王瑩,時銳,張南平,辜冬琳,昝珂,劉越,金紅宇,馬雙成
1.中國食品藥品檢定研究院,北京 102629;2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029
枸杞作為藥食兩用產(chǎn)品,在東亞等地區(qū)已具有兩千多年的使用歷史[1]。枸杞作為強壯滋補藥品,具有益精明目、延緩衰老、滋補肝腎等功效[2],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品?!吨袊参镏尽分杏杏涊d的枸杞屬植物大約有80 多種[3],市場上廣泛應(yīng)用的種為寧夏枸杞Lycium barbarmL.和北方枸杞L.chinenseMill.var.potaninii(Pojark.)A.M.Lu?!吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020 年版收載的枸杞子為寧夏枸杞的干燥成熟果實,這也是目前市場上的主流產(chǎn)品。北方枸杞為枸杞Lycium chineseMill.的變種,廣泛分布于河北北部、山西北部、陜西北部等地。在枸杞商品規(guī)格的質(zhì)量評價中,主要從性狀特點判定其優(yōu)劣,如顆粒大小、色澤等[4],這種評判方法具有一定的局限性?!吨袊幍洹?020 年版規(guī)定以枸杞多糖和甜菜堿作為枸杞主要質(zhì)量控制指標(biāo),其中規(guī)定多糖質(zhì)量分數(shù)不得少于1.8%,甜菜堿質(zhì)量分數(shù)不得少于0.5%[5]。
多糖為枸杞的主要成分且是重要的功效成分,已有研究表明,枸杞多糖(LBP)具有多種生物學(xué)活性,包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)血脂、降血糖、視網(wǎng)膜保護和保肝等[6]。不同產(chǎn)地及不同品種枸杞中多糖成分是否存在差異,是影響枸杞質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一?!吨袊幍洹?020 年版(一部)采用苯酚硫酸法測定LBP 含量,此法雖然可以從一定程度上表明多糖含量,但無法體現(xiàn)多糖結(jié)構(gòu)特征,無法揭示不同產(chǎn)地及不同品種枸杞中多糖成分的差異性。鑒于此,近年來已有部分學(xué)者通過多糖結(jié)構(gòu)分析,對不同產(chǎn)地LBP進行比較。Wu等[7]測定了50余批不同產(chǎn)地寧夏枸杞中多糖成分的重均相對分子質(zhì)量(Mw),同時進行比較以評價枸杞質(zhì)量;Liu 等[8]通過建立LBP 多元指紋圖譜對不同產(chǎn)地枸杞質(zhì)量進行評價。但目前此類研究主要集中于《中國藥典》2020年版記載品種寧夏枸杞的測定,對不同品種枸杞中多糖成分的分析鮮有報道。同時有研究指出,關(guān)于LBP 的報道雖多,但大部分研究為市場購買產(chǎn)品,多存在樣品產(chǎn)地及品種不確定的問題[9]。
為了深入探索不同品種及不同產(chǎn)地LBP 的差異性,本課題組分別從寧夏、青海、新疆、河北種植基地收集了多份枸杞樣品,并經(jīng)過性狀和顯微特征進一步確定其種,以保證來源正確。同時對其總糖含量、Mw及單糖組成進行測定,最終為枸杞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善及資源評價提供參考。
LC-20AD 型高效液相色譜儀-示差檢測器、LC-20AD 型高效液相色譜儀-光電二極管陣列檢測器、UV-2700 型紫外分光光度計均購于日本島津公司;十八角度激光光散射儀(美國Wyatt公司)。
