復(fù)合米糠蛋白-卵白蛋白的起泡特性及相關(guān)機理分析

張燕鵬，張曼君，刁云春，張維農(nóng)，胡志雄，胥 偉,*

（1.武漢輕工大學(xué) 大宗糧油精深加工教育部重點實驗室，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

米糠蛋白（rice bran protein，RBP）不僅氨基酸配比合理均衡，營養(yǎng)價值較高，而且具有低過敏性、高消化率等良好的生理功能特性，因此是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源，特別適合開發(fā)應(yīng)用于嬰幼兒和特殊人群營養(yǎng)配方食品。另外RBP中高含量的白蛋白和球蛋白使其具有較好的溶解性和其他相關(guān)的加工功能特性，如起泡性和乳化性，因此也可被研究作為起泡劑與乳化劑而應(yīng)用于食品加工中。卵白蛋白（ovalbumin，OVA）作為蛋清中的主要蛋白質(zhì)，因其分子結(jié)構(gòu)中含有較多的疏水性氨基酸組分，可作為乳化劑和發(fā)泡劑以使得多相體系保持良好的穩(wěn)定特性，因此是食品加工制備過程中一種良好的功能性成分。已有研究表明，RBP在等電點附近的起泡能力較差，而OVA在等電點附近時其起泡能力則較好，這表明不同來源的蛋白質(zhì)根據(jù)環(huán)境因子的變化會表現(xiàn)出不同的起泡特性，這也使得單一蛋白質(zhì)在泡沫型食品加工過程中具有一定的局限性。因此在實際應(yīng)用中如果可以將兩種或更多的蛋白質(zhì)復(fù)配應(yīng)用，不僅可以增加蛋白質(zhì)營養(yǎng)功效，同時也是一種簡單高效的改善蛋白質(zhì)溶液功能特性的方法。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)RBP溶液pH 4.0和pH 7.0時，添加1%的NaCl其起泡能力可以顯著性增加，但只對pH 7.0條件下的泡沫穩(wěn)定性有顯著改善。因此結(jié)合上述的相關(guān)內(nèi)容，本實驗主要研究在pH 4.0和pH 7.0條件下添加1% NaCl后，RBP-OVA所組成RBP-OVA復(fù)合蛋白溶液起泡特性的變化規(guī)律，并對比研究分析溶液狀態(tài)和泡沫狀態(tài)下相關(guān)蛋白質(zhì)的理化特性，以探討RBP-OVA復(fù)合蛋白在起泡特性上的互補協(xié)同作用及其相關(guān)機理，以期為復(fù)合蛋白質(zhì)在實際應(yīng)用中提供理論依據(jù)，并為促進(jìn)RBP在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RBP（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)84.9%）由實驗室自制；OVA（純度62%～88%）、1-苯胺基萘-8-磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS，分析純） 美國Sigma公司；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SorvallRC6Plus型高速冷凍離心機 美國Thermo Scientific公司；FiveEasy實驗pH計 瑞士Mettle Toledo公司；Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；KND-103F自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；手持式30631型電動打蛋器 日本ECHO公司；Zetasizer-NanoZS納米粒度電位儀 英國Malvern Instrument公司；F-4600熒光分光光度計 日本日立公司；HJ-4多頭磁力加熱攪拌器 金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RBP與OVA的復(fù)合蛋白質(zhì)溶液配制

分別稱取適量的RBP與OVA配制5 mg/mL蛋白質(zhì)溶液，于磁力攪拌器上攪拌2 h后放入4 ℃冰箱水化過夜。將按照RBP-OVA質(zhì)量比分別為1∶0、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1配制蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL的RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)溶液，并分別調(diào)節(jié)至pH 4.0和pH 7.0，另外取部分RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)溶液再添加1% NaCl以研究鹽離子對其起泡特性的影響。

