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      過表達(dá)脂肪非典型鈣黏蛋白4對結(jié)直腸癌化療耐藥的影響

      2022-07-06 08:59:28楊少賓王昱良李俊娜王朝杰
      西北藥學(xué)雜志 2022年4期
      關(guān)鍵詞:奧沙利直腸癌化療

      楊少賓,王昱良,李俊娜,王朝杰

      1.黃河三門峽醫(yī)院消化內(nèi)科,三門峽 472000;2.河南省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,鄭州 450003

      多項(xiàng)研究表明[1-2],結(jié)直腸癌病死率高的一個(gè)重要原因?yàn)榛熌退帲ㄔl(fā)性、繼發(fā)性2種,其中繼發(fā)性耐藥較常見,可導(dǎo)致病情反復(fù)或加重,使治療的難度增大。脂肪非典型鈣黏蛋白4(fat atypical cadherin 4,F(xiàn)AT4)為鈣黏蛋白超家族成員之一,屬于單跨膜蛋白受體,能對上游相關(guān)信號通路的細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)進(jìn)行調(diào)控[3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4-5],F(xiàn)AT4屬于腫瘤抑制基因,在多種腫瘤中呈低表達(dá),可能參與正常組織向腫瘤組織轉(zhuǎn)變的過程。目前,F(xiàn)AT4過表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞繼發(fā)性化療耐藥性的影響及具體機(jī)制尚不明確。本文分析FAT4過表達(dá)對人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞繼發(fā)性化療耐藥性的影響,并探討其作用機(jī)制。

      1 儀器與材料

      1.1 儀器

      Mx3005P型實(shí)時(shí)熒光定量分析(RT-PCR)儀(美國安捷倫科技公司);TC2323型CO2培養(yǎng)箱(美國Shellab公司);CH2-TKC-3 型倒置光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社);Mod 550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

      1.2 試藥

      奧沙利鉑(杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司);青霉素、鏈霉素均購自美國Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司);LipofectamineTM3000 試 劑(美 國Life Technologies 公 司);過 表 達(dá)FAT4慢病毒核心質(zhì)粒、空載體慢病毒均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院;Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒[東仁化學(xué)科技(上海)有限公司];FAT4、β-actin引物序列均購自日本Ta KaRa Bio株式會(huì)社;兔抗人FAT4、P53、磷酸化-p53(p-p53)、鼠雙微粒體基因2(murine double minute2,MDM2)一抗及山羊抗兔IgG 二抗均購自美國Novus Biologicals公司。

      1.3 細(xì)胞系

      正常人類腸黏膜上皮細(xì)胞系FHC、人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

      2 方法

      2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

      取正常人類腸黏膜上皮細(xì)胞系FHC、人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞,分別接種于含質(zhì)量濃度為50 mg·L-1胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置于體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度37℃,每2 d更換1次培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)前培養(yǎng)4 d。

      2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞與正常腸黏膜上皮細(xì)胞中FAT4 m RNA 表達(dá)水平的檢測

      用RT-PCR 法檢測。取處于對數(shù)生長期的正常人類腸黏膜上皮細(xì)胞、人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞,用Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行RTPCR 反 應(yīng)。反 應(yīng) 體 系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5μL,cDNA 模 版2μL,上、下 游 引 物 各1μL,雙 蒸 水8.5 μL。反 應(yīng) 條 件:95 ℃預(yù) 變 性,5 min;95℃變性,5 s;60℃退火延伸,20 s,40 個(gè) 循環(huán)。引物序列見表1。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析電泳條帶,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算FAT4 m RNA 的相對表達(dá)水平(2-△△CT)。

      表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

      2.3 過表達(dá)人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞中的FAT4及轉(zhuǎn)染

      用胰酶消化、收集處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞,根據(jù)病毒包被、轉(zhuǎn)染試劑要求,將過表達(dá)FAT4慢病毒核心質(zhì)粒包裝成病毒,按照LipofectamineTM3000 試劑說明書,用其與空載體慢病毒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞,6 h。隨后更換新鮮的DMEM 培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞分為3組:以過表達(dá)FAT4 病毒轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,以空載體病毒轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞作為對照組,以無病毒轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞作為空白組。轉(zhuǎn)染48 h后,用倒置熒光顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)、發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù),計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率=(發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù))×100%。

