含款冬花和紫草的中成藥制劑中吡咯里西啶生物堿的鑒定和含量分析△

劉春雨，張燕，董愛軍，楊飛飛，齊耀東，孫迪安，斯建勇，廖永紅

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

吡咯里西啶類生物堿（PAs）被認(rèn)為是食品與草藥中最為廣泛和最嚴(yán)重的內(nèi)源性與摻雜性的有毒天然產(chǎn)物，可導(dǎo)致肝、腎、肺、神經(jīng)、基因/遺傳、發(fā)育等方面毒性[1-2]。在《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版里收錄的常用中藥材中，千里光（Senecionis Scandentis Herba）、佩蘭（Eupatorii Herba）、款冬花（Farfarae Flos）、紫草（Arnebiae Radix）等已被報道含有較高的PAs[2-7]。由于PAs 在中藥提取和制劑制備過程中具有很好的穩(wěn)定性，其在中成藥制劑中轉(zhuǎn)移率都比較高，因此，含PAs 藥材的中成藥制劑可能含有較高的PAs[4]。通過對含千里光和佩蘭的中成藥PAs 含量測定發(fā)現(xiàn)，藥材中的PAs 可轉(zhuǎn)移到中成藥制劑中，含千里光和佩蘭的制劑中PAs 的平均日攝入量分別為77.5～487.0、7.0～336.0 μg，部分制劑可能存在安全風(fēng)險，需加強(qiáng)對中成藥制劑中PAs 含量的質(zhì)量控制[4,8]?？疃ê妥喜菔嵌鄠€上市中成藥的組方成分，但這些中成藥制劑中PAs 的含量尚未見報道，因此，本研究擬對14種含款冬花、10種含紫草的中成藥制劑中的PAs 含量進(jìn)行分析，以期為其產(chǎn)品質(zhì)量控制和臨床安全提供參考。

1 材料

1.1 儀器

AB Sciex API 4000 型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Phenomenex Prodigy 5μ ODS3 100A 色譜柱（美國飛諾美公司）；Q50 型TGA 熱重分析儀（美國TA 儀器公司）；CPA22D 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；JR-500D 型超聲波清洗機(jī)［精銳澤祥（北京）儀器有限公司］；MULTI-SPE-M08正壓型多功能固相萃取裝置（天津博納艾杰爾科技有限公司）；混合型陽離子固相萃取小柱（PCX-SPE，500 mg·mL-1，天津博納艾杰爾科技有限公司）；Micro 17R 型臺式離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 試藥

34個PAs對照品（德國PhytoLab公司，純度均≥95%）分別為藍(lán)薊定（Em）、藍(lán)薊定氮氧化物（EmNO）、芝麻菜葉千里光堿（Er）、芝麻菜葉千里光氮氧化物（ErNO）、歐天芥菜堿氮氧化物（EuNO）、天芥菜堿（He）、天芥菜堿氮氧化物（HeNO）、印美定（Im）、印美定氮氧化物（ImNO）、夾可賓（Jb）、夾可賓氮氧化物（JbNO）、毛果天芥菜堿（Lc）、毛果天芥菜氮氧化物（LcNO）、石松胺（Ly）、石松胺氮氧化物（LyNO）、野百合堿（Mc）、野百合堿氮氧化物（McNO）、倒千里光堿（Re）、倒千里光堿氮氧化物（ReNO）、千里光寧堿（Sn）、千里光寧堿氮氧化物（SnNO）、千里光菲林堿（Sp）、春千里光堿（Sv）、春千里光堿氮氧化合物（SvNO）、克氏千里光堿（Sk）、毛束草堿（Td）、倒千里光裂堿（Ret）、大尾搖堿氮氧化物（IcNO）、歐天芥菜堿（Eu）、7-乙酰印美定（7-Im）、7-乙酰印美定氮氧化物（7-ImNO）、7-乙酰石松胺（7-Ly）、大尾搖堿（Ic）、千里光菲林氮氧化物（SpNO）；甲醇（北京化工廠，分析純）；甲醇、乙腈（美國Fisher chemical 公司，色譜純）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；甲酸（北京邁瑞達(dá)科技有限公司，色譜純）；甲酸銨（上海阿達(dá)馬斯試劑有限公司，RG 級，純度＞98%）；濃硫酸（95%～98%）、濃氨水（25%～28%）。

收集了8 份不同來源和批次的新疆紫草藥材（其中2份購自安徽亳州藥市，2份購自河北百草康神藥業(yè)，2 份購自四川荷花池藥材市場，1 份購自山西大同老藥工藥店，1 份購自北京同仁堂藥店），經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定為紫草科植物Armebia euchroma（Royle Johnst.）的干燥根，樣本保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所天然藥物化學(xué)中心。不同處方的含款冬花和紫草中成藥制劑（表1～2）購買自藥店。