1.3.2 蛋白質(zhì)溶液起泡特性的測定

起泡特性的測定在解長遠(yuǎn)和Sheng Long等方法基礎(chǔ)上作一定的修改。取30 mL蛋白質(zhì)溶液于特制帶刻度的試管（直徑4 cm、高10 cm）中，將電動打蛋器伸入到溶液中約1 cm處，攪拌15 s后，立即測量泡沫體積，靜置2 h后再次測定體積。按式（1）、（2）計算蛋白質(zhì)的起泡能力及泡沫穩(wěn)定性：

1.3.3 泡沫狀態(tài)下蛋白質(zhì)樣品的制備

取RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)溶液，按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行攪打起泡后，收集其上層泡沫待消泡后備用。

1.3.4 蛋白質(zhì)粒徑分布與Zeta電位測定

根據(jù)Wouters等的方法測定蛋白質(zhì)的粒徑分布與Zeta電位。取一定量的蛋白質(zhì)溶液，于25 ℃、8 000 r/min離心15 min，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，采用納米粒度電位儀，測定蛋白質(zhì)溶液的粒徑分布與Zeta電位。

1.3.5 蛋白質(zhì)的表面疏水性測定

參考馮芳等的方法，用ANS作熒光探針測定蛋白質(zhì)的表面疏水性。取配制好的蛋白質(zhì)溶液在25 ℃、8 000 r/min離心20 min后，分別配制質(zhì)量濃度0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，并依次在5 mL不同質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)溶液中加入20 μL 8.0 mmo1/L的ANS溶液。采用熒光分光光度計測定加入ANS的蛋白質(zhì)樣品溶液及對照溶液的熒光強度，設(shè)定激發(fā)光和發(fā)射光分別為390 nm和470 nm，設(shè)定狹縫寬度為5 nm，將測定數(shù)據(jù)以蛋白質(zhì)量濃度和熒光強度分別為橫縱坐標(biāo)作圖，曲線斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)。

1.3.6 蛋白質(zhì)的熒光光譜測定

參考Zhang Yanpeng等的方法測定RBP內(nèi)源熒光光譜。取配制好的蛋白質(zhì)溶液在25 ℃、8 000 r/min離心15 min后，將蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)為0.2 mg/mL，使用熒光光譜儀，設(shè)定激發(fā)波長為295 nm，在300～480 nm范圍內(nèi)1 200 nm/s進(jìn)行掃描分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3 次求平均值，采用Origin 8.5和SPSS分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)溶液的起泡特性分析

2.1.1 蛋白質(zhì)溶液在pH 4.0條件下的起泡特性

圖1 蛋白質(zhì)溶液在pH 4.0條件下的起泡特性Fig. 1 Foaming properties of proteins at pH 4.0

由圖1a可知，當(dāng)pH 4時RBP的起泡能力明顯低于OVA，二者分別為20.0%和37.2%，而隨著RBP在RBPOVA復(fù)合蛋白中含量的減少，其起泡能力逐漸增加。這可能與兩種蛋白質(zhì)在pH 4.0條件下所帶的凈電荷量，蛋白溶解度，粒徑分布及分子結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，而這些理化性質(zhì)可以影響蛋白質(zhì)分子在界面的吸附速度，從而使其具有不同的起泡能力。由圖1b可知，當(dāng)pH 4.0時RBP的泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于OVA，且當(dāng)RBP-OVA質(zhì)量比為3∶1、1∶1和1∶3時，RBP-OVA復(fù)合蛋白在2 h以后的泡沫穩(wěn)定性相對OVA有顯著（＜0.05）的改善，并且在1∶1和1∶3條件下RBP-OVA復(fù)合蛋白溶液的泡沫穩(wěn)定性在2 h后表現(xiàn)為協(xié)同作用，泡沫穩(wěn)定性均高于單一的蛋白質(zhì)溶液，這可能由于兩種蛋白質(zhì)在該條件下可以在界面處產(chǎn)生相互作用形成較好的黏彈性界面膜，使得RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)溶液的泡沫體系相對穩(wěn)定。

