動物乳中四種主要蛋白結(jié)構(gòu)功能及其分離純化方法研究進展

馬小梅，蘇津賢，陳 遙，舒星富，張海霞，馬忠仁

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

動物乳質(zhì)蛋白是一類富含多種必需氨基酸、營養(yǎng)成分豐富、具有諸多生理功能的優(yōu)質(zhì)蛋白，尤其在天然牛羊初乳中含量最高，如乳鐵蛋白、α-乳清蛋白、酪蛋白等，具有抗菌、免疫活性調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[1].隨著對乳質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究的深入，采用多種方法進行分離提純，如層析、色譜、沉淀分離、等電點分離及膜分離法等，期望獲得更高純度的蛋白，并為后續(xù)蛋白質(zhì)的進一步研究及乳制品開發(fā)奠定了基礎(chǔ).本文就酪蛋白、乳鐵蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)功能及其分離純化方法進行綜述，為相關(guān)蛋白質(zhì)的研究提供參考依據(jù).

1 酪蛋白的結(jié)構(gòu)特征及其功能

酪蛋白(Casein，CN)約占哺乳動物乳中總蛋白的80%，又稱干酪素，主要由乳腺上皮細胞合成，其中富含磷和鈣，對酸敏感，pH較低時容易發(fā)生沉淀；CN在組成和結(jié)構(gòu)上是一種分布不均一的混合體，主要分為αs1-CN、αs2-CN、β-CN、κ-CN[2].

αs1-CN是由199個氨基酸組成的一種單鏈蛋白，約占牛奶總蛋白的42%，含有8個(as-CN-8P)或9個(as-CN-SP)磷酸化絲氨酸殘基，是鈣敏性蛋白質(zhì)的主要特征[3]；αs2-CN由223個氨基酸組成，約占牛奶總蛋白的10%，其結(jié)構(gòu)中含有三簇帶負電的磷酸絲氨酸、谷氨酸殘基，極性部分可以形成隨機螺旋的二級和三級結(jié)構(gòu)，其C端疏水區(qū)域較小，因此屬于最親水的CN[4].在牛乳中，β-CN含量僅次于αs1-CN，含209個氨基酸殘基，具有明顯的兩極特性[5].κ-CN含169個氨基酸和1個磷酸基團，含量占比少，因其含蘇氨酸糖苷化殘基及少量磷酸絲氨酸簇，故κ-CN在溶解性方面對鈣離子低敏[4]4-17.

CN可為人體補充必需蛋白質(zhì)和金屬礦物質(zhì)等，具有較高的營養(yǎng)價值，主要應(yīng)用于高脂類食品、乳飲料的生產(chǎn)加工，以增加商品價值，還可廣泛應(yīng)用于嬰幼兒乳粉、工業(yè)用膠水、生物活性肽等生產(chǎn)[6].

2 乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)特征及其功能

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是由哺乳動物外分泌腺和中性粒細胞分泌的鐵結(jié)合型陽離子糖蛋白[7].約為700個氨基酸組成的單一多肽鏈，含兩條富含精氨酸和賴氨酸的碳水化合物側(cè)鏈，形成由α-螺旋殘基連接的兩個近似球形結(jié)構(gòu)，其上分別攜帶一個糖基化位點和可結(jié)合兩個Fe3+的結(jié)合位點，該位點還能結(jié)合脂多糖、肝素、DNA和金屬離子等[8-9].研究發(fā)現(xiàn)，人、牛、馬、駱駝等9種哺乳動物體內(nèi)的LF具有高度同源性，具有高堿性pH和內(nèi)部序列的兩倍重疊等特征[10].

