采用高通量測序技術(shù)分析寶豐清香型白酒大曲的真菌多樣性

趙志軍，郜燕燕，劉延波，葛少華，孫秋麗，劉 寧，王曉江，孫西玉，潘春梅

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 酒業(yè)學(xué)院 河南 鄭州 450046；2.寶豐酒業(yè)有限公司 河南 平頂山 467500； 3.河南省寧陵縣綜合檢驗(yàn)檢測中心 河南 商丘 476700)

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，具有悠久的歷史傳承和深厚的文化內(nèi)涵[1]。白酒香型眾多，其中清香型白酒具有清香純正、醇甜柔和等特點(diǎn)[2]，是我國白酒三大基本香型之一[3]。寶豐酒作為地方名酒，是清香型白酒的典型代表，在中原區(qū)域內(nèi)具有一定的銷量和知名度。

大曲是多菌多酶的復(fù)合體系[4]，含有十分豐富且復(fù)雜的微生物和酶[5]，這些微生物和酶關(guān)系到酒體香氣的呈現(xiàn)及香味前體物質(zhì)的形成，進(jìn)而影響白酒的品質(zhì)[6]。根據(jù)培曲工藝和成曲性質(zhì)的不同，清香型白酒大曲可分為清茬(QC)、紅心(HX)和后火(HH)三種[7]。在三種大曲生產(chǎn)中，使用的原材料相同，僅培曲溫度和技術(shù)操作略有差異，造成不同曲種內(nèi)的微生物特征和發(fā)酵特性各具特色[8]。大曲中的霉菌為釀造提供糖化力、液化力、蛋白質(zhì)分解能力，生成多種有機(jī)酸，決定著大曲多方面的質(zhì)量特性。酵母菌是大曲發(fā)酵力的主要來源，是大曲微生物菌系中重要的菌群之一，主導(dǎo)酒精的產(chǎn)生，影響醇類、酸類、酯類、酮類、酚類等風(fēng)味化合物的形成[9,10]。不同的微生物形成不同的大曲菌系結(jié)構(gòu)，其代謝產(chǎn)生的各種酶類構(gòu)成大曲的酶系，不同地域微生物群落組成差異使得不同地域的白酒酒曲帶有明顯的地域特色[11]。因此，認(rèn)識寶豐清香型白酒三種大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)特征對清香型白酒的發(fā)酵生產(chǎn)具有十分重要的意義。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，大曲微生物的研究在傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上增加了依靠分子生物學(xué)技術(shù)的免培養(yǎng)方法[12,13]。高通量測序技術(shù)作為微生物研究的免培養(yǎng)方法之一，具有通量高、成本低、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)[14]，在微生態(tài)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[15]。酒曲微生物復(fù)雜、種類繁多，尤其需要借助高通量測序技術(shù)從微生態(tài)學(xué)角度開展多樣性研究[16,17]。

本試驗(yàn)采用高通量測序技術(shù)，對寶豐酒清茬、紅心、后火三種大曲的真菌種類、豐度以及群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行研究，確定其優(yōu)勢菌群，為進(jìn)一步解析中原地區(qū)清香型白酒大曲中的功能性微生物以及從大曲中篩選優(yōu)良釀酒菌種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

清茬曲、紅心曲和后火曲取自寶豐酒業(yè)有限公司生產(chǎn)的成品曲，批號為190613B。Hi-Pure Soil DNA Kits(土壤DNA提取試劑盒，型號D3142)購自廣州美基生物科技有限公司。PCR有關(guān)試劑為TOYOBO公司產(chǎn)品?；厥占兓噭槊绹惪寺鼛鞝柼毓井a(chǎn)品。

1.2 ITS基因序列擴(kuò)增及高通量測序

按Hi-Pure Soil DNA Kits試劑盒說明書步驟提取基因組DNA，用Nanorop微量分光光度計(jì)檢測核酸的OD值，測定核酸的純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)核酸樣本的完整性。

從樣本中提取得到的基因組DNA經(jīng)質(zhì)量檢測合格后，用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增其ITS的ITS2區(qū)。所用引物序列為：ITS3-KYO2，GATGAAGAACGYAGYRAA；ITS4，TCCTCCGCTTATTGATATGC。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，使用Quanti Fluor TM熒光計(jì)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，上機(jī)測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Illumina Hiseq2500 PE250高通量測序平臺分析完成。