圖2 蛋白質(zhì)在pH 4.0、1% NaCl條件下的起泡特性Fig. 2 Foaming properties of proteins under pH 4.0 and 1% NaCl conditions

由圖2a可知，在加入1% NaCl后兩種蛋白質(zhì)的起泡能力均顯著增加，且RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)的起泡能力表現(xiàn)為協(xié)同作用，特別是當(dāng)RBP-OVA質(zhì)量比為3∶1時，RBPOVA復(fù)合蛋白質(zhì)的起泡能力可達(dá)176.9%，與OVA的起泡能力相比沒有顯著性差異（＞0.05）。這說明鹽離子的添加可改變蛋白質(zhì)的表面凈電荷，粒徑分布或者分子結(jié)構(gòu)，從而使得蛋白質(zhì)分子易于吸附至氣-水界面。由圖2b可知，隨著OVA在RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)中比例的增加，其泡沫穩(wěn)定性顯著下降，當(dāng)RBP-OVA質(zhì)量比為3∶1時，RBP-OVA復(fù)合蛋白在1～1.5 h內(nèi)的泡沫穩(wěn)定性相對RBP泡沫穩(wěn)定性無顯著差異（＞0.05），但相比OVA則有顯著（＜0.05）的改善。另外與未加NaCl的RBPOVA復(fù)合蛋白溶液相比，RBP-OVA質(zhì)量比為3∶1時的RBP-OVA復(fù)合蛋白在2 h內(nèi)的泡沫穩(wěn)定性可顯著性增加至86.7%，這表明在該條件下RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與物化性質(zhì)可保持較好的平衡，既能使其起泡能力得到較好的改善，同時也能使RBP-OVA復(fù)合蛋白保持較好的泡沫穩(wěn)定性，從而為在等電點附近蛋白質(zhì)得到更廣泛的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

2.1.2 蛋白質(zhì)溶液在pH 7.0下的起泡特性

由圖3a可知，當(dāng)pH 7.0時，RBP的起泡能力優(yōu)于OVA，且RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)起泡能力隨RBP比例的減少而降低。這表明與pH 4.0相比，兩種蛋白質(zhì)的物化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)在pH 7.0發(fā)生了改變，使得其起泡能力發(fā)生了變化。圖3b結(jié)果表明，在pH 7.0條件下，RBP的泡沫穩(wěn)定性比OVA的穩(wěn)定性差，OVA泡沫穩(wěn)定性在4 h后依然可高達(dá)73.8%，因此在RBP中加入OVA后可一定程度上改善其泡沫穩(wěn)定性，但隨著OVA比例的增加其改善效果并沒有明顯的增加，這說明OVA對RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)泡沫穩(wěn)定性的提高有限。

圖3 蛋白質(zhì)在pH 7.0條件下的起泡特性Fig. 3 Foaming properties of proteins at pH 7.0

由圖4a可知，RBP的起泡能力優(yōu)于OVA，起泡能力可達(dá)103.0%，但RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)起泡能力隨RBP比例的減少先減少后增加。與圖3a相比，在pH 7.0條件下NaCl的添加均可以使得蛋白質(zhì)的起泡能力增加，但RBPOVA復(fù)合蛋白質(zhì)的起泡能力則表現(xiàn)為拮抗作用，這說明NaCl的添加使得兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用不利于RBPOVA復(fù)合蛋白快速的吸附至氣-水界面以降低界面張力。圖4b結(jié)果表明，在該條件下，RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)泡沫穩(wěn)定性隨RBP比例的減少先增加后減少，其泡沫穩(wěn)定性表現(xiàn)為協(xié)同作用，當(dāng)RBP-OVA質(zhì)量比為1∶1時，起泡后4 h其泡沫穩(wěn)定性依然可維持在69.4%，這可能與兩種蛋白質(zhì)在界面處的相互作用有關(guān)。

圖4 復(fù)合蛋白質(zhì)在pH 7.0、1% NaCl條件下的起泡特性Fig. 4 Foaming properties of mixed proteins under pH 7.0 and 1%NaCl conditions

