燕窩酶解液的制備及其抗流感病毒作用初探

路鑫怡 沃恩康 楊新燕 楊燦 徐琦 楊柳 何泳愉 項婷婷 郭潮潭

杭州醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院與生物工程學(xué)院，杭州 310013

流感病毒是一種急性人畜共患傳染病，抗流感病毒藥物是控制流感的重要手段，但因病毒易發(fā)生變異，使得藥物易產(chǎn)生耐藥性。 有研究顯示，從燕窩水提液中獲得的一種病毒血凝反應(yīng)抑制劑，具有廣譜抗病毒效應(yīng)，可見有效利用燕窩活性成分，可為抗流感病毒藥物的研發(fā)打下基礎(chǔ)。 對燕窩進(jìn)行酶提取，可減少其中過敏性和難消化的化合物。 本研究嘗試建立燕窩酶解液的制備方法，并研究其抗流感病毒作用，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、細(xì)胞系與病毒株

犬腎上皮細(xì)胞系MDCK 細(xì)胞，小鼠單核巨噬細(xì)胞系Raw264.7 細(xì)胞，病毒株A/Memphis/1/71(H3N2)（簡稱Memphis）均為本實驗室保存。 MDCK 細(xì)胞采用 5%新生牛血清(NBS)的 DMEM 培養(yǎng)；Raw264.7 細(xì)胞采用10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培養(yǎng)。 感染性實驗均使用含有 1 μg/mL TPCK 胰酶的DMEM 作為稀釋緩沖液。

二、試劑及設(shè)備

燕窩購自華東醫(yī)藥；中性蛋白酶和茚三酮試劑購自上海源葉生物科技有限公司；冰醋酸、硫酸銨購自上海麥克林生化科技有限公司；RNA 提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒和SYBR Green 熒光定量試劑購自翊圣生物科技有限公司；DMEM/High 培養(yǎng)基購自 Cellmax；NP 抗體、M2e 抗體、M1a 抗體 (1∶1 000)由本實驗室制備并保存；β-actin 抗體 (1∶1 000)、Phospho-IKKα/β 抗 體 、IKKα/β 抗 體 、Phospho-NF-κBp65 抗體和 NF-κBp65 抗體購自 Cell Signaling 科技公司；山羊抗小鼠、山羊抗兔HRP 抗體(1∶5 000)購自杭州華安生物科技有限公司；MTT、二甲基亞砜（DMSO）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物合成委托上海捷瑞生物技術(shù)有限公司，引物序列如表1 所示。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列

注：NP：流感病毒核蛋白；M：流感病毒基質(zhì)蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

基因 上游（5'-3'） 下游（5'-3'）NP CAACATACCAGAGGACAAG ATCAACTCCATCACCATTG M AAGTGAGCAGGCAGCAGAG CTCGCAGCAACAACAAGAGG IL-1β AGTGATGAGAATGACCTGTT GATACTGCCTGCCTGAAG IL-6 TCCATCCAGTTGCCTTCT TAAGCCTCCGACTTGTGA IFN-γ ATCTGGAGGAACTGGCAA GTGTGATTCAATGACGCTTA TNF-α GACCCTCACACTCAGATCATCTTCT GCTACGACGTGGGCTACAG NG-κBp65 GAAGCACAGATACCACCAA CAGCCTCATAGTAGCCATC GAPDH GAAGGTCGGTGTGAACGGATTTG CATGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA

三、方法

1.確定燕窩酶解條件

稱取0.12 g 燕窩放入錐形瓶中，按照液料比分別為 20∶1、30∶1、40∶1、45∶1 和 50∶1 加入蒸餾水使燕窩充分溶脹。 隨后各添加10 mL 中性蛋白酶，酶解1 h，而后沸水浴10 min 使酶滅活。取10 mL 酶解后的液體加入10 mL 的50%醋酸溶液。 在酸性環(huán)境下利用茚三酮試劑測定不同液料比對唾液酸提取率的影響。 在固定合適液料比的情況下，試驗不同的酶解時長(0~8 h)對唾液酸提取率的影響。 每個液料比和每個酶解時長重復(fù)6 次。