LF不僅參與機體鐵的轉(zhuǎn)運代謝，而且具有抗微生物活性、抗氧化、抗炎癥等功能[11].LF同時具有免疫調(diào)節(jié)作用，通過與細胞因子和免疫細胞互作誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[7]1510-1515.大量試驗研究表明，LF介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子通路，降低神經(jīng)炎性反應(yīng)、促進機體正常代謝及體液免疫[12].Han等[13]通過CRISPR/Cas 9技術(shù)重組構(gòu)建了αs1-CN位點特異性敲除豬LF基因的轉(zhuǎn)基因白豬，體外活性檢測證明該轉(zhuǎn)基因豬乳具有抗菌活性.LF的廣譜抗病毒活性對DNA、RNA病毒等均有抑制作用.LF可通過自組裝形成具有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的納米顆粒載體，用于開發(fā)LF抗病毒納米粒子藥物載體；Senapathi等[14]研究發(fā)現(xiàn)用磺酸鹽對LF-MES(2-巰基乙磺酸鈉)納米顆粒進行表面修飾，得到的LF-MES納米粒子對HIV-1抑制活性良好.

3 α-乳白蛋白結(jié)構(gòu)特征及其功能

α-乳白蛋白(α-Lactalbumin，α-La)在乳腺中合成，占牛乳清蛋白的五分之一.α-La單鏈中含有8個半胱氨酸和123個氨基酸殘基，分子量為14.2 KDa，為結(jié)構(gòu)緊密的球蛋白[15]；α-La分子的第73位和91位氨基酸殘基形成的半胱氨酸橋?qū)ⅵ?螺旋和β-折疊連接起來，同時形成Ca2+結(jié)合位點[16].

α-La是惟一能與金屬元素結(jié)合的乳清蛋白成分，黃美佳等[17]發(fā)現(xiàn)Ca2+結(jié)合α-La能使α-La的空間構(gòu)象、抗體結(jié)合能力等發(fā)生改變，證實了金屬離子對α-La的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)具有重要的影響.α-La作為輔酶與乳糖合成密切相關(guān)，控制著乳腺中乳糖的含量，是泌乳階段的一個重要調(diào)節(jié)因子.α-La也是人體所需營養(yǎng)物質(zhì)的重要蛋白質(zhì)來源，Markus等[18]研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸的攝入有助于改善嬰兒睡眠，促進嬰幼兒的神經(jīng)發(fā)育.

4 β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)特征及功能

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-Lg)約占乳清蛋白的50%，主要以二聚體形式存在于多種哺乳動物乳汁中，呈水溶性[19]，其蛋白質(zhì)多肽鏈中含有162個氨基酸殘基、2個S-S和1個-SH，分子量約為18 kDa，屬于脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白[20].β-Lg二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊和無序結(jié)構(gòu)組成，三級結(jié)構(gòu)單體近似球狀，連接緊密，在pH為7時，形成由8條反平行鏈組成β-桶狀結(jié)構(gòu)，并且結(jié)構(gòu)表面有1個含有3個轉(zhuǎn)角的α-螺旋和9條β鏈[21].

β-Lg作為生物活性肽的極好來源，具有與LF相似的生物活性功能[22].Zhao等[23]利用真空低溫條件合成的新型有機硒化合物Se-β-Lg誘導(dǎo)H22細胞活性，發(fā)現(xiàn)Se-β-Lg在體內(nèi)外均有誘導(dǎo)H22腫瘤細胞凋亡的能力，Se-β-Lg還可以用作食品中的功能復(fù)合物.β-Lg與葉酸結(jié)合可以增強其穩(wěn)定性.Perez等[24]研制了一種熱誘導(dǎo)β-Lg聚集體，該聚集體可與脂溶性維生素和脂肪酸等親脂性分子結(jié)合，作為VA等脂溶性維生素的載體，可以用于生產(chǎn)乳質(zhì)營養(yǎng)品，改善產(chǎn)品風(fēng)味，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收.

5 乳蛋白常用的分離提純方法

5.1 酪蛋白分離純化方法

5.1.1 沉淀分離法

沉淀分離技術(shù)包括有機、無機、等電點沉淀分離法等，其操作簡單、經(jīng)濟，原料易獲得，但對復(fù)雜原料，所得產(chǎn)物中雜質(zhì)含量較多，產(chǎn)品純度低，且選擇性不強.因此只適宜于小規(guī)模蛋白乳制品生產(chǎn).2006年，國內(nèi)專利報道了在不同分離條件下沉淀α-CN和β-CN的方法，并應(yīng)用于食品加工[25].Kern等[26]使用天然磷酸酪蛋白酸鹽作為起始材料，在基于堿性pH值下添加不同濃度的鈣，從而實現(xiàn)對α-CN、β-CN和κ-CN的分級分離.