綜合上述有關(guān)蛋白質(zhì)起泡特性的相關(guān)分析，進(jìn)一步研究分析在pH 4.0、1% NaCl的條件下，RBP、OVA以及RBP-OVA復(fù)合蛋白（RBP-OVA質(zhì)量比為3∶1）3種蛋白質(zhì)體系的相關(guān)物化性質(zhì)。因為在該環(huán)境條件下，兩種蛋白質(zhì)在起泡能力上表現(xiàn)為協(xié)同作用的同時也有效改善了RBP-OVA復(fù)合蛋白的泡沫穩(wěn)定性。另外pH 4.0接近兩種蛋白質(zhì)的等電點，通過對該條件下RBP-OVA復(fù)合蛋白的相關(guān)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，有利于促進(jìn)兩種蛋白在等電點時的加工利用。

2.2 蛋白質(zhì)在溶液與泡沫狀態(tài)下的粒徑分布分析

由圖5可知，對于各種蛋白質(zhì)樣品而言，氣-液界面處的蛋白質(zhì)與溶液中蛋白質(zhì)具有相似的粒徑分布。在pH 4.0、1% NaCl的條件下RBP的粒徑大于OVA，而當(dāng)在RBP中加入OVA后，RBP-OVA復(fù)合蛋白的粒徑則變小且其粒徑與OVA一致。這說明OVA的加入改變了蛋白質(zhì)分子間的相互聚集狀態(tài)，使得RBP-OVA復(fù)合蛋白的粒徑變小，從而使其更易于快速擴散至氣-液界面以改善RBPOVA復(fù)合蛋白的起泡能力。

圖5 蛋白質(zhì)在溶液與泡沫狀態(tài)下的粒徑分布Fig. 5 Particle size distribution of proteins in solution and foam

2.3 蛋白在溶液與泡沫狀態(tài)下的Zeta電位分析

由表1可知，在溶液狀態(tài)下OVA所帶凈電荷量小于RBP，而較少的凈電荷量有利于降低蛋白質(zhì)在界面吸附時的空間位阻能量，因此有利于卵蛋白更快的吸附于界面，提高其起泡能力。當(dāng)兩種蛋白復(fù)合時，RBP-OVA復(fù)合蛋白的凈電荷量增加，這說明在pH 4.0、1% NaCl條件下兩種蛋白質(zhì)之間可能發(fā)生了相互作用，使得RBPOVA復(fù)合蛋白所帶表面電荷增加，水化能力增強，有利于增大其溶解性，進(jìn)而使得RBP-OVA復(fù)合蛋白的起泡能力顯著增加（圖2a）。另外表1顯示泡沫狀態(tài)下RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)與OVA所帶凈電荷相對溶液狀態(tài)下均有所增加，這可能是因為這兩類蛋白質(zhì)在界面處所受鹽離子的電荷屏蔽作用較弱，而蛋白質(zhì)表面凈電荷的增加可以使得氣泡之間的電荷排斥作用增強，有利于泡沫體系的穩(wěn)定性。從不同蛋白質(zhì)在溶液與泡沫狀態(tài)下的Zeta電位的變化可知，凈電荷的變化會一定程度上影響RBP-OVA復(fù)合蛋白的起泡能力與穩(wěn)定性，但同時也要考慮其他因素比如蛋白質(zhì)在界面處的排列與相互作用及表面疏水性等物化性質(zhì)對其起泡特性的影響。

表1 蛋白質(zhì)在溶液與泡沫狀態(tài)下的Zeta電位Table 1 Zeta potential of proteins in solution and foam

