基于蛋白質(zhì)組學(xué)和LINCS數(shù)據(jù)庫預(yù)測中藥復(fù)方的不良反應(yīng)——以黃連解毒湯為例

尚津鋒，李倩楠，姜婷月，焦家康，畢 磊，王璟邑，劉 欣

基于蛋白質(zhì)組學(xué)和LINCS數(shù)據(jù)庫預(yù)測中藥復(fù)方的不良反應(yīng)——以黃連解毒湯為例

尚津鋒，李倩楠，姜婷月，焦家康，畢 磊，王璟邑，劉 欣*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029

基于蛋白質(zhì)組學(xué)和LINCS數(shù)據(jù)庫探討預(yù)測中藥復(fù)方不良反應(yīng)的方法。以黃連解毒湯為例，對黃連解毒湯干預(yù)腦缺血大鼠模型進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，運(yùn)用LINCS數(shù)據(jù)庫、Python、RStudio等篩選與黃連解毒湯成分化合物結(jié)構(gòu)相似和基因表達(dá)類似的臨床藥物，檢索藥物的不良反應(yīng)，預(yù)測黃連解毒湯可能的不良反應(yīng)。黃連解毒湯干預(yù)腦缺血模型蛋白質(zhì)組學(xué)共篩選出72個上調(diào)蛋白和91個下調(diào)蛋白。阿司匹林、曲克蘆丁等11個臨床藥物與黃連解毒湯成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，表現(xiàn)出皮疹、惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應(yīng)；地昔帕明、山柰酚等30個臨床藥物與黃連解毒湯基因表達(dá)譜類似，表現(xiàn)出惡心、頭暈、頭痛等不良反應(yīng)。根據(jù)上述結(jié)果，預(yù)測黃連解毒湯可能的不良反應(yīng)為腹瀉、惡心、頭暈、頭痛、嘔吐等。以黃連解毒湯為例，探討了一種預(yù)測中藥復(fù)方不良反應(yīng)的新方法，為臨床研究提供參考。

蛋白質(zhì)組學(xué)；LINCS數(shù)據(jù)庫；中藥復(fù)方；黃連解毒湯；腦缺血；不良反應(yīng)

黃連解毒湯出自《肘后備急方》，由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味苦寒藥物組成，為“苦寒直折”的代表方劑，具有清熱解毒的功效，主治三焦火毒之證[1]?，F(xiàn)代研究顯示，黃連解毒湯在體內(nèi)外均具有明顯的抗炎作用，能夠治療炎癥感染、高血脂、糖尿病、消化性潰瘍等多種疾病[2]。近年來，在“毒損腦絡(luò)”的中醫(yī)理論觀點(diǎn)指導(dǎo)下，黃連解毒湯廣泛應(yīng)用于治療腦血管疾病[3]。臨床上，黃芩、黃連、黃柏、梔子或多或少存在不良反應(yīng)，可能與其藥性苦寒有關(guān)[4-7]，然而黃連解毒湯不良反應(yīng)報(bào)道較少，因此預(yù)測黃連解毒湯潛在的不良反應(yīng)具有臨床意義和研究價(jià)值。

目前已有研究從化學(xué)結(jié)構(gòu)角度預(yù)測藥物的不良反應(yīng)[8]，化學(xué)結(jié)構(gòu)決定藥物的性質(zhì)，結(jié)構(gòu)不同的藥物，性質(zhì)不同，通常藥理、毒理作用差異較大。靶標(biāo)是藥物和機(jī)體效應(yīng)之間的橋梁，藥物作用于靶標(biāo)產(chǎn)生毒效，構(gòu)建“藥-靶-不良反應(yīng)”網(wǎng)絡(luò)利于發(fā)現(xiàn)潛在不良反應(yīng)[9]?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)相似、調(diào)控靶標(biāo)相近的藥物藥效和毒理相似，從化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用靶標(biāo)預(yù)測藥物的不良反應(yīng)具備可行性。為此，本研究設(shè)計(jì)了一種預(yù)測中藥復(fù)方不良反應(yīng)的方法：通過比對化學(xué)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)，尋找與中藥復(fù)方成分化學(xué)結(jié)構(gòu)相似和基因表達(dá)類似的臨床常用藥物，檢索臨床常用藥物的不良反應(yīng)數(shù)據(jù)，以此為依據(jù)預(yù)測中藥復(fù)方的不良反應(yīng)。同時(shí)以黃連解毒湯治療腦缺血為例，驗(yàn)證該方法的實(shí)用性：對黃連解毒湯干預(yù)腦缺血大鼠模型進(jìn)行蛋白組檢測，分析黃連解毒湯治療腦缺血的基因表達(dá)譜，并利用LINCS等數(shù)據(jù)庫檢索與黃連解毒湯成分化合物結(jié)構(gòu)相近和基因表達(dá)相似的藥物，根據(jù)藥物的不良反應(yīng)，從而推測黃連解毒湯治療腦缺血可能的不良反應(yīng)。

