臭鱖魚源清酒乳桿菌的分離鑒定及其在臭鱖魚發(fā)酵中的應(yīng)用

周迎芹，孫子怡，黃晶晶，鄢 嫣，鄭海波，謝寧寧,*

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省食品微生物發(fā)酵與功能應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031；3.安徽科技學(xué)院食品工程學(xué)院， 安徽 滁州 239000）

臭鱖魚又稱腌鮮鱖，是利用新鮮鱖魚為原料，配以食鹽、花椒等輔料，由乳酸菌等多種微生物共同發(fā)酵制得的發(fā)酵魚制品。傳統(tǒng)自然發(fā)酵使臭鱖魚在加熱熟化后，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和細(xì)膩嫩滑的蒜瓣?duì)钊赓|(zhì)以及聞臭吃香的獨(dú)特風(fēng)味，市場(chǎng)接受度高，產(chǎn)業(yè)需求大。但在傳統(tǒng)自然發(fā)酵條件下，臭鱖魚發(fā)酵周期相對(duì)較長(zhǎng)，生產(chǎn)效率低；人工操作過程較為模糊，加工環(huán)境控制不嚴(yán)，產(chǎn)品質(zhì)量變化大，風(fēng)味品質(zhì)參差不齊，食用安全性存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，使其標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化生產(chǎn)受到嚴(yán)重阻礙。

微生物接種發(fā)酵技術(shù)是縮短發(fā)酵時(shí)間和改善產(chǎn)品品質(zhì)的有效途徑之一。微生物發(fā)酵菌種主要來源于傳統(tǒng)自然發(fā)酵制品，包括乳酸菌、葡萄球菌、微球菌、酵母菌和霉菌等。在傳統(tǒng)自然發(fā)酵臭鱖魚中，乳酸菌是其發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)微生物菌群。Dai Zhiyuan等和李燕通過傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)技術(shù)，系統(tǒng)研究了臭鱖魚在發(fā)酵過程中的微生物菌群組成，分離得到的乳酸菌主要為清酒乳桿菌（）、乳酸乳球菌（）、格氏乳球菌（）等，在發(fā)酵中后期，清酒乳桿菌成為臭鱖魚中特定的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。本實(shí)驗(yàn)室前期在對(duì)臭鱖魚不同發(fā)酵工藝微生物菌群組成解析時(shí)發(fā)現(xiàn)，清酒乳桿菌也是臭鱖魚在傳統(tǒng)干腌、濕腌工藝中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌菌群。但目前，在對(duì)臭鱖魚乳酸菌資源的開發(fā)利用研究中，鮮見有關(guān)清酒乳桿菌在臭鱖魚中的應(yīng)用研究報(bào)道?；诖?，本研究以自然發(fā)酵臭鱖魚為分離基質(zhì)，對(duì)其中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌——清酒乳桿菌進(jìn)行分離、鑒定，研究其生物學(xué)特性，并結(jié)合黃山臭鱖魚制作工藝，采用清酒乳桿菌接種發(fā)酵臭鱖魚，研究菌株對(duì)臭鱖魚發(fā)酵過程中特征蒜瓣的變化以及對(duì)質(zhì)構(gòu)、色澤和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，以期為臭鱖魚發(fā)酵基礎(chǔ)研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

臭鱖魚：采集于黃山臭鱖魚加工企業(yè)，為傳統(tǒng)低溫濕法腌制發(fā)酵16 d的成品。

鱖魚（）：購(gòu)于東至縣大聯(lián)圩有限公司，品種為秋浦花鱖，規(guī)格為0.5～0.6 kg/尾。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g、牛肉膏8 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸氫二銨2 g、乙酸鈉5 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.04 g、吐溫-80 1 mL，pH 6.5±0.2。

MRS-溴甲酚綠鑒別培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母粉10 g、番茄汁200 g、葡萄糖10 g、碳酸鈣20 g、溴甲酚綠0.1 g、吐溫-80 0.5 mL、瓊脂18 g，pH 6.0±0.2。