      2.4 轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞中FAT4 mRNA 表達(dá)水平的檢測

      用RT-PCR 進(jìn) 行 檢 測。取2.3 項(xiàng) 下 的3 組 細(xì)胞,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析電泳條帶,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算FAT4 m RNA 的相對表達(dá)水平(2-△△CT)。

      2.5 轉(zhuǎn)染后HCT116 細(xì)胞中FAT4 蛋白表達(dá)水平的檢測

      用Western blot檢測。取2.3項(xiàng)下3組細(xì)胞,用PBS清洗2次,RIPA 裂解液進(jìn)行冰上裂解,30 min。以4℃,12 000 r·minL-1離心10 min,半徑為8 cm,取上清液。用BCA 法進(jìn)行蛋白定量,沸水浴變性10 min。以質(zhì)量濃度120 g·L-1的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,用脫脂奶粉封閉1 h。加兔抗人FAT4一抗(1∶1 000),4℃,搖床孵育,過夜。用TBST 洗膜4次,每次10 min。加Ig G二抗(1∶2 500),室溫下孵育2 h。用TBST 洗膜4次,每次10 min。加ECL 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑。用Image Quant LAS4000生物分子成像儀曝光成像,觀察條帶灰度值。目的蛋白水平=目的蛋白條帶灰度值÷β-actin條帶灰度值。

      2.6 FAT4 過表達(dá)對人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞化療耐藥影響的檢測

      用CCK-8法檢測。取2.3項(xiàng)下3 組細(xì)胞,接種于96孔板,各組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后,以不同質(zhì)量濃度(1.6、2.4、3.2、4.0、4.8μg·m L-1)的奧沙利鉑干預(yù)各組細(xì)胞,以未處理細(xì)胞為對照孔,僅加培養(yǎng)液200μL。處理24 h后,各孔加CCK-8 5μL,置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,箱內(nèi)溫度37℃。以含質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1DMSO 的DMEM 溶液加入各孔,振蕩10 min。待結(jié)晶溶解后,用酶標(biāo)儀檢測570 nm 處的吸光度(A),并計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)及 化療耐藥 倍 數(shù)(resistance fold,RF)。IC50=(實(shí)驗(yàn)孔吸光度值÷對照孔吸光度值)×100%。RF=耐藥細(xì)胞IC50值÷親本細(xì)胞IC50值。

      2.7 FAT4 過表達(dá)對人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞凋亡率影響的檢測

      用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。取2.3項(xiàng)下3組細(xì)胞,接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后,以最接近IC50值質(zhì)量濃度(3.2μg·m L-1)的奧沙利鉑干預(yù)各組細(xì)胞24 h。隨后各孔加不含EDTA 的胰酶消化,以EP管收集各組細(xì)胞,用PBS 洗滌細(xì)胞2 次。管內(nèi)加1×binding buffer 200μL重懸細(xì)胞,于細(xì)胞重懸液內(nèi)加入Annexin V-PE 5 μL,混勻,室溫下避光孵育10 min。以7-AAD 5μL加入各管,吹打混勻,4 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

      2.8 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

      取2.3項(xiàng)下3組細(xì)胞,接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后,以質(zhì)量濃度3.2μg·m L-1的奧沙利鉑干預(yù)24 h。將細(xì)胞置于RIPA 裂解液中裂解,以12 000 r·min-1離心15 min,離心半徑8 cm,轉(zhuǎn)移上清至新的離心管。用PBS洗滌蛋白A/G 瓊脂糖珠2次,制備成20μL 蛋白A/G 瓊脂糖珠工作液。4℃,振蕩10 min,去除非特異性結(jié)合蛋白干擾。以12 000 r·min-1離心15 s,離心半徑為8 cm,轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管,棄蛋白A/G 瓊脂糖珠,加p53 抗體或MDM2抗體(或FAT4抗體)5μL。4℃,緩慢振蕩過夜。以12 000 r·min-1離心15 s,離心半徑為8 cm,收集免疫沉淀產(chǎn)物。以經(jīng)過預(yù)冷的PBS洗滌,重復(fù)3次。加上樣緩沖液15μL,置于沸水浴中變性5 min,用Western blot檢測FAT4、p53、p-p53及MDM2蛋白的表達(dá)水平。