1 資料與方法

1.1 黃連解毒湯治療腦缺血的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

1.1.1 儀器、藥物和主要試劑 RIGOL L-3000型高效液相色譜系統(tǒng)（北京普源精電科技有限公司），MX-S型渦旋振蕩器（SCILOGEX公司），CV100-DNA型真空離心濃縮儀（北京吉艾母科技有限公司），XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋（北京市光明醫(yī)療儀器有限公司），hf-48型高通量組織研磨器（上海賀帆儀器有限公司），JY96-IIN型超聲破碎儀（上海滬析實(shí)業(yè)有限公司）等。

黃芩配方顆粒（浙江貝尼菲特藥業(yè)有限公司，批號2005056，生產(chǎn)日期2020-05-25，有效期至2023-05-24），黃連配方顆粒（浙江貝尼菲特藥業(yè)有限公司，批號1910044，生產(chǎn)日期2019-10-18，有效期至2022-10-17），黃柏配方顆粒（浙江貝尼菲特藥業(yè)有限公司，批號2005042，生產(chǎn)日期2020-05-19，有效期至2023-05-18），梔子配方顆粒（浙江貝尼菲特藥業(yè)有限公司，批號2005036，生產(chǎn)日期2020-05-15，有效期至2023-05-14），金納多（德國威瑪舒培博士藥廠，批號6280219），蛋白定量染液（Huaxingbio公司，批號WC320333），牛血清白蛋白（Thermo Scientific公司，批號VA294012），二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT，Amresco公司，批號2923C501-0.1KG），碘代乙酰胺（iodoacetamide，IAM，Amresco公司，批號0736C278），胰蛋白酶（Promega共，批號0000490995），碳酸氫銨（Sigma-Aldrich公司，批號BCBN6056V），尿素（Amresco公司，批號3635C203），乙腈（J. T. Baker公司，批號0000221770)，氨水（Wako Pure Chemical Industries Ltd.，批號CTH2187），甲酸（Sigma-Aldrich公司，批號BCBM11920）等。

1.1.2 動物分組、造模和取材 選用的動物為SPF級8周齡雄性SD大鼠[許可證號SCXK（京）2019-0010]，體質(zhì)量220～240 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)術(shù)委員會實(shí)驗(yàn)動物倫理分委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號BUCM-4-2021101101-4007）。所有動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物房，于室溫22～25 ℃，相對濕度50%～60%，12 h明暗交替環(huán)境中適應(yīng)3 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

將大鼠分為假手術(shù)組，模型組，黃連解毒湯高、中、低（0.710、0.355、0.178 g/kg，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物與人體臨床等效劑量換算關(guān)系確定）組和陽性藥（金納多，21.6 mg/kg）組。分組前進(jìn)行標(biāo)號，并隨機(jī)將動物分為6組，每組10只大鼠。所有動物每12小時(shí)ig給藥1次（每日7: 00和19: 00時(shí)），連續(xù)給藥5 d，假手術(shù)組和模型組大鼠ig同體積蒸餾水。第6天早上8:00給藥后造模。

造模方式采用大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，末次給藥后1 h大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，分離頸動脈，夾閉頸總動脈，由頸外動脈插入線栓，頭端直徑（0.32±0.02）mm，至線栓18 mm標(biāo)記進(jìn)入頸內(nèi)動脈與頸總動脈分叉處，術(shù)后保溫。除假手術(shù)組大鼠不插線栓外，其他組大鼠均造模且操作一致。造模12 h后進(jìn)行神經(jīng)功能評分，隨后麻醉，快速剝離完整的腦，進(jìn)行氯化三苯基四氮唑（triphenyl-tetrazolium chloride，TTC）法染色。運(yùn)用TTC染色法、Bederson評分觀測大鼠腦梗死體積和神經(jīng)功能評分，并計(jì)算大鼠腦梗死率。采用雙盲法進(jìn)行神經(jīng)功能評分，Bederson評分分為4個等級，0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：懸尾實(shí)驗(yàn)不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：前肢抵抗對側(cè)推力能力下降；3分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。腦梗死率越大，神經(jīng)功能評分越高，大鼠損傷越嚴(yán)重，以腦梗死體積和神經(jīng)功能評分判斷造模是否成功。

根據(jù)大鼠腦梗死體積和神經(jīng)功能評分結(jié)果，確定黃連解毒湯中劑量組的治療效果最好。以黃連解毒湯的中劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將大鼠分為假手術(shù)組、模型組以及黃連解毒湯組，每組3只，造模、取材等步驟同上。各組大鼠處理12 h后麻醉，快速剝離完整的腦，于冰上剝離皮層組織，用生理鹽水快速沖洗，擦干，凍存于?80 ℃冰箱等待檢測。

1.1.3 蛋白質(zhì)分析 先對“1.1.2”的樣品進(jìn)行蛋白提取，并采用Bradford法[10]測定提取的蛋白濃度。參考FASP法[11]酶解蛋白，每組樣品取出100 μg蛋白溶液，加入40 mmol/L的IAM，37 ℃酶解反應(yīng)12 h，使用C18脫鹽柱對樣品進(jìn)行脫鹽。采用RIGOL L-3000高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)液相分離后經(jīng)過Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。

液相色譜分析條件：流動相為100%質(zhì)譜水-0.1%甲酸（A液）和80%乙腈-0.1%甲酸（B液），體積流量為600 nL/min，洗脫程序?yàn)?～7 min，8%～12% B；7～55 min，12%～30% B；55～65 min，30%～40% B；65～66 min，40%～95% B；66～80 min，95% B。