水瓊脂培養(yǎng)基（1 L）：瓊脂粉15 g。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉3 g、瓊脂18 g，pH 7.0±0.2。

培養(yǎng)基均用蒸餾水配制和定容，并經(jīng)高壓滅菌（1.0×10Pa，20 min）后備用。

1.1.3 試劑

食用鈉鹽、花椒等調(diào)料 市購(gòu)；氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乳酸菌生化鑒定試劑盒 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）聚合酶 北京天根生物有限公司。所有化學(xué)藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-240恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；T100 PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；JY600C電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；H1750R高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；CR-400色差分析儀 柯尼卡美能達(dá)控股公司；TA. XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro System公司；FlavourSpec氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）聯(lián)用儀 德國(guó)G.A.S.公司；臭鱖魚腌制發(fā)酵專用裝置由本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 清酒乳桿菌的分離鑒定

在無菌條件下，取臭鱖魚魚肉打成魚糜，用無菌生理鹽水將魚糜樣品稀釋至適當(dāng)濃度，劃線于MRS-溴甲酚綠平板上，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)（30 ℃，48 h）。挑取平板上呈黃色、有溶鈣圈的菌落進(jìn)行重復(fù)劃線培養(yǎng)，至菌株純化。通過革蘭氏染色、生理生化實(shí)驗(yàn)，完成對(duì)疑似乳酸菌菌株的初步篩選。

根據(jù)純化菌株在MRS-溴甲酚綠平板上的菌落特征，挑選符合清酒乳桿菌獨(dú)特菌落特征的菌株，即中心深綠色而周圍為淺綠色的菌落，進(jìn)一步進(jìn)行掃描電鏡觀察。通過細(xì)菌基因組提取試劑盒提取該菌基因組DNA，以通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（50 μL）：20 ng/μL模板1.0 μL，含2.5 mmol/L Mg的10×Buffer 5.0 μL，10 μmol/L上/下引物各1.5 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，5 U/μL聚合酶1.0 μL，ddHO 39.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海派森諾基因科技有限公司測(cè)序。通過MEGA 6.0軟件對(duì)菌株16S rDNA序列與NCBI乳桿菌屬菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 清酒乳桿菌的生物學(xué)特性

1.3.2.1 生長(zhǎng)條件優(yōu)化

以厭氧培養(yǎng)至24 h的菌液OD為評(píng)價(jià)指標(biāo)，先通過單因素試驗(yàn)，對(duì)菌株在MRS液體培養(yǎng)基中的初始pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），培養(yǎng)溫度（4、8、15、20、25、30、37、42 ℃），接種量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）進(jìn)行優(yōu)化，然后利用Design-Expert 11軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)組，以初始pH值、培養(yǎng)溫度和接種量3個(gè)因素為自變量，菌液OD為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化，響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 evels and codes of variables used for response surface analysis

1.3.2.2 生長(zhǎng)、產(chǎn)酸能力測(cè)定

將活菌數(shù)為1.0×10CFU/mL的SMF-L5種子液，按2%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，30 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，間隔2 h取樣，分別以平板瓊脂計(jì)數(shù)法和光電比濁法測(cè)定活菌數(shù)和培養(yǎng)液OD，繪制生長(zhǎng)曲線，用pH計(jì)測(cè)定pH值和用NaOH溶液滴定法測(cè)定菌株產(chǎn)酸量，各指標(biāo)平行測(cè)定3 次。

1.3.2.3 耐鹽、抑菌能力測(cè)定

將活菌數(shù)為1.0×10CFU/mL的SMF-L5種子液，以2%的接種量接種于含0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)24 h后的OD為評(píng)價(jià)指標(biāo)，測(cè)定菌株耐鹽能力。

將大腸桿菌（）、金黃色葡萄球菌（）以及從臭鱖魚中分離的腐生葡萄球菌（）、丁香假單胞菌（）分別劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，以30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)液作為指示菌菌懸液。