唾液酸提取率計算公式為：x=[c×50×10/（V×0.006077）]×100%

式中，x 表示唾液酸提取率(%)；c 表示從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的唾液酸濃度 （mg/mL）；V 表示樣本體積（mL）；50 表示提取后定容體積（mL）；0.006077 表示1 g 標(biāo)準(zhǔn)燕窩中唾液酸的含量（g）。

2.燕窩酶解液對MDCK 細(xì)胞毒性作用

用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將燕窩酶解液、燕窩液和中性蛋白酶分別從2.4 mg/mL 和5.52 mg/mL按2 倍倍比稀釋為8 個濃度。MDCK 細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入2 倍稀釋的樣本，每個稀釋度重復(fù)6 次。 同時設(shè)立正常細(xì)胞對照組和空白凋零組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用MTT 檢測細(xì)胞存活情況并計算細(xì)胞存活率，選擇細(xì)胞生存率高于50%的濃度作為樣本最大使用濃度。 細(xì)胞存活率=[(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

3.燕窩酶解液對流感病毒的體外抑制試驗

因此，在英語教學(xué)中要注重拓寬學(xué)生的語言文化知識，培養(yǎng)深刻理解不同文化內(nèi)涵的能力，培養(yǎng)學(xué)生樹立遠(yuǎn)大理想，具有把握現(xiàn)實、面向未來、立足本國、面向世界的遠(yuǎn)見卓識，形成正確價值觀和優(yōu)秀品質(zhì)，通過提升學(xué)生的人文精神，具備自覺抵制利己主義、拜金主義、價值迷失、信仰危機(jī)等不良思想文化滲透的能力，具備跨文化交際和傳播中國優(yōu)秀文化的能力和素養(yǎng)，培養(yǎng)學(xué)生的民族自信，在學(xué)好英語語言和文化的同時，培養(yǎng)學(xué)生的愛國情操、社會責(zé)任感和歷史使命感，要有憂患意識，要懂得珍惜今天來之不易的幸福生活，切實懂得國家強(qiáng)大的意義。

采用以下3 種方式進(jìn)行燕窩酶解液對流感病毒的體外抑制試驗：①對流感病毒的直接抑制：燕窩酶解液和4 HAU 的病毒液混勻置于37 ℃孵育4 h，混合液加入MDCK 細(xì)胞感染1 h， 棄去混合液，用PBS 洗去多余病毒后加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；②對流感病毒吸附階段的抑制：燕窩酶解液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中吸附4 h，棄去后用PBS 洗去多余燕窩并加入4 HAU 的病毒液接種1 h， 棄去后用PBS 洗去多余病毒， 加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h； ③對流感病毒吸附后復(fù)制增殖的抑制：MDCK 細(xì)胞中加入 4 HAU 的病毒液接種 1 h，棄去后用PBS 洗去多余病毒， 用不含血清的燕窩酶解液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 試驗根據(jù)所需的樣本分為3 組：燕窩酶解液組、燕窩液組和中性蛋白酶組，同時設(shè)立病毒對照組。 24 h 后收集細(xì)胞上清進(jìn)行血凝試驗， 根據(jù)細(xì)胞上清在稀釋數(shù)倍后是否引起紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象判斷子代病毒產(chǎn)生量，每組重復(fù)2 次；收集細(xì)胞分別進(jìn)行實時熒光定量PCR 對流感病毒的核蛋白NP 和基質(zhì)蛋白M 的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測，每組重復(fù)3 次。

4.燕窩酶解液對流感病毒作用時間試驗

MDCK 細(xì)胞接種于 6 孔板， 用 4 HAU 病毒液吸附MDCK 細(xì)胞， 作用1 h 后用 PBS 洗去未吸附的病毒，接著加入無血清培養(yǎng)基進(jìn)行孵育。 將燕窩酶解液/燕窩液分別在吸附前4 h（-4 h）和吸附前2 h（-2 h），病毒開始孵育（0 h）、病毒孵育后 2 h（2 h）和孵育后4 h（4 h）加入細(xì)胞孔中。 24 h 后收集細(xì)胞采用實時熒光定量PCR 檢測流感病毒NP 的轉(zhuǎn)錄水平，每組重復(fù)3 次。 根據(jù)所用的試驗樣本分為燕窩酶解液組和燕窩液組，另設(shè)病毒對照組加入等量PBS。