質(zhì)譜分析條件：Nanospray Flex（NSI）離子源，離子噴霧電壓為2.4 kV，離子傳輸管溫度為275 ℃，質(zhì)譜全掃描范圍為/350～1500；一級質(zhì)譜分辨率設(shè)為120 000（/200），最大增益控制（automatic gain control target，AGC）為3×106，最大注入時(shí)間為80 ms；二級質(zhì)譜分辨率設(shè)為15 000（/200），AGC為5×104，最大注入時(shí)間為45 ms。

1.1.4 統(tǒng)計(jì)分析 對Rattus norvegicus數(shù)據(jù)庫采用Proteome Discoverer 2.4軟件進(jìn)行搜庫。應(yīng)用RStudio的limma包對所納入數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并篩選差異蛋白[12]。以|log2FC|＞0.5 [FC表示差異倍數(shù)（fold change）] 且＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白，即log2FC＞0.5、＜0.05為上調(diào)蛋白，log2FC＜?0.5、＜0.05為下調(diào)蛋白。對調(diào)控蛋白的基因進(jìn)行分析，得到差異基因，并利用RStudio的ggplot2包[13]等繪制差異基因火山圖。黃連解毒湯組和模型組相比得到的上調(diào)、下調(diào)基因，是黃連解毒湯是否干預(yù)腦缺血模型表達(dá)差異較大的基因，以此作為黃連解毒湯治療腦缺血的作用靶標(biāo)。

1.2 篩選與黃連解毒湯成分結(jié)構(gòu)相似的藥物

TCMSP數(shù)據(jù)庫包含中藥的成分、靶點(diǎn)等數(shù)據(jù)，并提供成分的結(jié)構(gòu)式、藥理學(xué)參數(shù)等[14]。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索黃芩、黃連、黃柏、梔子的組成成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18和血腦屏障（blood brain barrier，BBB）≥?0.30為閾值，去重篩選得到黃連解毒湯的有效成分。由于目前已發(fā)現(xiàn)的藥物數(shù)量眾多，功效各異，因此本研究僅檢索腦缺血治療化學(xué)藥，判斷這些藥物是否與黃連解毒湯成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似。根據(jù)《2021 AHA/ASA指南：卒中和短暫性腦缺血發(fā)作患者的卒中預(yù)防》[15]和《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[16]檢索治療腦缺血的上市化學(xué)藥。運(yùn)用PubChem數(shù)據(jù)庫[17]獲取黃連解毒湯化合物和腦缺血臨床藥物的SMILES號，構(gòu)建黃連解毒湯化合物數(shù)據(jù)庫和治療腦缺血臨床藥物數(shù)據(jù)庫。

rdKit包能夠根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析小分子之間的結(jié)構(gòu)相似性，得到化合物之間的相似性分?jǐn)?shù)[18]。利用Python的rdKit包計(jì)算黃連解毒湯化合物、臨床藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的相似性，臨床藥物與全部成分化合物結(jié)構(gòu)相似性分?jǐn)?shù)的平均值越高，說明該藥物和黃連解毒湯成分的結(jié)構(gòu)越相近。此外，將分析得到的化合物相似性矩陣導(dǎo)入RStudio的hClust包進(jìn)行聚類分析并繪制聚類樹狀圖，聚成一類的化合物之間結(jié)構(gòu)相似，性質(zhì)相近，產(chǎn)生的藥理作用也越相似。根據(jù)結(jié)構(gòu)聚類樹狀圖和相似性分?jǐn)?shù)平均值排名，篩選出與黃連解毒湯成分結(jié)構(gòu)相似的藥物集合。

1.3 篩選與黃連解毒湯基因表達(dá)類似的藥物

LINCS數(shù)據(jù)庫（https://commonfund.nih.gov/ LINCS/programhighlights）中包含豐富的生物信息數(shù)據(jù)，利用多種模型系統(tǒng)和各種化學(xué)擾動的集合，生成大規(guī)模擾動-效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)[19]?；贚INCS數(shù)據(jù)庫，CMap（Build 02）（https://portals.broadinstitute.org/ cmap/）包含1309個不同劑量藥物治療的5個人類細(xì)胞系的6100個基因表達(dá)圖譜，通過將輸入的差異基因與化合物的所有參考表達(dá)譜進(jìn)行比較，得到連接性分?jǐn)?shù)在?1～1的化合物排序[20-21]。如果藥物治療疾病與化合物的表達(dá)譜高度正相關(guān)，即藥物治療疾病的靶標(biāo)與化合物作用靶標(biāo)相似程度很高，說明藥物治療疾病的機(jī)制可能與該化合物效應(yīng)相似。

將蛋白質(zhì)組學(xué)分析得到的差異基因輸入CMap數(shù)據(jù)庫，獲取化合物連接性分?jǐn)?shù)，化合物的連接性分?jǐn)?shù)越接近1，說明該化合物的作用于人體細(xì)胞的基因表達(dá)譜與黃連解毒湯治療腦缺血的基因表達(dá)譜越相似。通過上述方法，篩選出與黃連解毒湯治療腦缺血基因表達(dá)相似的藥物集合。