Zorbax Eclipse XDB型C18色譜柱(250mm×4.6mm,5 μm,美國Agilent 公司);SB-806 HQ 型凝膠色譜柱(300 mm×7.8 mm)和SB-804 HQ 型凝膠色譜柱(300 mm×7.8 mm)均購于日本Shodex 公司;對照品半乳糖(Gal,批號:100226-201807)、半乳糖醛酸(GalA,批號:111646-201702)、木糖(Xyl,批號:111508-201605)、核糖(Rib,批號:140668-202003)、葡萄糖醛酸(GlcA,批號:140648-202005)、甘露糖(Man,批號:140651-201805)、葡萄糖(Glc,批號:110833-201908)、阿拉伯糖(Ara,批號:1506-200202)、鼠李糖(Rha,批號:111683-201502)均購于中國食品藥品檢定研究院,純度均大于99%;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP,批號:BCBP1208V,純度為99%,美國Acros Organics公司);對照品右旋糖酐(批號:1721,純度>90%,美國聚合物標(biāo)準(zhǔn)品公司);甲醇、乙醇、三氯甲烷、濃硫酸、氫氧化鈉、三氟乙酸、鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀均為分析純,購于國藥集團藥業(yè)股份有限公司。
枸杞樣品分別收集于寧夏、青海、新疆、河北枸杞種植基地,經(jīng)中國食品藥品檢定研究院張南平主任藥師鑒定確認其品種,共有19 批寧夏枸杞Lycium barbarmL.和3 批北方枸杞L.chinenseMill.var.potaninii(Pojark.)A.M.Lu,具體樣品信息見表1。
表1 22批枸杞樣品信息
參考文獻[10]實驗方法粉碎樣品,過三號篩,精密稱定約5 g,加入80%乙醇100 mL,加熱回流1 h后,趁熱濾過,濾渣用80%乙醇洗滌2 次。然后將濾紙連同濾渣放置于錐形瓶中,加水80 mL,加熱回流2 h,趁熱濾過,濾液在水浴鍋上蒸干后用5 mL水充分溶解,加入乙醇使其體積分數(shù)達到80%,4 ℃冰箱中置12 h 后取出,5000 r·min-1離心5 min(離心半徑為6 cm),棄去上清液。沉淀物分別用乙醇淋洗各2 次[11],待溶劑揮干后沉淀物用熱水50 mL溶解,置于-20 ℃冰箱保存,作為枸杞粗多糖溶液。
2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取Glc 對照品約10 mg 置于100 mL 量瓶中,加水溶解并定容至刻度,即得Glc 儲備液。分別精密量取Glc 儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置具塞試管中,分別加水補至2.0 mL后,加入5%苯酚溶液1.0 mL,將溶液充分混勻后滴加硫酸5.0 mL,混合均勻,室溫下靜置5 min,再水浴加熱15 min,后冰浴5 min終止反應(yīng)。采用紫外分光光度計在490 nm 處測定吸光度(A),空白對照以水代替對照品溶液。最終以Glc 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),A為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得Glc線性方程:Y=0.81X-0.039 3(r=0.994 6)。
2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取枸杞粗多糖溶液1.0 mL,置于20 mL 量瓶中,加水定容,搖勻,得到供試品溶液。
2.2.3 樣品含量測定 精密量取供試品溶液0.3 mL置具塞試管中,加水補至2.0 mL后,按2.2.1項下方法測定A值,每個樣品重復(fù)測定2次,通過Glc線性方程計算樣品中總糖含量,22批樣品的總糖含量見表2,質(zhì)量分數(shù)為3.24%~8.66%,同時發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞與北方枸杞在總糖含量上的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
表2 22批枸杞樣品總糖質(zhì)量分數(shù)