表1 含有款冬花的中成藥

2 方法和結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取PAs對照品各1 mg于10 mL量瓶中，以乙腈為溶劑溶解并定容，得質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的對照品儲存液，置于-20 ℃冰箱密封保存。使用時，分別吸取各儲備液100 μL 于10 mL 量瓶中，甲醇-水（1∶1）定容，最終得質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1的PAs混合對照品溶液，放置于4 ℃冰箱中備用。

表2 含有紫草的中成藥

2.2 供試品溶液制備

樣品溶液的前處理參照實驗室前期報道的研究方法[4,6-7,9]。

2.2.1 藥材和丸劑樣品的處理 將藥材粉碎后過60目篩。稱取藥材樣品粉末2.0 g或粉碎的丸劑9.0 g于50 mL錐形瓶中，加入甲醇40 mL，常溫條件下超聲提取30 min，將提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，4500 r·min-1離心10 min（離心半徑為8.6 cm），取上清液至燒杯中，置通風(fēng)櫥中揮發(fā)至干后獲得浸膏。取濃度為0.05 mol·L-1的硫酸水10 mL，將上述所得浸膏溶解后過PCX-SPE 小柱。主要凈化富集過程：先將PCX-SPE 固相萃取小柱固定于正壓固相萃取裝置上，取甲醇5 mL平衡小柱，取濃度為0.05 mol·L-1的硫酸5 mL將小柱活化，然后取溶解后的提取液上樣，上樣后取濃度為0.05 mol·L-1硫酸5 mL，淋洗2次，甲醇取5 mL，淋洗2 次，最后將固相萃取裝置抽干，25%氨水-甲醇（25∶75）5 mL 洗脫2 次，獲得樣品洗脫液，將洗脫液置通風(fēng)櫥中揮發(fā)至干。

2.2.2 其他制劑樣品的處理 將片劑粉碎后過60目篩，膠囊劑直接將粉末倒出，稱取樣品粉末1000 mg，取濃度為0.05 mol·L-1的硫酸10 mL，將上述所得粉末溶解，然后4500 r·min-1離心10 min（離心半徑為8.6 cm），濾過得濾液；取口服液5 mL 直接和0.1 mol·L-1的硫酸5 mL 混合得藥液。濾液和藥液過PCX-SPE小柱凈化富集，流程同2.2.1。

2.2.3 樣品復(fù)溶 將富集獲得的洗脫液浸膏用甲醇-水（1∶1）復(fù)溶，2 mL 量瓶定容至刻度，過0.22 μm 濾膜，吸取適量樣品至液相小瓶中供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）分析使用。樣品前處理方法的回收率在前期研究就已有報道[4,6-7,9]，可滿足定量分析測試要求。

2.3 液相色譜與質(zhì)譜條件

2.3.1 液相色譜條件 樣品采用島津快速液相色譜（UFLC）結(jié) 合Phenomenex Prodigy 5μ ODS3 100A（150 mm×3.2 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行色譜分離，流動相水相為0.05%甲酸-2.5 mmol·L-1甲酸銨-水（A），有機(jī)相為0.05%甲酸-2.5 mmol·L-1甲酸銨-甲醇（B），梯度洗脫（0.5 min，5%B；0.5～2.0 min，5%～20%B；2～19 min，20%～40%B；19～23 min，40%～95%B；23.0～25.5min，95%B；25.5～26.5min，95%～5%B；26.5～29.0 min，5%B）；流速為0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量為2 μL；柱溫為40 ℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件 PAs 的氮原子上可提供與質(zhì)子相結(jié)合的孤電子對，容易與H+形成帶正電荷的離子（[M+H]+），因此，選擇正離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）結(jié)合保留時間進(jìn)行生物堿的鑒定和定量測定。結(jié)果顯示，34 個對照品中有32 個完全分離，但I(xiàn)m 和Ic、ImNO 和IcNO 分別為各自的立體異構(gòu)體，在本研究條件下不能分離，因此，在后續(xù)的方法學(xué)研究中，Ic和IcNO不再評價。

質(zhì)譜運行條件參數(shù)：噴撞氣為10 psi（1 psi≈6.895 kPa）；氣簾氣為25 psi；噴霧氣為37 psi；輔助加熱氣為37 psi；離子化電壓為5500 V；溫度為450 ℃。各對照品質(zhì)譜條件參數(shù)及保留時間見表3。