1.4 預(yù)測藥物和黃連解毒湯的不良反應(yīng)

SEP-L1000數(shù)據(jù)庫（http://maayanlab.net/ SEP-L1000/）通過化學(xué)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)特征，對超過20000種小分子化合物（包含美國藥監(jiān)局批準(zhǔn)藥物在內(nèi)）的不良反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)先度排序，有助于理解藥物作用機(jī)制[22]。將“1.2”和“1.3”項(xiàng)中基于化學(xué)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)2個特征相似度篩選的藥物集合輸入SEP-L1000數(shù)據(jù)庫，預(yù)測藥物的不良反應(yīng)，獲取每個藥物發(fā)生不同不良反應(yīng)的可能性分?jǐn)?shù)。計(jì)算每種不良反應(yīng)在化學(xué)結(jié)構(gòu)相似和基因表達(dá)相似2個藥物集合可能性分?jǐn)?shù)的總和，從高到低對不良反應(yīng)進(jìn)行排序，以此作為依據(jù)，預(yù)測黃連解毒湯治療腦缺血潛在的不良反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 黃連解毒湯治療腦缺血的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果

黃連解毒湯干預(yù)腦缺血模型的各組大鼠腦梗死體積和神經(jīng)功能評分結(jié)果見圖1～3。結(jié)果表明，連解毒湯中劑量（0.355 g/kg）組的治療效果最好。以黃連解毒湯中劑量進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)共鑒定出4794種蛋白，以|log2FC|＞0.5、＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，在黃連解毒湯組和模型組之間篩選出163個差異蛋白，包括72個上調(diào)蛋白和91個下調(diào)蛋白。差異蛋白對應(yīng)71個上調(diào)基因和88個下調(diào)基因，利用RStudio繪制的火山圖見圖4。黃連解毒湯組和模型組相比得到的159個差異基因，是黃連解毒湯干預(yù)腦缺血模型大鼠的差異表達(dá)基因，以此作為黃連解毒湯治療腦缺血的作用靶標(biāo)。

圖1 黃連解毒湯對腦缺血模型大鼠腦梗死體積的影響 (TTC)

與假手術(shù)組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

與假手術(shù)組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

圖4 黃連解毒湯干預(yù)腦缺血模型大鼠的差異基因火山圖

2.2 基于化學(xué)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)篩選藥物

2.2.1 黃連解毒湯成分結(jié)構(gòu)相似的藥物篩選 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索黃芩、黃連、黃柏、梔子的成分，共得到370個成分，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18和BBB≥?0.30為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到59個成分。根據(jù)腦缺血診療指南獲取腦缺血治療常用藥物21個，包括鹽酸托培松、曲克蘆丁、氨酪酸、奧拉西坦、硫酸氫氯吡格雷、氯吡格雷、肝素、阿司匹林、艾地苯醌、胞磷膽堿鈉、依達(dá)拉奉、辛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、甘露醇、呋塞米、尼莫地平、西洛他唑、奧扎格雷鈉、胞苷二磷酸膽堿、華法林。利用Python的rdKit包計(jì)算黃連解毒湯成分與化學(xué)藥結(jié)構(gòu)之間的相似性分?jǐn)?shù)，將運(yùn)算結(jié)果保存為×矩陣格式。同時(shí)運(yùn)用RStudio的hClust包對59個黃連解毒湯成分和21個腦缺血治療藥物進(jìn)行聚類，共聚成10類，樹狀圖見圖5。不同的中藥復(fù)方成分與不同類型的上市藥物聚成一類，提示黃連解毒湯可能具有不同的藥理作用?；诮Y(jié)構(gòu)相似性的化合物聚類表明，具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的黃連解毒湯成分聚合成類，具有相同基團(tuán)的腦缺血治療藥物基本聚成一類。肝素、甘露醇、氨酪酸與鯊烯，華法林、阿司匹林與雙苯-1,2-二甲酸酯，曲克蘆丁與茵芋堿、脫氫蒽酮IIA，依達(dá)拉奉與吳茱萸次堿等聚集，表明黃連解毒湯成分與治療腦缺血常用藥物具有相似的結(jié)構(gòu)或功能基團(tuán)。

臨床藥物與黃連解毒湯成分結(jié)構(gòu)相似性分?jǐn)?shù)的平均值從高到低排序：華法林（0.248）、阿司匹林（0.220）、曲克蘆?。?.215）、氯吡格雷（0.215）、硫酸氫氯吡格雷（0.209）、尼莫地平（0.204）、依達(dá)拉奉（0.193）、艾地苯醌（0.187）、鹽酸托培松（0.179）、呋塞米（0.174）、辛伐他汀（0.172）、胞磷膽堿鈉（0.165）、胞苷二磷酸膽堿（0.161）、阿托伐他?。?.161）、西洛他唑（0.160）、瑞舒伐他?。?.156）、奧拉西坦（0.147）、奧扎格雷鈉（0.129）、氨酪酸（0.119）、肝素（0.105）、甘露醇（0.053）。由此可見，華法林、阿司匹林、曲克蘆丁等藥物與黃連解毒湯成分結(jié)構(gòu)較相似。選擇相似性分?jǐn)?shù)≥0.170的藥物建立黃連解毒湯成分結(jié)構(gòu)相似藥物集合，包括華法林、阿司匹林、曲克蘆丁、氯吡格雷、硫酸氫氯吡格雷、尼莫地平、依達(dá)拉奉、艾地苯醌、鹽酸托培松、呋塞米、辛伐他汀共11個臨床藥物。這些藥物與黃連解毒湯成分化合物的結(jié)構(gòu)相似，并具備治療腦缺血的功效，是與黃連解毒湯成分結(jié)構(gòu)相似、作用功效相近的藥物。