以2%接種量將清酒乳桿菌種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)18 h，離心（6 000 r/min，10 min）后取上清液，采用牛津杯雙層瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)乳酸菌上清液抑菌特性。即取10 mL滅菌的水瓊脂傾注于培養(yǎng)皿底層，待其干后在其上放置牛津杯，每個(gè)培養(yǎng)皿放置4個(gè)。按100 μL指示菌懸液/20 mL保溫至46 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂比例進(jìn)行混合，傾注于放置好牛津杯的培養(yǎng)皿內(nèi)，待其干后拔下牛津杯，以1 孔作為對(duì)照，向其中加入100 μL未接菌的MRS液體培養(yǎng)基，另外3 孔作為平行樣品，即向其中加入100 μL清酒乳桿菌上清液，4 ℃擴(kuò)散2 h，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。取出觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷菌株抑菌性能。耐鹽及抑菌能力測(cè)試均設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.3.3 清酒乳桿菌對(duì)臭鱖魚食用品質(zhì)及揮發(fā)性物質(zhì)形成的影響

1.3.3.1 發(fā)酵工藝流程

發(fā)酵工藝流程：新鮮鱖魚→宰殺→清洗→碼放→腌制→發(fā)酵→包裝。

傳統(tǒng)自然發(fā)酵操作步驟如下：a.取新鮮鱖魚，用魚鱗刷刷去魚體表面魚鱗，再經(jīng)剖腹宰殺，去除內(nèi)臟和魚鰓，用自來水和10%鹽水先后清洗一次，瀝水待用；b.將魚平整碼放于鱖魚發(fā)酵專用裝置內(nèi)，一桶約碼放30 kg，每碼一層，撒上若干粒干炒過的花椒（花椒總量為魚質(zhì)量的0.1%），碼放結(jié)束后在上層魚體上放置按壓板；c.向桶內(nèi)加入提前配制好的腌制液，即0.08 g/mL食鹽溶液，以剛好浸沒按壓板為宜，按壓板上放置扁圓狀砝碼（按壓質(zhì)量為魚質(zhì)量的40%），用以將魚體全部浸壓于腌制液液面以下；d.合上發(fā)酵裝置頂蓋，以厭氧發(fā)酵方式，8 ℃發(fā)酵16 d。

接種發(fā)酵則是將步驟c調(diào)整為：按1 kg魚添加1.25 g清酒乳桿菌濕菌體的量，將清酒乳桿菌充分溶于0.08 g/mL食鹽溶液中，作為腌制液。其他步驟同自然發(fā)酵操作步驟。

發(fā)酵結(jié)束后，將臭鱖魚取出，用清水清洗干凈，備用。

1.3.3.2 特征蒜瓣觀察

用解剖刀沿臭鱖魚的脊背和鰓蓋后沿，將兩側(cè)魚皮劃裂，并輕輕剝離至尾部，分別切取同側(cè)、沿背鰭下方至側(cè)線之間的肌肉塊，并置于蒸鍋中隔水蒸煮10 min，取出室溫下冷卻后剝離蒜瓣肉，肉眼觀察并拍照。

1.3.3.3 色澤、質(zhì)構(gòu)測(cè)定

參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法測(cè)定魚肉的色澤、質(zhì)構(gòu)，每個(gè)樣品平行測(cè)定6 次。

1.3.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法，采用GC-IMS測(cè)定和分析樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 清酒乳桿菌的分離與鑒定

利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)手段，從自然發(fā)酵臭鱖魚中分離到1 株符合清酒乳桿菌形態(tài)學(xué)特征的菌株，命名為SMF-L5。SMF-L5菌株在含溴甲酚綠的MRS固體平板上的菌落特征為綠色（中心綠色，周圍淺綠色），中央凸起，邊緣整齊，表面光滑（圖1A）；革蘭氏染色呈陽性，短桿狀排列，菌體大小約為1.0 μm×0.5 μm，無芽孢，無鞭毛，單個(gè)或成對(duì)，成鏈狀排列（圖1B、C）；可發(fā)酵纖維二糖、麥芽糖、水楊苷、蔗糖、菊糖和乳糖（表2）。對(duì)菌株SMF-L5的16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序，在GenBank中獲得序列登錄號(hào)為MZ208836。通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，證實(shí)菌株SMF-L5與6668、JBAR-SPR、subsp.JUL0153等菌株聚類在同一分枝上（圖2），因此確定為清酒乳桿菌。