5.1.2 膜分離法

膜分離技術(shù)適合處理熱敏物質(zhì)，生產(chǎn)過程中無化學(xué)添加劑，耗能低且對操作溫度要求低，屬于一種純粹、高效的物理分離法，但有時因為選擇的濾膜孔徑過小，容易造成膜孔的堵塞，無法實現(xiàn)目的蛋白的有效截留.Baoyu等[27]等使用微濾疊加陶瓷膜過濾法除去山羊乳的雜蛋白后，真空噴霧干燥得到的CN含量在70%以上.Schafer[28]在采用疊膜和金屬盲板組成的中式規(guī)模過濾系統(tǒng)分離提純血清蛋白和CN，與單層膜動態(tài)過濾系統(tǒng)MSD對比顯示，DCF系統(tǒng)更適合于蛋白質(zhì)的分離純化.

5.1.3 酶水解法

目前，酶分離法主要用于CN的分離提純，酶源主要來自于動物、植物、微生物凝乳酶，CN首先在凝乳酶催化作用下轉(zhuǎn)化為副CN(Paracasin).當(dāng)反應(yīng)體系中存在Ca2+時，副CN上的羥基結(jié)合Ca2+，在CN膠粒間形成一化學(xué)鍵，導(dǎo)致形成凝固乳沉淀下來與乳清實現(xiàn)分離[29].Sheryl等[30]使用木瓜蛋白酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的組合處理新鮮牛奶，在牛奶凝固后分離獲得CN膠束.

5.1.4 色譜層析分離法

Aliah等[31]建立了兩步色譜純化法從山羊奶中分離純化天然αS2-CN，通過LC-ESI-MS/MS測序分析表明，該法可成功應(yīng)用于羊奶中天然αS2-CN的分離且純度較高，有助于該蛋白的體外研究.Egito等[32]將馬CN樣品通過含瓊脂糖的wheat germ agglutinin(WGA)和LichroCart C18色譜柱進行層析分離，實現(xiàn)了CN組分的分離.

5.2 乳鐵蛋白分離純化方法

5.2.1 鹽析分離

使用高濃度鹽溶液可使蛋白質(zhì)溶解度降低，析出目的蛋白，且鹽析過程可逆，不易引起蛋白質(zhì)變性，該方法對設(shè)備要求低，操作簡便，是分離提純蛋白常用的方法.徐麗萍等[33]將超濾獲得的牛乳LF粗品通過鹽析處理，并結(jié)合柱層析后可獲得純度92%的LF.紀長謹?shù)萚34]將新鮮牛初乳離心脫脂除去CN后，產(chǎn)物使用不同飽和度的硫酸銨鹽析，分離獲得LF粗品，并用DEAE-Sepharose Fast Flow進一步純化，獲得純度較高的LF.

5.2.2 超濾分離

超濾是根據(jù)膜孔徑的不同，以達到不同分子質(zhì)量和分子形狀不同的大分子物質(zhì)的分離，因此基于膜分離技術(shù)的超濾法也常應(yīng)用于LF分離提取.劉秀清等[35]在免疫親和柱層析基礎(chǔ)上，結(jié)合超濾法濃縮LF，經(jīng)檢測其靈敏度高出其他方法數(shù)十倍.Kátia等[36]研究了超濾和陽離子交換擴張床色譜(EBC)聯(lián)合使用法，一步法即可實現(xiàn)LF的分離純化，得到了純度較高的LF.