2.2.2 黃連解毒湯基因表達(dá)類似的藥物篩選 將黃連解毒湯治療腦缺血的上調(diào)、下調(diào)基因輸入CMap數(shù)據(jù)庫，共檢索到1309個藥物，根據(jù)連接性分?jǐn)?shù)從大到小排序，篩選出連接性分?jǐn)?shù)＞0.400的30種藥物，建立黃連解毒湯基因表達(dá)相似藥物集合，見表1。這些藥物與黃連解毒湯干預(yù)腦缺血的基因表達(dá)譜相似度較高，作用靶點(diǎn)相近，這些藥物可能與黃連解毒湯藥理機(jī)制相似。

2.3 黃連解毒湯不良反應(yīng)預(yù)測

2.3.1 黃連解毒湯不良反應(yīng)概述 從中國知網(wǎng)、萬方、維普、PubMed、Web of Science 5個數(shù)據(jù)庫檢索黃連解毒湯的不良反應(yīng)文獻(xiàn)，未見黃連解毒湯治療腦缺血的不良反應(yīng)報(bào)道。根據(jù)檢索結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯在臨床上運(yùn)用廣泛，常搭配其他中藥復(fù)方或化學(xué)藥治療阿爾茨海默病[23-25]、2型糖尿病[26]、動脈粥樣硬化[27]、感染性心內(nèi)膜炎[28]等疾病。在治療過程中，黃連解毒湯的不良反應(yīng)發(fā)生率較低，發(fā)生的不良反應(yīng)以腹瀉居多，兼有惡心、失眠、便溏腹脹、腹痛、眩暈、藥疹等癥狀出現(xiàn)，多數(shù)研究的對照組和試驗(yàn)組不良反應(yīng)發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果表明，黃連解毒湯在治療疾病中偶爾出現(xiàn)不良反應(yīng)，出現(xiàn)不良反應(yīng)以腹瀉為主，可能與黃芩、黃連、黃柏、梔子的藥性苦寒、易傷脾胃有關(guān)。

1個顏色代表一類，標(biāo)有*的代表腦缺血治療常用藥物，未標(biāo)有*的代表黃連解毒湯成分

表1 基于CMap數(shù)據(jù)庫篩選的黃連解毒湯基因表達(dá)類似藥物

Table 1 Similar drugs of Huanglian Jiedu Decoction gene expression screened based on CMap database

藥物英文名稱藥物中文名稱連接性分?jǐn)?shù)特異度實(shí)驗(yàn)次數(shù)有效率/% desipramine地昔帕明0.4010.1954 75 butamben布坦本0.4010.1594 75 harmaline駱駝蓬堿0.4050.0424 75 netilmicin奈替米星0.4060.0074 75 decitabine地西他濱0.407－1100 strophanthidin毒扁豆堿0.4080.3144 75 brinzolamide布林佐胺0.4200.0394 75 esculetin七葉皂苷0.4200.4103 66 amprolium氨丙啉0.4240.0005 80 pralidoxime解磷定0.4250.1424 75 tomelukast托魯司特0.437－1100 kaempferol山柰酚0.4390.1254 75

續(xù)表1

藥物英文名稱藥物中文名稱連接性分?jǐn)?shù)特異度實(shí)驗(yàn)次數(shù)有效率/% dilazep地拉卓0.4410.0425 80 oxybenzone氧化苯甲酮0.4410.1594 75 clemizole氯咪唑0.4570.1585 80 prestwick-920 0.4570.1044 75 seneciphylline千里光堿0.4580.0744 75 arachidonic acid花生四烯酸0.4630.1093 66 tetramisole四咪唑0.4680.0154 75 betulin白樺脂醇0.4710.0193100 cytochalasin B細(xì)胞松弛素B0.475－1100 tropine托品0.5060.0004100 2-deoxy-D-glucose2-脫氧-D-葡萄糖0.509－1100 12,13-EODE 0.537－1100 corticosterone皮質(zhì)酮0.5470.0004100 oligomycin寡霉素0.561－1100 phenanthridinone菲啶酮0.568－1100 mecamylamine美加明0.5720.0083100 fendiline芬地林0.5760.0343100 MG-132 0.594－1100