圖1 清酒乳桿菌SMF-L5的形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characteristics of L. sakei SMF-L5

表2 清酒乳桿菌SMF-L5的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of L. sakei SMF-L5

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.2 清酒乳桿菌的生物學(xué)特性

2.2.1 清酒乳桿菌最適生長(zhǎng)條件

通過單因素試驗(yàn)對(duì)菌株SMF-L5在MRS液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件（初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量）進(jìn)行初步優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)初始pH值為4.0～6.0時(shí)，菌液OD隨著初始pH值的升高先逐漸升高，至pH 6.0～8.0時(shí)，菌液OD稍有下降；在培養(yǎng)溫度4～30 ℃時(shí)，菌液OD隨著溫度升高而升高，在30～42 ℃范圍內(nèi)則隨著溫度升高而下降；菌株初始接種量在0.5%～2%時(shí)，菌液OD隨接種量增加而升高，至2%～5%時(shí)又逐漸降低（圖3）。因此，將最適培養(yǎng)條件定為培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH 6.0、接種量2%。

圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)清酒乳桿菌SMF-L5生長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effects of different culture conditions on the growth of L. sakei SMF-L5

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3 模型回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial model

圖4 初始pH值、培養(yǎng)溫度與接種量交互作用對(duì)清酒乳桿菌SMF-L5 OD600 nm影響的響應(yīng)面圖Fig. 4 Response surface plots for individual and interactive effects of initial pH, growth temperature and inoculum on the growth of L. sakei SMF-L5

通過Design-Expert 11軟件對(duì)回歸方程求解得到模型最大值，即培養(yǎng)溫度30.9 ℃、初始pH 6.15、接種量1.94%，此時(shí)菌體最大生物量達(dá)2.31。在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得菌體生物量實(shí)際值為2.39±0.03，與理論值接近，表明該模型合理。

2.2.3 清酒乳桿菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酸能力

圖5 清酒乳桿菌SMF-L5生長(zhǎng)（A）、產(chǎn)酸（B）能力Fig. 5 Growth (A) and acid production ability (B) of L. sakei SMF-L5

菌株SMF-L5在培養(yǎng)最初，活菌數(shù)約為1.0×10CFU/mL，在4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14～24 h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，活菌數(shù)約達(dá)到7.0×10CFU/mL（圖5A），結(jié)果表明清酒乳桿菌在接種至培養(yǎng)基后具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和較快的生長(zhǎng)速率。菌株在4～14 h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，培養(yǎng)基pH值下降速率較快，進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后pH值降至4.2，這與它具有良好的適應(yīng)性有關(guān)，符合菌株的生長(zhǎng)曲線規(guī)律。在pH值不斷下降過程中，菌株也在持續(xù)產(chǎn)酸，最大產(chǎn)酸量達(dá)到10 g/L（圖5B）。表明菌株具有較強(qiáng)產(chǎn)酸能力，能夠有效降低發(fā)酵體系中的pH值。

2.2.4 清酒乳桿菌耐鹽、抑菌能力

2.2.4.1 清酒乳桿菌耐鹽能力

在研究菌株SMF-L5耐鹽能力時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaCl添加量在0～0.1 g/mL范圍內(nèi)，菌株生物量下降不明顯，至0.04～0.08 g/mL時(shí)，生物量有所下降，但OD仍可維持在1.5以上，高于0.08 g/mL后，生物量則下降比較明顯，OD低于1.0（圖6），表明菌株具有一定的耐鹽能力，在較高鹽濃度環(huán)境中仍可較好地生長(zhǎng)和繁殖。

圖6 清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)NaCl的耐受結(jié)果Fig. 6 Tolerance of L. sakei SMF-L5 to NaCl