2.3.1 色譜條件 參考文獻[12]方法,采用凝膠滲透色譜-示差檢測器-光散射法(GPC-RI-MALLS)測定Mw。采用Shodex SB-806 HQ型凝膠柱和Shodex SB-804 HQ 型凝膠柱串聯(lián)進行分析,流動相為0.1%氯化鈉溶液;柱溫為40 ℃;柱流速為0.5 mL·min-1;進樣量為50 μL。
2.3.2 MALLS 檢測條件 石英玻璃樣品池,激光波長為658 nm。用甲苯對MALLS 90° PDA 進行校正,用Mw為44 000 右旋糖酐對照品對其余角度檢測器進行歸一化,折光指數(shù)增量值(dn/dc)為0.138。采用GPC-RI-MALLS 測定獲得Mw及數(shù)均相對分子質(zhì)量(Mn)值,按公式(1)計算分散系數(shù)(PDI)。
2.3.3Mw測定結(jié)果 采用GPC-RI-MALLS 測定22批枸杞中提取的粗多糖的Mw及PDI,分別計算3個色譜峰在總峰面積中的占比,結(jié)果見表3。22批樣品的Mw為0.733×106~3.191×106,PDI 值為3.365~5.550。有報道對LBP 的Mw研究文獻進行總結(jié),指出枸杞粗多糖的Mw為1.0×104~2.3×106[13],這與本研究結(jié)果基本一致。
表3 22批樣品LBP的Mw、PDI及峰面積占比測定結(jié)果
從Mw測定色譜圖(圖1)來看,枸杞粗多糖在色譜圖呈現(xiàn)3 個不完全分離的色譜峰。同時發(fā)現(xiàn),寧夏枸杞與北方枸杞的GPC-RI色譜圖存在明顯的區(qū)別,主要體現(xiàn)在峰2 和峰3 的色譜峰峰面積比例上(表3)。寧夏枸杞色譜圖中峰3 對峰2 的面積比為5.40~8.79,北方枸杞峰3 對峰2 的面積比僅為1.30~1.86。
圖1 GPC-RI-MALLS測定22批枸杞樣品Mw
2.4.1 對照品溶液的制備 參考文獻[10]實驗方法,分別精密稱取對照品Man、Rib、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl和Ara適量,加水制成1.0 mg·mL-1的單標(biāo)溶液。精密吸取各單標(biāo)溶液1.0 mL置于10 mL量瓶中,加水制成含9種糖質(zhì)量濃度約為0.1 mg·mL-1的混合對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液500 μL,加0.25 mol·L-1NaOH 溶液75 μL,再加入0.5 mol·L-1PMP 甲醇溶液150 μL,混勻后于70 ℃反應(yīng)90 min。冷卻至室溫后加入0.25 mol·L-1HCl溶液75 μL。加三氯甲烷1 mL 萃取,除去下層有機層,重復(fù)萃取3次,取上層溶液即得。
2.4.2 供試品溶液的制備 精密量取枸杞粗多糖溶液1.0 mL置于5.0 mL量瓶中,加水定容,制成多糖稀釋液,搖勻。精密量取多糖稀釋液1.0 mL,置于安瓿瓶中,加入等體積的4 mol·L-1三氟乙酸,密閉,于120 ℃反應(yīng)4 h。氮氣吹干,加甲醇適量,再吹干,以除盡剩余三氟乙酸,加水1.0 mL充分溶解。按2.4.1項下方法“加0.25 mol·L-1NaOH溶液75 μL”起同法處理,即得供試品溶液。
2.4.3 高效液相色譜-光電二極管陣列檢測法(HPLC-PDA)檢測 采用Zorbax Eclipse XDB 型C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)分析,柱溫為35 ℃,流速為1.0 mL·min-1,檢測波長為250 nm,進樣量為10 μL,流動相為乙腈-0.125 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(16∶84,加入1.0 mol·L-1氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至6.9)。
2.4.4 單糖組成測定結(jié)果 選取10 批代表性樣品的粗多糖進行單糖組成測定,其中包括北方枸杞3批及寧夏枸杞7批(S1、S2、S14~18),寧夏枸杞分別來源于寧夏、青海和新疆3個產(chǎn)地,結(jié)果見圖2。