2.3.2 基于成分結(jié)構(gòu)的不良反應(yīng)預(yù)測 運(yùn)用SEP-L1000數(shù)據(jù)庫檢索黃連解毒湯成分結(jié)構(gòu)相似藥物的不良反應(yīng)，共檢索到阿司匹林、氯吡格雷、依達(dá)拉奉、呋塞米、艾地苯醌、尼莫地平、辛伐他汀、華法林8個藥物的不良反應(yīng)，按可能性分?jǐn)?shù)的總和對不良反應(yīng)進(jìn)行排序，從高到低前20種不良反應(yīng)為皮疹、惡心、嘔吐、腹瀉、瘙癢、疼痛、頭痛、頭暈、蕁麻疹、腹痛、過敏、貧血、虛弱、水腫、體溫升高、白細(xì)胞減少、血小板減少、消化不良、感覺異常、混亂狀態(tài)，成分化學(xué)結(jié)構(gòu)相似藥物的不良反應(yīng)可能性熱圖見圖6。

2.3.3 基于基因表達(dá)的不良反應(yīng)預(yù)測 運(yùn)用SEP-L1000數(shù)據(jù)庫檢索黃連解毒湯基因表達(dá)相似藥物的不良反應(yīng)，共檢索到地昔帕明、布坦本、地西他濱、毒扁豆堿、布林佐胺、解磷定、托魯司特、山柰酚、地拉卓、氧化苯甲酮、氯咪唑、千里光堿、四咪唑、細(xì)胞松弛素B、托品、皮質(zhì)酮、寡霉素、美加明、芬地林、MG-132共20種藥物的不良反應(yīng)，按可能性分?jǐn)?shù)的總和對不良反應(yīng)進(jìn)行排序，從高到低前20種不良反應(yīng)為惡心、頭暈、頭痛、皮疹、嘔吐、疼痛、瘙癢、水腫、腹瀉、蕁麻疹、虛弱、體溫升高、過敏、腹痛、食欲減退、便秘、呼吸困難、消化不良、疲勞、失眠，基因表達(dá)類似藥物的不良反應(yīng)可能性熱圖見圖7。

將基于成分結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)預(yù)測的可能性分?jǐn)?shù)排名前10的不良反應(yīng)取交集，預(yù)測黃連解毒湯在治療腦缺血中的不良反應(yīng)為惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、頭暈、頭痛、疼痛、瘙癢、蕁麻疹。

3 研究整體流程和方法總結(jié)

本研究設(shè)計(jì)的預(yù)測中藥復(fù)方不良反應(yīng)方法，基于化學(xué)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的不良反應(yīng)預(yù)測流程見圖8。需要準(zhǔn)備中藥復(fù)方治療某一疾病的基因表達(dá)譜，可以運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等各種組學(xué)方法，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)獲取黃連解毒湯干預(yù)腦缺血模型大鼠的表達(dá)譜。結(jié)合PubChem、LINCS、CMap等數(shù)據(jù)庫比較中藥復(fù)方和臨床藥物在化學(xué)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)2個維度的相似性，進(jìn)而獲取化學(xué)結(jié)構(gòu)相似和基因表達(dá)類似的藥物，檢索這些藥物的不良反應(yīng)，進(jìn)而預(yù)測中藥復(fù)方的不良反應(yīng)。大體分為以下3個步驟：（1）比較中藥復(fù)方所含成分和臨床藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性，獲取化學(xué)結(jié)構(gòu)相似藥物；（2）比較中藥復(fù)方和臨床藥物的基因表達(dá)譜，獲取基因表達(dá)類似藥物；（3）根據(jù)篩選得到的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似藥物和基因表達(dá)類似藥物預(yù)測中藥復(fù)方的不良反應(yīng)。

圖6 黃連解毒湯成分結(jié)構(gòu)相似藥物的不良反應(yīng)可能熱圖

圖7 黃連解毒湯基因表達(dá)類似藥物的不良反應(yīng)可能性熱圖

圖8 基于蛋白質(zhì)組學(xué)和數(shù)據(jù)庫預(yù)測中藥復(fù)方不良反應(yīng)的流程

4 討論

本研究設(shè)計(jì)了一種預(yù)測中藥復(fù)方不良反應(yīng)的方法，以蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)有LINCS數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性和基因表達(dá)類似度為標(biāo)準(zhǔn)，篩選與中藥復(fù)方成分結(jié)構(gòu)相似和基因表達(dá)類似的臨床藥物，通過檢索臨床藥物的不良反應(yīng)，預(yù)測中藥復(fù)方可能存在的不良反應(yīng)。本研究首次將化學(xué)成分結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)譜結(jié)合，應(yīng)用于中藥復(fù)方不良反應(yīng)的預(yù)測中，并以黃連解毒湯為例探討該方法的可行性。