5.2.3 色譜層析分離

色譜法是目前提取高純度LF的主要工藝，主要包括吸附、親和、離子交換色譜法等.Bojana等[37]通過研究發(fā)現(xiàn)整體式離子交換色譜在LF來源的酸乳清工業(yè)加工具有較大潛力，可用于高附加值新產(chǎn)品的開發(fā).LI等[38]將駱駝乳離心脫脂后，通過肝素親和層析純化制備LF，實現(xiàn)了LF的有效分離.混合模式吸附層析(mixed mode chromatography)是近幾年開發(fā)的生物分離新方法，其功能基中兼有疏水基團和離子交換基團，具備靜電和疏水相互作用，有明顯的耐鹽吸附特性，同時配基密度較高，適合于較低濃度體系中有效目標物的分離，分離效率較高，且生產(chǎn)成本低，具有廣闊的應(yīng)用前景[39].

5.3 α-乳白蛋白、β-乳球蛋白分離純化方法

5.3.1 酶水解法

由于α-La和β-Lg的結(jié)構(gòu)不同，利用微生物來源的蛋白酶首先選擇性水解β-Lg，而保留絕大部分α-La，再利用膜濾技術(shù)進行純化即可得到α-La和β-Lg的分離產(chǎn)物.酶水解技術(shù)由于滅酶過程需要加熱處理，α-La受熱變性，同時可以降低β-Lg的致敏性.但該法α-La得率較低，純度不高，因此多集中于實驗室研究，工業(yè)化生產(chǎn)還需對酶的種類、滅活、水解程度等進行深入研究.

5.3.2 沉淀分離法

沉淀法除用于CN的分離提取外，對α-La和β-Lg也同樣適用.Nicole等[40]在酸性條件下使α-La選擇性熱沉淀后進行高通量連續(xù)離心，獲得了富含α-La的沉積物和99.7%純度的β-Lg上清液.José等[41]建立了一種選擇性熱沉淀α-La后，再使用微濾和超濾分離β-Lg的中式規(guī)模分離方法，檢測結(jié)果顯示獲得了純度為91.3%的α-La和97.2%的β-Lg.Ayoa等[42]使用三種不同酸性介質(zhì)(鹽酸、檸檬酸、乳酸)來選擇性沉淀α-La，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在較低pH下添加檸檬酸時，上清液中幾乎全為β-Lg.

5.3.3 色譜層析法

色譜層析法種類多、應(yīng)用廣泛，對生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大影響.蛋白質(zhì)的分離提純中，色譜層析分離法通常與其他方法聯(lián)用即可得到電泳效果單一的純物質(zhì)[43].Fucinos等[44]研發(fā)了一種一步式陰離子交換色譜法，從乳清蛋白分離物中純化α-La，獲得了近100%純度的α-La和β-Lg.趙玉娟等[45]先將牛乳乳清經(jīng)過硫酸銨沉淀初步分離，再利用雙水相萃取系統(tǒng)與Sephadex G-75、DEAE離子交換層析，分離獲得純度高達85%的α-La和β-Lg.趙倩如等[46]采用Sepax-C8高效液相色譜柱對牛乳中α-La和β-Lg進行分離檢測，獲得的α-La和β-Lg回收率均良好.應(yīng)有成等[47]建立了小規(guī)模Sephadex G-75凝膠層析和DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析相結(jié)合的方法純化牛乳中α-La和β-Lg，在此基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了α-La和β-Lg蛋白凍干產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn).

6 展望

隨著乳品產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，動物初乳資源為食品工業(yè)生產(chǎn)蛋白乳提供了大量又經(jīng)濟的原料，同時蛋白乳具有重要的生理活性，發(fā)展?jié)摿薮?相關(guān)乳質(zhì)蛋白的結(jié)構(gòu)功能及其分離提取相關(guān)研究成為熱點.

目前，由于國內(nèi)在該方面的技術(shù)受限，但供應(yīng)需求量大，因此基本依賴于進口，一直以來國外掌控著蛋白乳的巨大市場.急需進一步自主研發(fā)和完善國內(nèi)動物蛋白乳的分離純化及工業(yè)化生產(chǎn)[34]50-51.隨著一些新興分離技術(shù)的研發(fā)和各種技術(shù)交聯(lián)使用，開發(fā)新型乳質(zhì)蛋白的高效分離提取方法和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的工藝，并將方法加以完善，從而實現(xiàn)乳質(zhì)蛋白生產(chǎn)成本的降低，蛋白獲得率和純度的提高.