2.2.4.2 清酒乳桿菌抑菌能力

圖7 清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)病原菌的抑制效果Fig. 7 Inhibitory effects of L. sakei SMF-L5 on pathogens

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及本實(shí)驗(yàn)室在臭鱖魚中常分離到的丁香假單胞菌、腐生葡萄球菌作為指示菌，研究清酒乳桿菌SMF-L5的抑菌能力，結(jié)果如圖7所示。SMF-L5菌株培養(yǎng)上清液對(duì)所有指示菌均有不同程度的抑制作用。對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到（14.42±0.21）mm和（18.40±0.46）mm，對(duì)臭鱖魚源丁香假單胞菌和腐生葡萄球菌抑菌圈直徑分別為（19.24±0.11）mm和（24.66±1.58）mm。

2.3 清酒乳桿菌對(duì)臭鱖魚食用品質(zhì)及揮發(fā)性物質(zhì)形成的影響

2.3.1 清酒乳桿菌對(duì)魚肉特征蒜瓣的影響

腌制發(fā)酵而成的臭鱖魚，其典型的品質(zhì)特征為魚肉呈蒜瓣?duì)?。沿背鰭下方至?cè)線之間的肌肉，其蒜瓣?duì)钣葹槊黠@。蒸煮后通過剝離可以發(fā)現(xiàn)，通過清酒乳桿菌接種發(fā)酵的臭鱖魚，其肉質(zhì)的蒜瓣?duì)畋茸匀话l(fā)酵臭鱖魚的肉質(zhì)蒜瓣?duì)罡?guī)則、更白亮（圖8）。

圖8 清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)臭鱖魚特征蒜瓣的影響Fig. 8 Influence of L. sakei SMF-L5 on the characteristic garlic clove-like appearance of fermented mandarin fish

2.3.2 清酒乳桿菌對(duì)魚肉色澤、質(zhì)構(gòu)的影響

通過清酒乳桿菌接種發(fā)酵后，臭鱖魚的色澤和白度均得到提升（圖9A），魚肉質(zhì)構(gòu)也產(chǎn)生了變化，硬度在接種發(fā)酵后有所降低，黏附性、彈性、膠黏性和咀嚼性則均有所增加（圖9B），表明清酒乳桿菌接種發(fā)酵可改善臭鱖魚的色澤和質(zhì)構(gòu)，使臭鱖魚魚肉更為白亮、更有彈性。

圖9 清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)臭鱖魚色澤（A）、質(zhì)構(gòu)（B）的影響Fig. 9 Influence of L. sakei SMF-L5 on the color (A) and texture (B) of fermented mandarin fish

2.3.3 清酒乳桿菌對(duì)魚肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響

通過GC-IMS的GC保留時(shí)間和IMS遷移時(shí)間對(duì)接種發(fā)酵、自然發(fā)酵臭鱖魚中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定，共鑒定出36種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類11種、酮類8種、醛類5種、酯類5種、酸類2種、醚類3種、烯烴類2種（表4）。為進(jìn)一步比較接種發(fā)酵、自然發(fā)酵臭鱖魚中揮發(fā)性物質(zhì)組分的差異，利用LAV軟件將三維譜圖中的特征峰生成指紋圖譜（圖10），在指紋圖譜中，每縱列特征峰對(duì)應(yīng)一種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。接種發(fā)酵的臭鱖魚，丁酸乙酯、乙酸己酯、羥基丙酮、2,3-丁二醇、玫瑰醚、甲硫醇、2,3-戊二酮、甲硫基丙醛、2-辛醇、丙醇和4-甲基-2-戊酮等的含量明顯低于自然發(fā)酵臭鱖魚，而芳樟醇、-松油醇、-蒎烯、檸檬烯等揮發(fā)性香氣成分的含量比自然發(fā)酵臭鱖魚明顯增加，表明清酒乳桿菌接種發(fā)酵臭鱖魚，能夠降低魚肉中惡臭氣味的產(chǎn)生和促進(jìn)香氣物質(zhì)的生成。