圖2 混合對照品和10批枸杞樣品單糖組成測定圖譜
從圖2 可看出,不同產(chǎn)地提取的枸杞粗多糖具有相同的單糖組成,均由9種單糖組成。HPLC 測定圖譜中13.61 min處色譜峰為衍生試劑色譜峰,其余色譜峰按保留時間順序依次為Man、Rib、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl 和Ara。其中,8 號和9號峰,即Xyl和Ara的分離效果與流動相體系的pH相關(guān),當(dāng)調(diào)pH 為6.9 時,其分離效果達到最佳。以9 種單糖混合對照品所得峰面積為對照,分別計算樣品中各單糖含量及在總糖中的百分比,結(jié)果見表4。枸杞粗多糖中Ara含量最高,平均百分比高達32.2%。同時發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地樣品單糖組成含比存在一定差異,尤其體現(xiàn)在寧夏枸杞和北方枸杞的GalA 含量上,7批寧夏枸杞LBP 中GalA 的平均質(zhì)量分數(shù)為21.1%;3 批北方枸杞LBP 成分中GalA 的平均質(zhì)量分數(shù)為11.2%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。若以樣品中Ara 峰面積與GalA 峰面積比作為指標(biāo)比較寧夏枸杞與北方枸杞差異,發(fā)現(xiàn)7 批寧夏枸杞樣品比值為1.39~1.69,而北方枸杞的比值為2.61~3.16。
表4 10批枸杞樣品LBP中各單糖占比
2.4.5 方法學(xué)驗證 對單糖組成測定方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、檢出限及回收率進行了驗證,結(jié)果見表5。從表5 結(jié)果可以看出,LBP 中9 種單糖的回收率為89.0%~103.9%,重復(fù)性結(jié)果RSD均小于4.7%。由于單糖組成測定步驟繁雜,需經(jīng)過水解、除酸和衍生化等步驟,故認為此方法學(xué)驗證結(jié)果可基本滿足測定要求。在穩(wěn)定性試驗中發(fā)現(xiàn),6 h 內(nèi)樣品中9種單糖測定結(jié)果RSD均小于4.3%,穩(wěn)定性良好。6 h后樣品中GalA 和GlcA 成分的含量明顯下降,24 h穩(wěn)定性測定結(jié)果顯示2 個成分的RSD 分別達到30.4%和23.4%,穩(wěn)定性較差。故在實際測定中建議樣品衍生化后應(yīng)在6 h內(nèi)完成HPLC檢測。
表5 LBP中單糖組成測定方法的驗證
2.5.1 指紋圖譜建立 將2.4項下測定的10批樣品單糖組成數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012A版),確定9個共有峰。
2.5.2 相似度評價 本研究利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012A 版)分析不同產(chǎn)地不同品種樣品單糖組成指紋圖譜相似度。S17 樣品單糖組成含量比接近平均值,故以其色譜圖作為參照圖譜,樣 品S1、S2、S14、S15、S16、S18、S20、S21、S22 的相似度計算結(jié)果分別為0.973、0.993、0.984、0.993、0.991、0.985、0.955、0.953、0.958。9 批樣品與S17 的相似度均大于0.95,說明枸杞樣品雖來自不同地理區(qū)域,但單糖組成相似度較高。6 批寧夏枸杞與S17 的相似度在0.97 以上,而3 批北方枸杞與S17 的相似度為0.953~0.958,均低于0.96。故認為通過單糖組成指紋圖譜可初步對寧夏枸杞和北方枸杞進行區(qū)分。通過10 批樣品測定,初步建立了寧夏枸杞和北方枸杞單糖組成對照指紋圖譜,見圖3。
圖3 LBP中單糖組成的HPLC指紋圖譜