測序得到的原始下機(jī)數(shù)據(jù)依次使用FASTP(v 0.18.0)、FLASH(v1.2.11)、Qiime(v 1.9.1)、Mothur(v 1.34.0)、Uparse(v 9.2.64)進(jìn)行Illumina測序數(shù)據(jù)校正、拼接、Tags質(zhì)控、去冗余處理及序列聚類。

用Qiime(v 1.9.1)軟件進(jìn)行稀釋曲線分析。對OTU結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性分析。利用物種分布堆疊圖直觀展示群落中不同分組的物種組成情況。采用R語言Venn Diagram包(v 1.6.16)進(jìn)行維恩圖分析，直觀展示樣品間OTU情況。使用R語言Vegan包(v 2.5.3)進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，展示樣品間多樣性差異。使用LEFSE(LDA effect size)(v 1.0)軟件對組間(≥2組)所有物種進(jìn)行LEFSE分析，了解組間菌群差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線分析

基于97%水平下OTU的豐度信息，使用稀釋曲線和Shannon指數(shù)曲線對清茬曲、后火曲和紅心曲真菌多樣性進(jìn)行評估。根據(jù)樣品稀釋曲線來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，當(dāng)曲線走勢逐漸趨于平緩或者達(dá)到平臺期時(shí)就可以認(rèn)為測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種，反之，則表明樣品中物種多樣性較高，隨著測序深入還可能產(chǎn)生較多的新OTU。Shannon指數(shù)曲線反映樣本中微生物的多樣性，利用各樣本測序量在不同測序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。

由圖1、圖2可知，Sobs指數(shù)稀釋曲線隨序列數(shù)增加表現(xiàn)為先增加后趨于平緩的趨勢，表明測序已趨于飽和，增加測序數(shù)據(jù)無法再找到更多的OTU。Shannon指數(shù)曲線在測序序列數(shù)>10000時(shí)，Shannon指數(shù)稀釋曲線已經(jīng)進(jìn)入平臺期，說明測序數(shù)據(jù)量已足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)生物的物種信息。

圖1 真菌Sobs指數(shù)稀釋曲線

圖2 真菌Shannon指數(shù)曲線

2.2 組間樣品Alpha多樣性分析

Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage指數(shù)是常用于描述微生物群落物種多樣性的Alpha多樣性指數(shù)。這六個(gè)多樣性指數(shù)可以對群落物種組成的豐富度以及群落物種組成的均勻度進(jìn)行綜合性的評價(jià)[18]。Sobs、Chao1、ACE指數(shù)主要關(guān)心樣本的物種豐富程度，其中Sobs表示檢測到的OTU個(gè)數(shù)，Chao1和ACE表示預(yù)測的OTU個(gè)數(shù)。Coverage反映樣本的測序飽和度。Simpson、Shannon綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度，故指數(shù)的高低還會受均勻度影響，樣本中的物種分布越均勻，多樣性越高。

由表1可知，清茬曲的Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)均高于后火曲和紅心曲，說明清茬曲的真菌群落物種豐富度較后兩者高而多樣性低于后兩者。三組樣品的Coverage指數(shù)均在0.998 8～0.999 1之間，說明對各樣本文庫數(shù)據(jù)達(dá)到了較高的覆蓋率，樣本中的序列基本被測出，測序結(jié)果可信度高，能夠如實(shí)反映樣品真菌群落的組成。

表1 三組樣品真菌Alpha多樣性指數(shù)

2.3 真菌物種組成分析

Uparse(version 9.2.64)在構(gòu)建OTUs的過程中會選取代表性序列(OTUs中豐度最高的那條Tag序列)，將這些代表性序列集合，用RDP Classifier(version 2.2)的Na?ve Bayesian assignment算法，與UNITE(version 8.0)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋(設(shè)定置信度的閾值為0.8～1.0)。

挑選在所有樣本中的豐度均值排名前10的物種詳細(xì)展現(xiàn)，其他已知物種歸為Others，未知物種標(biāo)記為Unclassified。

由圖3可知，清茬曲、紅心曲和后火曲的真菌菌群共注釋到具有明確分類地位的門有四個(gè)，分別是Ascomycota(子囊菌門)、Mucoromycota(毛霉門)、Basidiomycota(擔(dān)子菌門)、Chytridiomycota(壺菌門)，同時(shí)有未知真菌菌門存在。其中Ascomycota(子囊菌門)在清茬曲、紅心曲和后火曲中的優(yōu)勢較為明顯，在三種曲中的相對豐度分別達(dá)到99.92%、95.57%和99.83%。Mucoromycota(毛霉門)在后火曲中的相對豐度為4.40%。