表4 接種、自然發(fā)酵臭鱖魚中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 4 Volatile substances of fermented mandarin fish using inoculated and spontaneous fermentations

續(xù)表4

圖10 清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)臭鱖魚揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響Fig. 10 Influence of L. sakei SMF-L5 on volatile flavor substances of fermented mandarin fish

3 討 論

乳酸菌是世界公認(rèn)的食品級(jí)安全微生物，被廣泛用于食品發(fā)酵以及天然食品防腐劑等食品工業(yè)上。在發(fā)酵魚制品中，乳酸菌是主導(dǎo)發(fā)酵過程的優(yōu)勢(shì)菌群之一，在改善發(fā)酵制品風(fēng)味、延長(zhǎng)保質(zhì)期、加速色澤形成和提高產(chǎn)品安全等方面發(fā)揮著不可替代的作用。傳統(tǒng)臭鱖魚發(fā)酵工藝屬于多菌種參與的、開放式的自然發(fā)酵，發(fā)酵體系中含有大量病原微生物，產(chǎn)品安全性不能得到有效保證，產(chǎn)品質(zhì)量和風(fēng)味品質(zhì)穩(wěn)定性差，通過乳酸菌發(fā)酵臭鱖魚，有望能夠解決這些問題。

清酒乳桿菌最早是從發(fā)酵米酒中分離獲得，現(xiàn)已知泡菜、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵香腸和發(fā)酵魚等自然發(fā)酵制品也是獲得清酒乳桿菌的良好來源。傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)是獲取純菌株必不可少的步驟，也是進(jìn)一步篩選優(yōu)良菌株的基礎(chǔ)。含溴酚藍(lán)或溴甲酚綠的MRS培養(yǎng)基適用于產(chǎn)酸類乳酸菌的篩選。嗜酸乳桿菌（）、植物乳桿菌（）、羅伊氏乳桿菌（）、雙歧桿菌（）等乳酸菌在含溴酚藍(lán)的MRS培養(yǎng)基上較易區(qū)分，植物乳桿菌、清酒乳桿菌和格氏乳球菌等乳酸菌在含溴甲酚綠的MRS培養(yǎng)基上形態(tài)差異較為明顯。清酒乳桿菌在含溴甲酚綠的MRS培養(yǎng)基上，其典型形態(tài)特征為菌落中心綠色、周圍淺綠色或中心綠色、周圍白色。努爾古麗?熱合曼等為跟蹤清酒乳桿菌在酸駝乳發(fā)酵過程中的作用，基于含溴甲酚綠的MRS鑒別培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)了自然發(fā)酵酸駝乳中清酒乳桿菌的快速識(shí)別和分離。本實(shí)驗(yàn)在明確清酒乳桿菌為傳統(tǒng)發(fā)酵臭鱖魚中優(yōu)勢(shì)乳酸菌的前提下，借助含溴甲酚綠的MRS鑒別培養(yǎng)基從臭鱖魚中也成功分離到清酒乳桿菌，進(jìn)一步說明基于含溴甲酚綠的MRS鑒別培養(yǎng)基分類鑒定清酒乳桿菌的方法，簡(jiǎn)單、快速可行。

良好的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)速率及生物量積累至關(guān)重要。乳酸菌的生長(zhǎng)受環(huán)境中溫度影響較大，pH值對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)也具有較大影響。在本實(shí)驗(yàn)中，清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)溫度、pH值等生長(zhǎng)條件具有較寬的適應(yīng)范圍，這很可能是清酒乳桿菌能夠成為臭鱖魚在自然發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)菌的主要原因。乳酸菌生長(zhǎng)代謝形成的低pH值發(fā)酵環(huán)境能夠有效抑制腐敗菌、致病菌的生長(zhǎng)和減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生，從而提高產(chǎn)品的安全性。林城杏以傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚中篩選出的植物乳桿菌接種發(fā)酵酸魚，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可明顯抑制產(chǎn)胺腸桿菌等腐敗菌和病原菌的生長(zhǎng)，同時(shí)也使魚肉中的生物胺含量有所減少。以產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌應(yīng)用于臭鱖魚發(fā)酵生產(chǎn)，將是主導(dǎo)臭鱖魚發(fā)酵過程、提升產(chǎn)品安全品質(zhì)的一種有效途徑。