5. 燕窩酶解液對流感病毒激活的NF-κB 及炎癥因子表達(dá)水平影響的檢測

燕窩酶解液和燕窩液分別與4 HAU 病毒液混合均勻置于 37 ℃孵育 4 h。 4 h 后分別加入到Raw264.7 細(xì)胞中感染1 h， 棄去混合液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 24 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行實時熒光定量PCR 和Western 印跡法，每組重復(fù)3 次。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用Grapad.Prism.v8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖繪制并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、液料比和酶解時長

從圖1 A 中可見， 燕窩中唾液酸的提取率隨液料比的增大而上升，在 45∶1 時最高，達(dá)到（35.24±0.18）%， 此后在液料比為 50∶1 時， 提取率下降至（11.38±0.02）%。 從圖 1 B 中可見，在液料比為 45∶1的條件下， 燕窩中唾液酸的提取率在3 h 時達(dá)到最大值，為（66.87±0.05）%，此后隨著酶解的時間延長提取率未見明顯升高。 為使燕窩中唾液酸的提取率達(dá)到理想條件，確定酶解的條件為：液料比45∶1 和酶解時長不低于3 h。

二、燕窩酶解液的細(xì)胞毒性

圖2 所示，隨著稀釋倍數(shù)的增加和樣本濃度的降低，燕窩酶解液組和中性蛋白酶組細(xì)胞生存率逐漸增高，燕窩組細(xì)胞生存率與濃度未見明顯的依賴關(guān)系。 選擇細(xì)胞生存率高于50%的濃度作為最大使用濃度，顯示燕窩酶解液組和燕窩液組的最大使用濃度均為1.22 mg/mL，中性蛋白酶組為0.69 mg/mL。

圖2 燕窩酶解液對MDCK 細(xì)胞毒性作用（n=6）

三、燕窩酶解液對流感病毒的體外抑制作用

1.對子代病毒的影響

如圖3 所示， 使用流感病毒吸附后復(fù)制增殖的抑制方式，燕窩酶解液組子代病毒產(chǎn)生量為病毒對照組的1/4；而使用直接抑制方式，子代病毒產(chǎn)生量為病毒對照組的1/2。 燕窩酶解液組和燕窩液組對流感病毒吸附階段的抑制作用不影響子代病毒的產(chǎn)生。

圖3 燕窩酶解液不同體外抑制方式對子代流感病毒產(chǎn)生量的影響

2.不同抑制方式對流感病毒基因NP 和M 轉(zhuǎn)錄水平的影響

采用直接抑制方式，不同組別的流感病毒基因NP 和 M 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.92，P=0.005；F=11.27，P=0.003），詳見表2。與病毒對照組相比，燕窩酶解液組NP 和M 的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低 （t=-2.81，P=0.023；t=-3.34，P=0.010）， 而中性蛋白酶組升高（t=2.16，P=0.040；t=2.38，P=0.045）。

采用吸附階段進(jìn)行抑制， 不同組別的流感病毒基因NP 和M 轉(zhuǎn)錄水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.14，P=0.018；F=14.31，P<0.001），詳見表 2。與病毒對照組相比， 燕窩酶解液組NP 和M 的轉(zhuǎn)錄水 平 升 高 近 2 倍 （t=2.56，P=0.034；t=3.41，P=0.009），而燕窩液組降低（t=-1.57，P=0.154；t=-3.11，P=0.014）。

采用吸附后復(fù)制增殖進(jìn)行抑制，不同組別的流感病毒基因M 的轉(zhuǎn)錄水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.24，P=0.017），詳見表 2。 相比病毒對照組，燕窩液組 M 的轉(zhuǎn)錄水平降低（t=-3.05，P=0.016）。