圖3 真菌在門水平上的分布

由4可知，清茬曲、紅心曲和后火曲的真菌菌群共注釋到具有明確分類地位的屬有十個(gè)，分別是Thermoascus(熱子囊菌屬)、Aspergillus(曲霉屬)、Rasamsonia(羅山松屬)、Rhizopus(根霉屬)、Monascus(紅曲霉屬)、Candida(假絲酵母)、Issatchenkia(伊薩酵母屬)、Symbiotaphrina、Cyberlindnera、Saccharomyces(酵母屬)，同時(shí)存有其他已知真菌菌屬和未知真菌菌屬。其中Thermoascus(熱子囊菌屬)在清茬曲、紅心曲和后火曲中的優(yōu)勢地位明顯，其相對豐度在清茬曲中達(dá)到了89.64%，明顯高于紅心曲(53.52%)與后火曲(57.06%)。在屬水平上，不同大曲間真菌的組成上有明顯差異。在清茬曲中，Thermoascus(熱子囊菌屬)為優(yōu)勢菌屬，其次是Aspergillus(曲霉屬)(2.50%)；在紅心曲中，Thermoascus(熱子囊菌屬)為優(yōu)勢菌屬，其次是Rasamsonia(羅山松屬)(15.83%)、Aspergillus(曲霉屬) (15.28%)，再次是Rhizopus(根霉屬) (4.40%)、Monascus(紅曲霉屬) (3.70%)；在后火曲中，Thermoascus(熱子囊菌屬)為優(yōu)勢菌屬，其次是Aspergillus(曲霉屬) (38.13%)。

圖4 真菌在屬水平上的分布

2.4 OTU分布Venn分析

使用R語言Venn Diagram包(version 1.6.16)對從不同大曲樣品獲取的OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分類，以Venn圖直觀顯示不同大曲樣品中特有以及共有的OTU數(shù)量。

由圖5可知，清茬曲、后火曲與紅心曲分別檢測到226個(gè)、231個(gè)與229個(gè)真菌OTU，其中共有的OTU有152個(gè)，分別占清茬曲、后火曲和紅心曲OTU總數(shù)的67.26%、65.80%和66.38%，占各組樣品OTU數(shù)比例較大。清茬曲獨(dú)有的OTU有42個(gè)，占清茬曲OTU總數(shù)的18.58%；后火曲獨(dú)有的OTU有35個(gè)，占后火曲OTU總數(shù)的15.15%；紅心曲獨(dú)有的OTU有35個(gè)，占紅心曲OTU總數(shù)的15.28%。

圖5 三組樣品的OTU分布Venn圖

2.5 PCoA分析

使用R語言Vegan包(version 2.5.3)，在OTU水平上基于Bray-curtis算法得到的距離指數(shù)，對各處理樣品物種進(jìn)行PCoA分析(Principal Co-ordinate Analysis，主坐標(biāo)分析)，PCoA是基于距離矩陣而進(jìn)行的降維分析，以百分比評估各坐標(biāo)軸對菌群結(jié)構(gòu)總體差異的解釋度，一般PCo1和PCo2總和達(dá)到50%以上較好。

圖6中的圓點(diǎn)代表單個(gè)樣品，不同顏色代表不同的分組，相似度高的樣品在一個(gè)范圍內(nèi)顯著聚集。圖中主坐標(biāo)PCo1和主坐標(biāo)PCo2對菌群結(jié)構(gòu)總體差異的解釋度分別達(dá)到56.16%和28.64%，合計(jì)84.80%(>50%)，可視為差異的主要來源。通過對三種大曲的PCoA分析發(fā)現(xiàn)，受主坐標(biāo)PCo1影響，清茬曲與紅心曲、后火曲的真菌菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異，紅心曲與后火曲的真菌菌群結(jié)構(gòu)更相似。

2.6 指示物種分析

使用LEFSE(version 1.0)軟件對組間所有物種進(jìn)行LEFSE分析，輸出LDA柱狀圖(圖7)(默認(rèn)閾值：LDA>2)以及進(jìn)化分支圖(圖8)，找出各組間特異的主要菌群。