中醫(yī)認(rèn)為，黃連解毒湯“苦寒直折”，方中君藥黃連清瀉心火兼中焦之火；臣藥黃芩瀉肺熱與上焦之火；黃柏瀉下焦之火，梔子瀉三焦之火，引熱下行，二者為佐藥。黃連解毒湯主治三焦火毒熱盛證，癥見大熱煩躁、口燥咽干、錯語不眠；或熱病出血、癰疽瘡瘍[29-30]，針對以風(fēng)火痰瘀壅塞三焦、毒損腦絡(luò)為特點(diǎn)的腦缺血病理過程，發(fā)揮通三焦、解火毒的作用，達(dá)到“解毒通絡(luò)”的目的[31]。黃連解毒湯解三焦火毒與其藥性苦寒密不可分，傳統(tǒng)已有“苦寒傷胃”一說，即苦寒藥性寒涼，有傷胃之弊，不宜用于脾胃虛寒者，臨床應(yīng)用這類藥物易出現(xiàn)腹痛等癥狀。目前相關(guān)研究表明，苦寒藥在較大劑量連續(xù)用藥后可致正常動物和脾胃虛寒模型動物的胃腸運(yùn)動功能減退，“傷胃”之弊體現(xiàn)在消化系統(tǒng)的多個方面[32]，印證了傳統(tǒng)中醫(yī)的觀點(diǎn)。此外，在黃連解毒湯蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯給藥組的大鼠便溏軟，是腹瀉癥狀的表現(xiàn)，可能與黃連、黃芩、黃柏、梔子藥性苦寒有關(guān)。根據(jù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果，臨床上黃連解毒湯的不良反應(yīng)較少且發(fā)生頻率低，僅有腹瀉、惡心、腹痛等幾個不良反應(yīng)的報(bào)道[23-25,33-34]，與本研究的預(yù)測結(jié)果相符。所有這些結(jié)果表明，基于化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性聚類以及基因表達(dá)譜比較，挑選中藥復(fù)方的類似臨床藥物為依據(jù)推測不良反應(yīng)，是預(yù)測中藥復(fù)方不良反應(yīng)的有效方法。

腦缺血臨床藥物與黃連解毒湯成分結(jié)構(gòu)聚類圖顯示，黃連解毒湯成分與目前臨床應(yīng)用廣泛的治療藥物結(jié)構(gòu)相似，它們之間具備相似官能團(tuán)，尤其阿司匹林、曲克蘆丁、尼莫地平、依達(dá)拉奉、氯吡格雷、呋塞米、辛伐他汀，不僅與成分的結(jié)構(gòu)相似度高，而且臨床應(yīng)用廣泛，因此依據(jù)臨床藥物的藥效機(jī)制能夠推測黃連解毒湯的藥理作用和不良反應(yīng)。阿司匹林有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的藥理作用，對血小板的聚集有抑制作用，其腸溶片可作為“中風(fēng)”的二級預(yù)防[35]。藥理研究顯示，阿司匹林腸溶片可促使血小板環(huán)氧化酶乙酰化，抗血小板聚集；尼莫地平則促進(jìn)腦血管擴(kuò)張，調(diào)節(jié)腦組織血流量，降低鈣水平，避免神經(jīng)元損傷；辛伐他汀調(diào)節(jié)血液流速及血液黏稠度，調(diào)節(jié)血脂，聯(lián)合阿司匹林增強(qiáng)治療缺血性腦病的療效[36-38]。動物實(shí)驗(yàn)表明，曲克蘆丁對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，與減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、增加自由基的清除能力等有關(guān)[39]，這說明曲克蘆丁通過抗氧化損傷保護(hù)腦組織。依達(dá)拉奉具有抗炎作用，在治療腦缺血再灌注損傷中能顯著降低炎性反應(yīng)，可能與Wnt家族分泌蛋白/β-連環(huán)蛋白通路（canonical Wnt/β-catenin pathway）通路激活有關(guān)[40-41]。此外，研究顯示，呋塞米通過腎外作用顯著降低了腦阻抗，發(fā)揮抗水腫作用，改善腦缺血損傷[42]。黃連解毒湯的成分與上述腦缺血臨床藥物結(jié)構(gòu)相似，基于這種無監(jiān)督的化學(xué)結(jié)構(gòu)聚類方法和已有研究[43-46]，組學(xué)大數(shù)據(jù)預(yù)測和驗(yàn)證的黃連解毒湯具有以下藥理作用：抑制血小板凝集（阿司匹林）、抵抗氧化損傷（曲克蘆?。?、抑制炎癥反應(yīng)（阿司匹林、尼莫地平、依達(dá)拉奉）、減少膽固醇合成（他汀類），其成分還可能具有利尿的作用（呋塞米），說明黃連解毒湯多途徑、多作用保護(hù)腦組織和神經(jīng)元細(xì)胞，對抗腦缺血損傷。

基于黃連解毒湯干預(yù)腦缺血的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，本研究篩選了71個上調(diào)基因和88個下調(diào)基因，以基因靶標(biāo)為基礎(chǔ)可以深入挖掘黃連解毒湯治療腦缺血的作用機(jī)制。以蛋白組學(xué)的差異表達(dá)基因，篩選得到地昔帕明、布坦本、地西他濱、布林佐胺、解磷定、山柰酚、氯咪唑、千里光堿、四咪唑、細(xì)胞松弛素B、托品、皮質(zhì)酮等30個藥物與黃連解毒湯基因表達(dá)類似，目前黃連解毒湯能夠治療腦缺血，上述藥物能否在腦缺血治療中發(fā)揮作用有待驗(yàn)證，其中山柰酚已經(jīng)證實(shí)具有改善腦缺血功能。藥理研究顯示，山柰酚能抑制炎癥，保護(hù)血腦屏障，改善慢性腦缺血誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能障礙、四肢平衡能力障礙及病理損傷，作用機(jī)制可能與抗氧化、抑制炎癥通路激活有關(guān)[47-48]。地昔帕明、普托品、皮質(zhì)酮也被證明與腦缺血的病理損傷相關(guān)[49-52]。因此，通過比較藥物基因表達(dá)的相似度，由已知的毒效作用推測未知的毒效作用具備可行性。本研究篩選的與黃連解毒湯基因表達(dá)譜類似藥物，可以研究與腦缺血損傷和治療機(jī)制的關(guān)系，為藥物藥理作用的發(fā)現(xiàn)提供新思路。