表3 PAs對照品的質(zhì)譜條件及保留時間

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 取質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1的PAs混合對照品溶液，用甲醇-水（1∶1）逐漸稀釋質(zhì)量濃度分別為500.0、200.0、100.0、50.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 ng·mL-1的對照品溶液，按2.3 項下條件進(jìn)行測定。以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，32個PAs對照品的峰面積與進(jìn)樣質(zhì)量濃度（2～500 ng·mL-1）均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r＞0.991。

2.4.2 檢測限（LOD）與定量限（LOQ）將低濃度的PAs 混合對照品溶液不斷稀釋后進(jìn)樣，以信噪比（S/N）＞3 為LOD，S/N＞10 為LOQ。所有PAs 對照品的LOD≤1 ng·mL-1，LOQ≤2 ng·mL-1。

2.4.3 精密度考察 取各對照品質(zhì)量濃度為2 ng·mL-1的混合對照品溶液進(jìn)行精密度試驗，按照2.3項下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算各PAs的RSD。所有PAs對照品的RSD為0.97%～19.83%，表明該方法精密度良好。

2.5 含款冬花中成藥制劑的PAs含量分析

文獻(xiàn)[6,10-11]已報道款冬花藥材中含有PAs成分包括Sk、Sn、SnNO、Ret 及Sv 等。定量分析發(fā)現(xiàn)，在不同來源的款冬花藥材中PAs 總檢出量為26.93～70.78 μg·g-1，其中Sk含量占PAs總檢出量的88.90%～98.23%，SnNO 占其總檢出量的0.40%～8.94%，其他PAs 的總含量＜總檢出量的2%[6]。

在含款冬花的中成藥制劑中，共檢出3 個PAs，分別為Sk、LyNO 和Ret（表4）。其中主要成分為Sk，占總PA 檢出量的96.4%～100%，LyNO 可能為制劑組方中其他藥材中的摻雜PAs，其占總PAs檢出量的0～2.2%。因此款冬花是含此藥材的中成藥中PAs的主要來源。在測試的14個中成藥中，按各自說明書推薦用量計算的PAs日攝入量為2.24～95.92 μg。

表4 含有款冬花中成藥制劑的PAs含量及日攝入量

2.6 紫草藥材的PAs含量分析

本研究共收集分析了8 個不同批次和不同來源的新疆紫草藥材樣品。通過和對照品對比，紫草藥材共檢出鑒定了7 個PAs，分別為Em、EmNO、Ly、LyNO、Im、ImNO 和Ret，與文獻(xiàn)[12]報道基本一致，PAs為紫草科植物化學(xué)分類學(xué)上的標(biāo)志性成分。

本研究對紫草藥材中的PAs 成分進(jìn)行定量測定，結(jié)果顯示，不同批次和來源的藥材PAs 含量差異十分明顯?？倷z出量最低的紫草藥材PAs 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.60 μg·g-1，而最低的紫草藥材PAs 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為140.69 μg·g-1（表5）。在檢出的PAs 中，含量最高的成分為EmNO，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.47～132.27 μg·g-1，占其樣品PAs 總檢出量的32.01%～94.02%；其次較高的LyNO，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06～11.40μg·g-1，占其總檢出量的0.04%～72.87%；Em 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08～8.11 μg·g-1，占其總檢出量的3.91%～8.89%。

表5 紫草藥材樣品中的PAs檢出量μg·g-1

2.7 含紫草中成藥制劑的PAs含量分析

本研究評價了10 個含紫草的口服中成藥制劑產(chǎn)品，從中共鑒定了5 個PAs，分別為EmNO、LyNO、ImNO、Sk 和Ret。在測試的10 個中成藥中，PAs 的總檢出量為0.010～2.520 μg·g-1，按各自說明書推薦用量計算PAs 的日攝入量為0.38～25.20 μg。其中，在多個制劑中，主要PAs 為Sk 和Ret，其中Sk可能為摻雜性PAs，而Ret 通常認(rèn)為沒有毒性，因此，其中的毒性PAs可能不是源于紫草。