現(xiàn)行枸杞標(biāo)準(zhǔn)僅測定總糖含量,難以反映不同種和不同產(chǎn)地LBP 成分的差異性。為了深入探索不同品種及不同產(chǎn)地LBP 的差異性,本研究分別從寧夏、青海、新疆、河北種植基地收集了共22批枸杞樣品進行提取純化,并對其初級結(jié)構(gòu)進行測定。收集的寧夏枸杞樣品主要為“寧杞1號”。據(jù)已有報道,目前寧夏枸杞種植面積突破200 萬畝(1 畝≈666.67 m2),其中80%以上種植品種為“寧杞1 號”,主要分布于寧夏、甘肅、青海、新疆等地[9]。故本研究中收集“寧杞1 號”樣品更能代表市場主流產(chǎn)品的質(zhì)量情況。在初級結(jié)構(gòu)測定方面,主要對Mw和單糖組成進行測定和比較。在多糖研究中一般認為單糖組成和Mw對多糖生物活性有較大的影響,如在LBP 文獻報道中,有學(xué)者指出其糖醛酸含量對其活性有重要影響[14-15]。前期本課題組研究亦發(fā)現(xiàn)Mw與LBP 活性密切相關(guān)[16]。
本研究對Mw的測定采用了GPC-RI-MALLS。植物多糖Mw的常用測定方法包括MALLS、GPC-RI 及基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法(MALDITOF-MS)。例如,Hu 等[17]以右旋糖酐為對照品,采用GPC-RI對短柄五加中多糖成分的Mw進行了測定;Yu 等[18]亦采用GPC-RI 對西洋參中多糖成分的Mw進行了測定;陳同強等[19]采用GPC-RI-MALLS 對紅芪多糖的相對分子質(zhì)量進行了檢測;胡坪等[20]采用MALDI-TOF-MS 對麥冬中多糖成分的Mw進行了測定。本研究中采用的MALLS 是一種相對分子質(zhì)量的絕對測定方法,其原理是利用激光照射到樣品在各個方向產(chǎn)生散射光,光散射強度與Mw和溶液的質(zhì)量濃度成正比,從而對相對分子質(zhì)量進行計算。已有研究采用GPC-RI-MALLS對制備的50批LBP進行測定[7],結(jié)果表明此方法準(zhǔn)確快速,可作為LBP 的Mw測定方法。單糖組成則采用PMP 柱前衍生化結(jié)合HPLC-PDA 進行檢測,PMP 是常用的柱前衍生化試劑,其優(yōu)勢在于與還原糖在堿性條件下反應(yīng)后所得衍生化產(chǎn)物較為穩(wěn)定,且無立體異構(gòu)峰,便于分析。從實驗結(jié)果可以看出,此方法前處理操作重復(fù)性較好,且經(jīng)衍生化的9種單糖檢測限均低于20 μg·mL-1,靈敏度較高。為了進一步分析不同產(chǎn)地LBP 的差異性,本研究建立了單糖組成指紋圖譜并結(jié)合相似度對不同樣品進行分析。選擇了單糖組成較接近7 批寧夏枸杞單糖組成測定平均值的S17 樣品作為參照指紋圖譜。在LBP 的研究中,已有學(xué)者采用指紋圖譜對其單糖組成相似度進行分析[8],其研究目的是比較不同產(chǎn)地寧夏枸杞中多糖組分差異,故收集的樣品均為寧夏枸杞樣品。結(jié)果表明,不同產(chǎn)地寧夏枸杞中多糖組分的單糖組成高度相似,與本研究測定結(jié)果一致。
以上研究初步得出結(jié)論,通過多糖成分測定可有效區(qū)分寧夏枸杞和北方枸杞,主要差異性指標(biāo)包括:1)總糖含量,寧夏枸杞的總糖含量高于北方枸杞(P<0.05);2)Mw測定GPC-RI 色譜圖,不同相對分子質(zhì)量段的色譜峰面積存在顯著差異(峰2 與峰3 面積比);3)單糖組成測定表明北方枸杞的GalA 含量明顯低于寧夏枸杞,以Ara與GalA 含量比作為指標(biāo)值,可有效區(qū)分不同枸杞品種。之所以選擇GalA 是因為其是寧夏枸杞和北方枸杞含量差異最大的成分,而Ara是枸杞中最主要成分,故選擇這2個成分比值能更準(zhǔn)確地表達兩者的差異。綜上所述,不同產(chǎn)地寧夏枸杞中多糖成分結(jié)構(gòu)高度一致,但寧夏枸杞與北方枸杞中粗多糖成分存在較大差異,進一步說明基于多糖成分對枸杞進行質(zhì)量評價的必要性。同時,本研究建立的方法可通過測定多糖成分初步區(qū)分寧夏枸杞與北方枸杞,可為完善枸杞質(zhì)量控制方法和枸杞資源評價提供參考。