表2 燕窩酶解液不同體外抑制方式對病毒基因NP 和M 轉(zhuǎn)錄水平的影響

注：NP：流感病毒核蛋白；M：流感病毒基質(zhì)蛋白；三種抑制模式下各自病毒對照組的Ct 平均值取等于1；直接抑制模式下，NP：16.82±0.06；M：16.14±0.90；吸附階段抑制模式下，NP：13.51±1.03；M：12.78±0.18；吸附后復(fù)制增殖階段抑制模式下，NP：13.42±0.75；M：12.90±0.03；: 與病毒對照組相比，P<0.05；:與燕窩酶解液組相比，P<0.05

相對于病毒對照組病毒基因NP 和M 的相對轉(zhuǎn)錄水平直接抑制 吸附階段抑制 吸附后復(fù)制增殖階段抑制NP M NP M NP M燕窩酶解液組 3 0.41±0.14a 0.43±0.06a 1.09±0.16a 1.13±0.14a 1.69±0.27 1.67±0.24燕窩液組 3 0.73±0.20 0.74±0.13 0.91±0.18b 0.61±0.18ab 0.58±0.08 0.39±0.14ab中性蛋白酶組 3 1.52±0.34ab 1.41±0.31ab 1.40±0.20 1.00±0.12b 1.31±0.46a 0.93±0.29 F 值 9.92 11.27 6.14 14.31 3.79 6.24 P 值 0.005 0.003 0.018 <0.001 0.059 0.017組別 份數(shù)

四、燕窩酶解液在不同作用時間抑制流感病毒的效果

表3 顯示， 不同組別在不同作用時間NP 轉(zhuǎn)錄水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=230.90、5.76、197.00、427.20 和 39.89，P 均＜0.05）。 與病毒對照組相比，在0 h 和2 h 時燕窩酶解液組NP 基因的轉(zhuǎn)錄水平降低 10 倍 （t=-13.79，P=0.005；t=-21.84，P=0.002）；燕窩液組 NP 轉(zhuǎn)錄水平也降低 （t=-13.22，P=0.006；t=-36.94，P=0.001）， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義； 在-4 h和-2 h 及4 h 加入燕窩酶解液處組，NP 基因轉(zhuǎn)錄水平升高（t=19.22，P=0.003；t=2.97，P=0.097；t=2.43，P=0.136）。

表3 燕窩酶解液不同作用時間對流感病毒NP 轉(zhuǎn)錄水平的影響

注：組間兩兩比較采用LSD 檢驗，:表示與病毒對照組相比，P<0.05

不同作用時間流感病毒NP 的轉(zhuǎn)錄水平-4 h -2 h 0 h 2 h 4 h病毒對照組 3 4.84×106±2.72×105 1.15×107±3.03×105 1.14×107±9.64×105 1.36×107±6.29×105 1.11×107±6.12×105燕窩酶解液組 3 1.93×107±7.91×105a 1.42×107±1.03×106 1.08×106±1.14×105a 1.28×106±3.83×105a 1.35×107±8.43×105a燕窩液組 3 1.61×107±8.91×105a 1.34×107±9.36×105 2.69×106±3.39×104a 2.03×106±3.63×105a 1.81×107±89.13×105a F 值 230.90 5.76 197.00 427.20 29.89 P 值 <0.001 0.040 <0.001 <0.001 <0.001組別 份數(shù)

五、燕窩酶解液抑制流感病毒引起的炎癥因子表達(dá)的結(jié)果

表4 和圖4 顯示，與燕窩液組相比，燕窩酶解液組的病毒 NP、M、炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、NF-κB 及其家族成員 NF-κBp65 的轉(zhuǎn)錄水平均降低（t=-13.15、-15.27、-15.12、-21.31、-4.85、-7.40、-13.77 和-29.39，P 均＜0.05）。 燕窩酶解液處理組的NF-κBp65 及其前體IKK 蛋白的磷酸化程度和蛋白表達(dá)量也都降低。