經(jīng)過本研究設(shè)計(jì)的不良反應(yīng)預(yù)測流程（圖8），預(yù)測黃連解毒湯不良反應(yīng)為惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、頭暈、頭痛、疼痛、瘙癢、蕁麻疹。惡心、嘔吐、腹瀉、藥疹、疼痛、頭痛等不良反應(yīng)已有報(bào)道，出現(xiàn)頻次較低且反應(yīng)不劇烈，不良反應(yīng)的發(fā)生可能與其藥性苦寒傷胃相關(guān)。由此說明，本研究設(shè)計(jì)的不良反應(yīng)預(yù)測方法具有價(jià)值和可行性。但這些不良反應(yīng)是基于臨床藥物推測的，臨床化學(xué)藥的不良反應(yīng)通常較多，反應(yīng)劇烈，而黃連解毒湯臨床上雖然有報(bào)道腹瀉等不良反應(yīng)，但出現(xiàn)頻率低、反應(yīng)數(shù)量少、程度輕微，黃連解毒湯與臨床藥物相比不良反應(yīng)癥狀減輕、頻率下降，是否與中藥的配伍減毒作用相關(guān)有待研究。中藥復(fù)方在治療疾病中有其獨(dú)特優(yōu)勢，不良反應(yīng)發(fā)生率少，廣泛運(yùn)用中醫(yī)藥大勢所趨。

5 結(jié)論

本研究探討了一種中藥復(fù)方不良反應(yīng)預(yù)測的方法，將中藥復(fù)方的成分化學(xué)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)與臨床藥物結(jié)合，建立化學(xué)結(jié)構(gòu)、基因靶標(biāo)與不良反應(yīng)之間的聯(lián)系，篩選中藥復(fù)方類似藥物，預(yù)測中藥復(fù)方的不良反應(yīng)，為中藥不良反應(yīng)研究提供新的策略和方法。然而，本研究受限于數(shù)據(jù)量等因素，具有一定的局限性，希望今后豐富數(shù)據(jù)、完善方法?？傊诘鞍踪|(zhì)組學(xué)和LINCS數(shù)據(jù)庫，本研究探討了一種預(yù)測中藥復(fù)方不良反應(yīng)的方法，并以黃連解毒湯為例說明該方法具備可行性，可能有助于闡明傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的獨(dú)特機(jī)制，為不良反應(yīng)研究提供新的策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Prediction of adverse reactions of traditional Chinese medicine compound based on proteomics and LINCS database: A case study of Huanglian Jiedu Decoction

SHANG Jin-feng, LI Qian-nan, JIANG Ting-yue, JIAO Jia-kang, BI Lei, WANG Jing-yi, LIU Xin

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To explore a method to predict the adverse reactions of traditional Chinese medicine (TCM) compound based on proteomics and LINCS database.Taking Huanglian Jiedu Decoction (黃連解毒湯) as an example, proteomics analysis was conducted on Huanglian Jiedu Decoction intervened cerebral ischemia rat model. LINCS database, Python and RStudio were used to screen clinical drugs with similar structure and gene expression to Huanglian Jiedu Decoction. Adverse reactions of drugs were retrieved and possible adverse reactions of Huanglian Jiedu Decoction were predicted.A total of 72 up-regulated proteins and 91 down-regulated proteins were screened via proteomics. The chemical structure of 11 clinical drugs, such as aspirin and troxrutin, were similar to that of Huanglian Jiudu Decoction, which showed rash, nausea, vomiting and diarrhea and other adverse reactions. The gene expression profiles of 30 clinical drugs, such as dixipramine and kaempferol, were similar to those of Huanglian Jiedu Decoction, which showed nausea, dizziness, headache and other adverse reactions. According to the above results, the possible adverse reactions of Huanglian Jiedu Decoction were predicted to be diarrhea, nausea, dizziness, headache, vomiting, etc.This study explores a new method to predict the adverse reactions of TCM compound, and takes Huanglian Jiedu Decoction as an example to illustrate the feasibility of the method and provide reference for clinical research.

proteomics; LINCS database; traditional Chinese medicine compound; Huanglian Jiedu Decoction; cerebral ischemia; adverse reaction

R285

A

0253 - 2670(2022)13 - 4053 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.019

2021-12-26

北京中醫(yī)藥大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目）（2020-JYB-ZDGG-039）

尚津鋒（2001—），男，碩士研究生，從事腦缺血作用特點(diǎn)及藥物干預(yù)研究。E-mail: sjf01qtdd@163.com

劉 欣，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦缺血作用特點(diǎn)及藥物干預(yù)研究。Tel: (010)53912127 E-mail: xinliu1011@126.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]