      2.9 p53、p-p53及MDM2蛋白相對表達(dá)量的檢測

      用Western blot檢測。取2.3項(xiàng)下3組細(xì)胞,接種于96 孔板,待細(xì)胞貼壁后,以質(zhì)量濃度為3.2μg·m L-1的奧沙利鉑干預(yù)各組細(xì)胞24 h,開始實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞裂解、蛋白定量、沸水浴變性、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉等步驟同1.2.5。加兔抗人p53(1∶1 000)、p-p53(1∶1 000)及MDM2(1∶1 000)一抗,置于4℃搖床中孵育過夜。用TBST 洗膜4次,每次10 min。加IgG 二抗(1∶2 500),室溫下孵育2 h。用TBST 洗膜4次,每次10 min。加ECL 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑,曝光成像,觀察條帶灰度值。目的蛋白水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

      2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

      用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組計(jì)量資料比較用單因素方差分析,兩兩樣本比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      3 結(jié)果

      3.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞與正常腸黏膜上皮細(xì)胞中FAT4的表達(dá)水平

      人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞中FAT4 mRNA 的相對表達(dá)量為(0.36±0.12),正常人類腸黏膜上皮細(xì)胞中FAT4 m RNA 的相對表達(dá)量為(1.02±0.35),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.989,P=0.002)。FAT4在結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中呈低表達(dá)。

      3.2 轉(zhuǎn)染效率

      經(jīng)檢測,對照組轉(zhuǎn)染效率為89.58%,實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染效率為90.05%,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖1。

      圖1 LipofectamineTM 3000介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后的顯微鏡下照片F(xiàn)ig.1 Pictures of transfected HCT116 cells mediated by LipofectamineTM 3000 plasmid under microscope

      3.3 HCT116細(xì)胞中FAT4 m RNA、蛋白的相對表達(dá)量

      各組FAT 4 mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組、對照組比較,實(shí)驗(yàn)組FAT 4 mRNA、蛋白的相對表達(dá)量升高(P<0.05);空白組與對照組FAT 4 mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2、圖2。

      圖2 Western blot檢測HCT116細(xì)胞中FAT4蛋白的表達(dá)量Fig.2 Expression of FAT4 protein in HCT116 cells detected by Western blot

      表2 各組FAT4 mRNA、蛋白相對表達(dá)量的比較(±s,n=5)Tab.2 Comparison of relative expression of FAT4 mRNA and protein in each group(±s,n=5)

      表2 各組FAT4 mRNA、蛋白相對表達(dá)量的比較(±s,n=5)Tab.2 Comparison of relative expression of FAT4 mRNA and protein in each group(±s,n=5)

      注:與空白組比較,a P<0.05;與對照組比較,b P<0.05。

      項(xiàng)目 FAT4 mRNA FAT4蛋白空白組0.36±0.11 0.27±0.10對照組 0.34±0.13 0.26±0.11實(shí)驗(yàn)組 1.15±0.19ab 0.98±0.18ab F 49.178 46.908 P<0.001 <0.001

      3.4 過表達(dá)FAT4對HCT 細(xì)胞化療耐藥性的影響

      各組細(xì)胞增殖活性均隨奧沙利鉑質(zhì)量濃度增加而降低(P<0.05)。各組IC50值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組、對照組比較,實(shí)驗(yàn)組IC50值降低(P<0.05);空白組與對照組IC50值比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。空白組、對照組和實(shí)驗(yàn)組RF 分別為5.65、5.75、2.18 倍。結(jié)果見表3、表4。