2.4 蛋白質(zhì)在溶液與泡沫狀態(tài)下的表面疏水性分析

由圖6可知，在溶液和泡沫狀態(tài)下，OVA因其含有較多的疏水基團(tuán)，蛋白質(zhì)的表面疏水性較高，并且隨RBP所占比例的減少RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)的表面疏水性也顯著增加，而表面疏水性的增高有利于RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)更容易附到氣-液界面形成泡沫體系。同時結(jié)合粒徑以及Zeta電位的實驗結(jié)果可知，OVA的物化性質(zhì)更有利于RBP-OVA復(fù)合蛋白起泡能力的提高，這也與圖2a中蛋白質(zhì)起泡能力結(jié)果一致。圖6結(jié)果還表明，泡沫狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表面疏水性低于溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，這說明對于蛋白質(zhì)的起泡特性而言，蛋白質(zhì)的表面疏水性達(dá)到一定程度后將不會再對其起泡特性產(chǎn)生影響，因此還需要考慮吸附于界面的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的影響。

圖6 蛋白質(zhì)的表面疏水性分析Fig. 6 Analysis of surface hydrophobicity of proteins

2.5 蛋白質(zhì)在溶液與泡沫狀態(tài)下的熒光光譜分析

由圖7可知，在pH 4.0、1% NaCl的環(huán)境條件下，RBP熒光圖譜中的最大發(fā)射波長在356 nm，而OVA與RBP-OVA復(fù)合蛋白的最大發(fā)射波長則在338 nm左右，這說明RBP的分子結(jié)構(gòu)相對比較展開，分子柔性較高，因此其在界面可以快速發(fā)生重排以行成黏彈性界面膜，從而有利于泡沫體系的穩(wěn)定性。當(dāng)RBP溶液中加入OVA后，RBP-OVA復(fù)合蛋白的最大熒光波長發(fā)生藍(lán)移，這說明RBP與OVA發(fā)生相互作用而使得RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)分子發(fā)生折疊而變的緊密，使得RBP-OVA復(fù)合蛋白質(zhì)的分子柔性結(jié)構(gòu)相對弱于RBP，因此在泡沫穩(wěn)定性上低于RBP。同時OVA與RBP-OVA復(fù)合蛋白在泡沫狀態(tài)下的熒光強度低于液體狀態(tài)，這表明界面處蛋白質(zhì)分子微環(huán)境的極性增加，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生去了去折疊。

圖7 蛋白質(zhì)在溶液與泡沫狀態(tài)下的內(nèi)源熒光光譜圖Fig. 7 Intrinsic fluorescence spectra of proteins in solution and foam

綜合上述研究可知，RBP與OVA在pH 4.0、1% NaCl的環(huán)境條件下之所以可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，主要是因為二者在與起泡特性相關(guān)的分子特性方面具有一定的互補性，這樣有利于從物化性質(zhì)的不同方面改善RBP-OVA復(fù)合蛋白的起泡能力與泡沫穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

分析了在pH 4.0、7.0，1% NaCl等環(huán)境條件下，RBP、OVA及二者復(fù)合蛋白的起泡特性。研究結(jié)果表明NaCl的添加有利于改善蛋白質(zhì)的起泡能力，且在pH 4.0、NaCl添加量為1%的條件下，當(dāng)RBP-OVA質(zhì)量比為3∶1時，其RBP-OVA復(fù)合蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性達(dá)到一個相對平衡的狀態(tài)，起泡能力可達(dá)176.9%，泡沫在2 h內(nèi)可穩(wěn)定在86.7%。這表明在適合的條件下以一定的比例將蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)合，可改善蛋白質(zhì)產(chǎn)品的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性，這對泡沫型食品加工的實際加工應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

通過對蛋白質(zhì)在溶液和泡沫狀態(tài)下相關(guān)物化性質(zhì)的研究表明，在pH 4.0、1% NaCl的環(huán)境條件下，RBP與OVA之間可發(fā)生相互作用而影響RBP-OVA復(fù)合蛋白的凈電荷量、粒徑、表面疏水性及分子結(jié)構(gòu)等蛋白質(zhì)分子特性，并且這些分子特性在起泡能力與泡沫穩(wěn)定性方面可以產(chǎn)生一定的協(xié)同效應(yīng)以改善RBP-OVA復(fù)合蛋白的起泡特性。