在發(fā)酵食品制作過程中，加入食鹽可一定程度抑制腐敗菌等雜菌的生長(zhǎng)，在鹽腌發(fā)酵技術(shù)基礎(chǔ)上，通過添加耐鹽性微生物主導(dǎo)發(fā)酵過程，有利于縮短發(fā)酵時(shí)間和提升產(chǎn)品品質(zhì)。當(dāng)前臭鱖魚規(guī)模化生產(chǎn)主要以濕法腌制發(fā)酵工藝為主，鹽水質(zhì)量濃度控制在0.06～0.08 g/mL。清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)高達(dá)0.08 g/mL鹽質(zhì)量濃度的培養(yǎng)條件仍具有較高的耐受能力，因此適于在臭鱖魚發(fā)酵體系中生長(zhǎng)。

清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等食品中常見病原菌的抑制作用，與肉及肉制品中被普遍分離到的清酒乳桿菌，具有相似的結(jié)果。在發(fā)酵香腸中，清酒乳桿菌能夠快速成為其中的優(yōu)勢(shì)菌，并能夠明顯抑制大腸桿菌和腸桿菌的生長(zhǎng)。如果將臭鱖魚源清酒乳桿菌接種至臭鱖魚發(fā)酵體系中，可使其成為主導(dǎo)發(fā)酵過程的優(yōu)勢(shì)菌群并抑制其他雜菌的生長(zhǎng)。

清酒乳桿菌SMF-L5在接種發(fā)酵臭鱖魚時(shí)，可能是通過改變發(fā)酵體系中的菌群結(jié)構(gòu)，抑制產(chǎn)臭微生物生長(zhǎng)和減少細(xì)菌種類、數(shù)量，形成優(yōu)于自然發(fā)酵臭鱖魚的風(fēng)味。在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，芳樟醇、-松油醇、-蒎烯和檸檬烯可賦予臭鱖魚具有植物花香的風(fēng)味特征，是在發(fā)酵過程中由添加的花椒所帶入。這些成分也是植物花椒本身主要的揮發(fā)性物質(zhì)，隨著腌制發(fā)酵過程的進(jìn)行，花椒中的風(fēng)味物質(zhì)逐漸滲透進(jìn)入魚體，構(gòu)成魚肉重要的風(fēng)味物質(zhì)。在臭鱖魚風(fēng)味研究中，芳樟醇是常見的揮發(fā)性物質(zhì)，且被認(rèn)為對(duì)臭鱖魚整體風(fēng)味品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)的風(fēng)味活性物質(zhì)。

4 結(jié) 論

通過含溴甲酚綠的MRS鑒別培養(yǎng)基，結(jié)合革蘭氏染色、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定方法從傳統(tǒng)自然發(fā)酵臭鱖魚中分離到一株清酒乳桿菌，命名為SMF-L5。清酒乳桿菌SMF-L5在MRS液體培養(yǎng)基中的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度30.9 ℃、初始pH 6.15、接種量1.94%；該菌可耐受0.08 g/mL NaCl，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌和丁香假單胞菌具有明顯的抑制作用；在應(yīng)用于臭鱖魚發(fā)酵時(shí)，能夠使臭鱖魚具有更規(guī)則、更白亮的蒜瓣?duì)钊赓|(zhì)和更具彈性的質(zhì)構(gòu)，同時(shí)還能使臭鱖魚產(chǎn)品的風(fēng)味得到提升。因此，表明臭鱖魚源清酒乳桿菌SMF-L5可作為良好的乳酸菌發(fā)酵劑，在臭鱖魚工業(yè)化生產(chǎn)上具有應(yīng)用潛力。