      表3 各組不同奧沙利鉑質(zhì)量濃度時(shí)A值的比較(±s,n=5)Tab.3 Comparison of A value of different oxaliplatin concentrations in each group(±s,n=5)

      表3 各組不同奧沙利鉑質(zhì)量濃度時(shí)A值的比較(±s,n=5)Tab.3 Comparison of A value of different oxaliplatin concentrations in each group(±s,n=5)

      奧沙利鉑質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)空白組 對照組 實(shí)驗(yàn)組1.6 93.02±4.51 92.54±4.96 87.65±3.65 2.4 79.12±4.03 78.65±4.13 70.05±3.44 3.2 63.05±3.28 62.68±3.77 52.13±2.96 4.0 36.04±2.74 35.74±2.61 22.36±2.14 4.8 15.02±1.08 14.54±1.02 9.54±1.07 F 449.074 394.159 663.965 P<0.001 <0.001 <0.001

      表4 各組IC50值的比較(±s,n=5)Tab.4 Comparison of IC50 values in each group(±s,n=5)

      表4 各組IC50值的比較(±s,n=5)Tab.4 Comparison of IC50 values in each group(±s,n=5)

      注:與空白組比較,a P<0.05;與對照組比較,b P<0.05。

      項(xiàng)目 IC50/(μg·mL-1)空白組3.52±0.05對照組 3.51±0.02實(shí)驗(yàn)組 3.28±0.01ab F 61.444 P 0.016

      3.5 過表達(dá)FAT4對HCT 細(xì)胞凋亡的影響

      各組細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組、對照組比較,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);空白組與對照組細(xì)胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖3、表5。

      圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡Fig.3 Comparison of apoptosis detected by flow cytometry in each group

      表5 各組細(xì)胞凋亡率的比較(±s,n=5)Tab.5 Comparison of apoptosis rate in each group(±s,n=5)

      表5 各組細(xì)胞凋亡率的比較(±s,n=5)Tab.5 Comparison of apoptosis rate in each group(±s,n=5)

      注:與空白組比較,a P<0.05;與對照組比較,b P<0.05。

      項(xiàng)目 細(xì)胞凋亡率空白組4.61%±0.41%對照組 5.02%±0.43%實(shí)驗(yàn)組 23.62%±0.85%ab F 788.709 P<0.001

      3.6 Co-IP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及p53、p-p53、MDM2 蛋白 的相對表達(dá)量

      Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,F(xiàn)AT4與p-p53、MDM2均存在特異的相互作用。

      Western blot結(jié)果顯示,各組p-p53、MDM2 蛋白的相對表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);各組p53蛋白相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白組、對照組比較,實(shí)驗(yàn)組p-p53蛋白的相對表達(dá)量升高,MDM2蛋白的相對表達(dá)量降低(P<0.05);空白組與對照組p-p53、MDM2蛋白的相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖4、表6。

      圖4 Western blot檢測各組p53、p-p53、MDM2蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of P53,p-P53 and MDM2 proteins detected by Western blot in each group

      表6 各組P53、p-P53、MDM2蛋白相對表達(dá)量的比較(±s,n=5)Tab.6 Comparison of the relative expression of P53,p-P53 and MDM2 in each group(±s,n=5)

      表6 各組P53、p-P53、MDM2蛋白相對表達(dá)量的比較(±s,n=5)Tab.6 Comparison of the relative expression of P53,p-P53 and MDM2 in each group(±s,n=5)

      注:與空白組比較,a P<0.05;與對照組比較,b P<0.05。

      項(xiàng)目 P53 p -P53 MDM2空白組0.72±0.09 0.27±0.03 0.65±0.06對照組 0.73±0.08 0.26±0.04 0.65±0.08實(shí)驗(yàn)組 0.73±0.09 0.78±0.05ab 0.29±0.03ab F 0.022 265.300 59.450 P 0.978 <0.001 <0.001