圖7 LDA柱狀圖

圖8 進(jìn)化分支圖

LDA柱狀圖展現(xiàn)了清茬曲、紅心曲和后火曲中具有顯著性差異的真菌微生物，柱的長度代表差異物種的影響值大小。清茬曲中的Thermoascus-aurantiacus(橙色嗜熱子囊菌)對比紅心曲、后火曲具有顯著性差異；后火曲中的Asperillus-montevidensis(蒙地曲霉)、Microascus-senegalensis、Hyphopichia(生絲畢赤酵母屬)、Hyphopichia-burtonii(伯頓生絲畢赤酵母)、Debaryomycetaceae、Millerozyma-farinosa(粉酵母菌)對比清茬曲、紅心曲具有顯著性差異；紅心曲中的Rasamsonia-composticola、Trichocomaceae(發(fā)菌科)、Rhizopus-arrhizus(無根根霉)、Mucorales、Mucoromycetes、Mucoromycota、Thermoascus-crustaceus(堅(jiān)脆嗜熱子囊菌)、Monascus-purpureus(紫紅曲霉)、Monascus(紅曲霉)、Candida-glabrata(光滑假絲酵母)、Cyberlindnera-fabianii(費(fèi)比恩塞伯林德納氏酵母)對比清茬曲、后火曲具有顯著性差異。

3 討論

依賴于形態(tài)、生理生化特性進(jìn)行分類鑒定的傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分離方法，所得到的微生物僅占微生物總數(shù)的0.1%～10%[19]，無法解析微生物的組成及豐度，無法全面深入地反映大曲真菌菌群結(jié)構(gòu)的完整性。

本試驗(yàn)采用Illumina Hiseq2500 PE250測序平臺分析寶豐清香型白酒的清茬、紅心、后火三種大曲中的真菌微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，結(jié)果表明清茬曲的物種多樣性較紅心曲和后火曲高，而豐富度是三者中最低的。通過物種分析表明，在門水平上三種大曲的優(yōu)勢真菌菌門均為Ascomycota(子囊菌門)；在屬水平上，清茬曲的優(yōu)勢真菌菌屬為Thermoascus(熱子囊菌屬)，紅心曲的優(yōu)勢真菌菌屬為Thermoascus(熱子囊菌屬)、Rasamsonia、Aspergillus(曲霉屬)；后火曲的優(yōu)勢真菌菌屬為Thermoascus(熱子囊菌屬)、Aspergillus(曲霉屬)。三種大曲共有的OTU在各個(gè)大曲中所占比例均超過65%，各個(gè)大曲獨(dú)有的OTU占比均未達(dá)到20%，說明三種大曲之間的菌群結(jié)構(gòu)差異性較小。主坐標(biāo)分析中，清茬曲與后火曲、紅心曲在PCo1軸上分離開來，說明真菌的群落結(jié)構(gòu)在制曲的各階段變化規(guī)律有所不同，其中后火曲與紅心曲的群落結(jié)構(gòu)更為相似。LEFSE分析得到了清茬曲、紅心曲和后火曲中的主要差異菌群，這些菌群也是形成大曲功能差異的主要原因。

周森等[11]對北京、山西、臺灣、黑龍江、河北的11份清香型白酒大曲樣本進(jìn)行微生物種群多樣性分析，結(jié)果表明11種大曲真菌多樣性較為一致，扣囊覆膜酵母是優(yōu)勢真菌。張雙燕等[18]對北京清香型白酒大曲微生物多樣性的研究表明，真菌中的優(yōu)勢菌是假絲酵母屬，此外還有曲霉屬、毛霉屬、威克漢姆酵母屬等。羅惠波等[20]對山西汾酒清茬曲、紅心曲和后火曲的真菌群落結(jié)構(gòu)的比較研究表明，清茬曲的優(yōu)勢真菌為畢赤酵母屬和根霉屬，紅心曲的優(yōu)勢真菌為根霉屬和橫梗霉屬，后火曲的優(yōu)勢真菌為畢赤酵母屬。本試驗(yàn)表明，寶豐酒清茬曲的優(yōu)勢真菌為Thermoascus(熱子囊菌屬)，紅心曲的優(yōu)勢真菌為Thermoascus(熱子囊菌屬)、Rasamsonia、Aspergillus(曲霉屬)，后火曲的優(yōu)勢真菌為Thermoascus(熱子囊菌屬)、Aspergillus(曲霉屬)，說明中原地區(qū)的清香型白酒大曲的優(yōu)勢真菌與其他地區(qū)存在差異。

本試驗(yàn)通過對寶豐清香型白酒大曲真菌微生物的解析，對其真菌多樣性、優(yōu)勢種群的分布、群落結(jié)構(gòu)差異以及數(shù)量關(guān)系有了一定的了解，為中原地區(qū)清香型白酒大曲真菌微生物的研究提供了參考。