 外觀比較：兩種方法制備的脫細(xì)胞真皮經(jīng)肉眼觀察顏色無差異，均呈乳白略帶微黃色;但改良法制備的真皮表面可見孔隙，柔韌度更好，塑形性更高，更利于手術(shù)操作。

2.2 染色結(jié)果比較：經(jīng)HE染色后，兩種脫細(xì)胞真皮細(xì)胞成分均被完全脫去，均未見藍(lán)染細(xì)胞核及殘留，膠原纖維均完整，且較傳統(tǒng)方法，改良法制備的真皮孔隙均勻、結(jié)構(gòu)疏松、膠原纖維更為纖細(xì)。

2.3 兩種脫細(xì)胞真皮的孔隙率、孔腔直徑及體外降解時(shí)間比較：改良法制備的脫細(xì)胞真皮的孔隙率及真皮網(wǎng)狀面孔隙直徑均優(yōu)于傳統(tǒng)方法，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;但改良法脫細(xì)胞真皮的基底層孔隙直徑及體外降解時(shí)間與傳統(tǒng)法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.4 改良法脫細(xì)胞真皮的細(xì)胞毒性：改良方法制備的脫細(xì)胞真皮8d內(nèi)陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組的脫細(xì)胞真皮的連續(xù)檢測結(jié)果均顯示無細(xì)胞毒性。見表2。

2.5 體外細(xì)胞相容性：將P4脂肪干細(xì)胞接種于經(jīng)兩種不同方法制備后的脫細(xì)胞真皮上，8d后傳統(tǒng)法制備的脫細(xì)胞真皮的基底膜面呈現(xiàn)單層-復(fù)層生長，無明顯浸潤現(xiàn)象;8d后改良法制備的脫細(xì)胞真皮上的干細(xì)胞浸潤基底層，且浸潤范圍隨時(shí)間增加而擴(kuò)大，細(xì)胞數(shù)量明顯增加。

3? 討論

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)是一種經(jīng)過特殊方式去除皮膚組織內(nèi)細(xì)胞及抗原而保留細(xì)胞外基質(zhì)的生物材料[11]。研究證實(shí)，脫細(xì)胞真皮夠?yàn)榧?xì)胞的生長及細(xì)胞外基質(zhì)的重建提供良好的環(huán)境，提高移植的成活率，降低創(chuàng)面收縮率，減輕瘢痕攣縮[12]。目前脫細(xì)胞真皮已廣泛應(yīng)用于整形外科、眼科、口腔科及燒傷科等臨床學(xué)科[13]。邵小均等[14]研究結(jié)果證實(shí)，脫細(xì)胞真皮在口腔頜面部各類創(chuàng)面的修復(fù)中起到創(chuàng)面覆蓋、引導(dǎo)組織再生和支架的作用。時(shí)長江等[15]研究證實(shí)，在治療各種創(chuàng)面的修復(fù)過程中，將脫細(xì)胞真皮作為載體，聯(lián)合種子細(xì)胞治療各種創(chuàng)面的修復(fù)及組織重建，亦取得良好效果。陳武等[16]研究證實(shí)，牙周膜細(xì)胞在脫細(xì)胞真皮表面黏附及增殖情況良好。組織相容性是衡量生物材料的重要指標(biāo)之一，而制備的脫細(xì)胞真皮的孔隙率、通透性等均會(huì)對(duì)細(xì)胞的浸潤生長產(chǎn)生影響。因此制備脫細(xì)胞真皮的各種方法的重點(diǎn)均是盡量去除皮膚組織的細(xì)胞成分，提高脫細(xì)胞真皮的相容性。另外據(jù)報(bào)道，脫細(xì)胞真皮的孔隙率、孔腔大小及各種細(xì)胞因子等都會(huì)對(duì)脫細(xì)胞真皮的血管化產(chǎn)生影響[13]。

張愛君等[17]研究證實(shí)，通過調(diào)節(jié)制備過程中堿液的濃度能夠有效調(diào)節(jié)脫細(xì)胞真皮的微結(jié)構(gòu)，使其孔腔直徑與孔隙率增大，而冷凍處理則可以使細(xì)胞外基質(zhì)更加疏松。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，傳統(tǒng)方法與改良方法制備的脫細(xì)胞真皮經(jīng)肉眼觀察顏色無差異，均呈乳白略帶微黃色，但經(jīng)改良法制備的真皮表面可見孔隙，柔韌度更好，塑形性更高，更利于手術(shù)操作;而經(jīng)HE染色后，兩種脫細(xì)胞真皮細(xì)胞成分均被完全脫去，均未見藍(lán)染細(xì)胞核及殘留，膠原纖維均完整，且較傳統(tǒng)方法，改良法制備的真皮孔隙均勻、結(jié)構(gòu)疏松、膠原纖維更為纖細(xì);且改良法制備的脫細(xì)胞真皮的孔隙率及真皮網(wǎng)狀面孔隙直徑均優(yōu)于傳統(tǒng)方法，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明相對(duì)傳統(tǒng)法而言，改良法制備的脫細(xì)胞真皮更利于細(xì)胞的浸潤生長。兩組脫細(xì)胞真皮的基底層孔隙直徑及體外降解時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;改良方法制備的脫細(xì)胞真皮8d內(nèi)連續(xù)檢測結(jié)果均顯示無細(xì)胞毒性，說明經(jīng)改良法制備的真皮安全可靠。筆者將P4脂肪干細(xì)胞接種于經(jīng)兩種不同方法制備后的脫細(xì)胞真皮上，8d后傳統(tǒng)法制備的脫細(xì)胞真皮的基底膜面呈現(xiàn)單層-復(fù)層生長，無明顯浸潤現(xiàn)象;而改良法制備的脫細(xì)胞真皮上的干細(xì)胞浸潤基底層，且浸潤范圍隨時(shí)間增加而擴(kuò)大，細(xì)胞數(shù)量明顯增加。結(jié)果與姜濤等[18]研究一致，說明改良方法去除細(xì)胞更徹底，制備的脫細(xì)胞真皮的體外相容性及臨床使用效果更好。

綜上所述，應(yīng)用改良方法制備的脫細(xì)胞真皮，不僅方法簡單，且制備出的脫細(xì)胞真皮質(zhì)地更利于手術(shù)操作，孔隙率及孔腔直徑均優(yōu)于傳統(tǒng)方法，且無細(xì)胞毒性，與體外細(xì)胞的相容性較傳統(tǒng)方法亦更佳。

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[收稿日期]2019-02-20

本文引用格式：鄧霞，鐘惠蘭.改良法處理人脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果及其與體外細(xì)胞的相容性研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（10）：102-105.