      4 討論

      結(jié)直腸癌為臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,多數(shù)患者早期癥狀不典型,確診時(shí)通常已處于中晚期,病死率高[6-7]。FAT4為原鈣黏蛋白家族成員之一,在細(xì)胞增殖及細(xì)胞平板極性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[8-9]。有研究顯示[10-12],F(xiàn)AT4在肝癌、胃癌和乳腺癌等腫瘤中呈低表達(dá),且進(jìn)一步低表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力。目前,盡管FAT4 涉及多種惡性腫瘤,但其在結(jié)直腸癌中的作用,特別是對繼發(fā)性化療耐藥性的影響及機(jī)制仍不清楚。本研究對FAT4對結(jié)直腸癌繼發(fā)性化療耐藥性問題進(jìn)行分析,化療藥物選擇奧沙利鉑,因其應(yīng)用較廣泛,具有一定典型性。

      FAT 家族成員能對Hippo信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié),參與正常機(jī)體細(xì)胞發(fā)育、增殖過程,其中FAT4同樣被發(fā)現(xiàn)可影響腫瘤進(jìn)展[13]。另外,F(xiàn)AT4 還是重要的甲基化修飾因子,可導(dǎo)致基因突變的風(fēng)險(xiǎn)增加,降低基因 錯(cuò) 配 修 復(fù) 能 力[14-15]。研 究 證 實(shí)[16],F(xiàn)AT4 高度甲基化能引發(fā)FAT4低表達(dá),增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力,還可限制YAPI的表達(dá),對哺乳動(dòng)物心臟生長造成影響。本研究發(fā)現(xiàn),與空白組、對照組比較,實(shí)驗(yàn)組IC50值、RF降低,CCK-8實(shí)驗(yàn)A值降低,凋亡率增加,提示過表達(dá)FAT4 能抑制人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)化療敏感性。WEI R 等[17]研究也發(fā)現(xiàn),F(xiàn)AT4過表達(dá)能抑制大腸癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,與本研究共同證實(shí)FAT4過表達(dá)的作用。

      p53基因與其上、下游基因共同構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),其中MDM2-p53信號通路發(fā)揮重要作用。p53基因是一個(gè)經(jīng)典抑癌基因,激活后能對下游一系列基因的表達(dá)產(chǎn)生影響,可促進(jìn)細(xì)胞凋亡及DNA 修復(fù),阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)[18],p53 失活在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。還有學(xué)者提出[19],細(xì)胞在暴露于DNA 損傷藥物后,可導(dǎo)致p53表達(dá)水平上升,推測p53可能在促進(jìn)DNA 修復(fù)中有一定作用。MDM2主要作為p53的負(fù)性調(diào)控因子存在,可特異性標(biāo)記p53蛋白,p53蛋白高表達(dá)可激活MDM2的轉(zhuǎn)錄和翻譯,使p53蛋白被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解,降低細(xì)胞內(nèi)p53的含量。呂磊等[20]發(fā)現(xiàn),膀胱癌耐藥菌株增殖受MDM2-p53通路影響。本研究推測FAT4 過表達(dá)是否為調(diào)節(jié)HCT116 細(xì)胞內(nèi)P53、MDM2表達(dá),發(fā)揮增強(qiáng)HCT116細(xì)胞化療耐藥性作用。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組p-p53的蛋白相對表達(dá)量增高,MDM2蛋白的相對表達(dá)量降低,且Co-IP 實(shí)驗(yàn)證明FAT4與p-p53、MDM2有互相作用,提示過表達(dá)FAT4可調(diào)節(jié)p-p53、MDM2蛋白的表達(dá)。因此,推測FAT4過表達(dá)降低HCT116細(xì)胞化療耐藥性的作用機(jī)制,可能與調(diào)節(jié)MDM2-p53通路有關(guān)。

      綜上所述,F(xiàn)AT4 過表達(dá)可降低結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞化療耐藥性,增加化療敏感性,該作用可能與MDM2-p53通路有關(guān),這一結(jié)論可為臨床指導(dǎo)結(jié)直腸癌化療耐藥治療提供新方向。本研究不足之處在于,僅選用一個(gè)細(xì)胞株,未能全面概括FAT4對不同亞型細(xì)胞化療耐藥的影響及機(jī)制,故仍需深入研究,并在臨床加以證實(shí)。

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