3 討論

世界衛(wèi)生組織（WHO）和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）認(rèn)為，PAs 是食品與草藥產(chǎn)品中最嚴(yán)重和最廣泛的內(nèi)源性與摻雜性的毒性成分，其中最常見的不良反應(yīng)為肝毒性。誤食含PAs 摻雜的食品或含內(nèi)源性PAs 的草藥和茶飲品所致的肝小靜脈閉塞?。℉VOD）、肝竇阻塞綜合征（HSOS）、肝細(xì)胞出血性壞死等肝臟毒性引起了廣泛關(guān)注，但可引起肝臟中毒的最低劑量目前尚不清楚。有研究報道了可引起HVOD 癥狀的PAs 急性暴露的最低劑量，在其中一項回顧性研究中，女嬰服用含PAs產(chǎn)品2周引起肝 毒 性 的 劑 量 為0.8～1.7 mg·kg-1［PAs 主 要 是riddelliine（一種環(huán)狀二酯類生物堿）和ReNO］；而另一項研究中，1 名兩個月大的男嬰服用PAs 4 d 后表現(xiàn)出的與人體肝毒性相關(guān)的劑量為3 mg·kg-1[13]。歐洲食品安全局（EFSA）食物鏈污染物問題小組建議，PAs暴露水平高于已知最低毒性劑量的1%時可能會產(chǎn)生急性或短期攝入的健康風(fēng)險[1]。因此，本研究選用攝入量8 μg·kg-1·d-1（0.8～1.7 mg·kg-1PAs 的1%）來評估短期攝入含款冬花和紫草的中成藥制劑安全風(fēng)險。從表4 可知，服用含款冬花中成藥制劑對成人（按50 kg 體質(zhì)量計）的PAs 每日最大攝入量為1.9 μg·kg-1，產(chǎn)生急性毒性的風(fēng)險比較低。說明書上品種未明確是否適用于兒童，如果按一般兒童（按10 kg 體質(zhì)量計）用量減半計算，產(chǎn)生急性毒性的風(fēng)險也比較低。從表6 的結(jié)果推算，服用含紫草的中成藥制劑，兒童和成人的PAs 每日最大攝入量分別為2.52、0.50 μg·kg-1，產(chǎn)生急性毒性的風(fēng)險比較低。

表6 含有紫草的中成藥PAs質(zhì)量分?jǐn)?shù)及日攝入量

PAs 除了具短期暴露所致的肝毒性外，還可導(dǎo)致基因毒性。因此，歐洲藥品管理局/草藥產(chǎn)品委員會（EMA/HMPC）于2020 年7 月8 日發(fā)布了“關(guān)于使用含有有毒PAs成分及有關(guān)草藥產(chǎn)品摻雜PAs成分建議的公開聲明”的討論稿[14]。聲明建議草藥產(chǎn)品對50 kg 體質(zhì)量成人的最大可接受日攝入量為1.0 μg。EMA/HMPC 推薦的每日可接受攝入量是根據(jù)EFSA使用的暴露邊界值（MOE）方法推導(dǎo)得出的。MOE按公式（1）計算。

其中，BMDL10為攝入riddelliine使10%的雌性大鼠產(chǎn)生腫瘤的劑量，參考值為237 μg·kg-1·d-1；DAMI為每千克體質(zhì)量的PAs 日攝入量，單位為μg·kg-1。當(dāng)MOE值為10 000或更高時，可認(rèn)為遺傳毒性和致癌性的安全風(fēng)險低[1]。盡管一些研究證明，不同結(jié)構(gòu)的PAs基因毒性存在差異，單酯取代的PAs低于類似于riddelline 的PAs 毒性[15-16]，但由于目前還缺少適用于定量PAs風(fēng)險評估的精確的相對效力因子，PAs還是被視為一類等效物質(zhì)，其基因毒性具有累加效應(yīng)[1]。

表4的結(jié)果顯示，含款冬花的中成藥制劑中PAs含量超出了EMA/HMPC 推薦上限的1.24～94.92 倍，從基因毒性的角度，其MOE 值為124～4937，長期使用此類產(chǎn)品可能會對人體健康構(gòu)成風(fēng)險。由于款冬花藥材中普遍含有較高含量的PAs，很難通過藥材質(zhì)量控制降低含該藥材的中成藥中的PAs 含量?？紤]到Sk 為款冬花中的主要PAs 成分，有必要進(jìn)一步研究Sk 的基因毒性。對于含紫草的中成藥制劑，其中PAs含量為EMA/HMPC推薦上限的0.38～25.20倍，10 個制劑中有4 個制劑的PAs 含量低于EMA/HMPC 的推薦上限。考慮到新疆紫草藥材中PAs 為單酯取代的PAs，其基因毒性可能低于參比環(huán)狀二酯PAs 的毒性，大多數(shù)制劑產(chǎn)品基因毒性風(fēng)險可能較小。此外，新疆紫草藥材中PAs 含量波動很大，通過對藥材質(zhì)量進(jìn)行評價，有望有效控制制劑中PAs的含量，滿足歐盟限量要求。