圖4 燕窩酶解液抑制NF-κB 的蛋白表達(dá)結(jié)果

表4 燕窩酶解液對流感病毒基因及炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平的影響

注：NP：流感病毒核蛋白；M：流感病毒基質(zhì)蛋白

組別 份數(shù) 流感病毒基因及炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平NP M NF-κB NF-κBp65 IL-1β IL-6 TNF-α IFN-γ病毒+燕窩酶解液組 6 0.64±0.12 0.99±0.24 0.29±0.05 0.24±0.03 89.21±12.17 0.018±0.004 8.41±0.99 0.019±0.002病毒+燕窩液組 6 0.89±0.19 1.20±0.32 0.73±0.18 0.49±0.04 304.68±25.86 0.360±0.022 15.91±1.95 0.307±0.005 t 值 -13.15 -15.27 -13.77 -29.39 -15.12 -21.31 -4.85 -7.40 P 值 0.048 0.016 0.027 0.003 <0.001 <0.001 0.002 0.008

討 論

燕窩水提物可以抑制流感病毒感染犬腎細(xì)胞和紅細(xì)胞血凝反應(yīng), 能安全有效預(yù)防流感病毒。中性蛋白酶作為一種天然酶制劑，既能夠催化分解燕窩中蛋白質(zhì)為小分子的蛋白、 小肽和游離的氨基酸，同時其本身不會對燕窩的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響，本文通過對燕窩的酶解提取，探討其對抗病毒作用的影響，為進(jìn)一步研究燕窩抗流感機(jī)制提供參考。

一、確定了燕窩唾液酸提取率和燕窩酶解液的最大無毒濃度

在最佳液料比和酶解時長條件下，燕窩唾液酸的提取率可以達(dá)到（66.87±0.05）%，高于未經(jīng)酶解的燕窩唾液酸。本研究通過MTT 法測定出燕窩酶解液在細(xì)胞上最大無毒濃度為1.22 mg/mL。

二、燕窩酶解液可通過直接作用的方式抑制病毒感染并在感染初期發(fā)揮作用

從本文子代病毒產(chǎn)生的結(jié)果來看，燕窩酶解液可以通過直接抑制流感病毒和抑制病毒吸附后增殖的2 種方式來降低子代病毒產(chǎn)生量。 從病毒基因NP 和M 的轉(zhuǎn)錄水平上看， 燕窩酶解液僅能通過直接抑制的方式降低病毒基因轉(zhuǎn)錄，其作用機(jī)制可能是酶解液通過影響流感病毒的穿入和內(nèi)化過程降低了病毒NP 的轉(zhuǎn)錄水平。 本文試驗結(jié)果表明燕窩酶解液和燕窩液主要在病毒孵育初期（0 h）發(fā)揮作用，降低病毒基因NP 的轉(zhuǎn)錄。 相比燕窩液，燕窩酶解液的效果更好，NP 的表達(dá)更低。

三、燕窩酶解液可以降低炎癥因子的表達(dá)

NF-κB 的激活與流感病毒感染后雙向相關(guān)，感染早期NF-κB 被激活， 感染后期 NF-κB 參與病毒的復(fù)制。 本試驗結(jié)果顯示燕窩酶解液可以直接作用于流感病毒， 降低病毒基因NP 和M 的轉(zhuǎn)錄水平，降低 NF-κB 及其前體蛋白的表達(dá)。NF-κB 能啟動和調(diào)控眾多參與炎癥過程細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)，但燕窩如何激活免疫信號通路還需要深入研究。

四、結(jié)語

綜上，酶解過程可以提高燕窩中唾液酸的提取率，制備的燕窩酶解液可以抑制流感病毒轉(zhuǎn)錄水平NF-κB 蛋白及調(diào)控的炎癥因子的表達(dá)。 本文結(jié)果表明進(jìn)一步探討燕窩與流感病毒的作用機(jī)制，可以為流感病毒的防治和藥物研發(fā)提供新的思路。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

路鑫怡：實驗研究、采集數(shù)據(jù)、分析數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析、論文撰寫及修改；沃恩康，楊新燕，楊燦，徐琦，楊柳，何泳愉，項婷婷：論文修改；郭潮潭：研究指導(dǎo)、論文指導(dǎo)、經(jīng)費(fèi)支持