復(fù)合纖維素酶對(duì)小麥麩降解條件的優(yōu)化

索江華，唐桂芬，黃 鋒，李新峰，張曉靜

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南省永城市畜牧局，河南 永城 476610)

在釀酒過(guò)程中，小麥糖化率低主要是由于麩皮中粗纖維含量高所導(dǎo)致，適當(dāng)添加纖維素酶可以顯著地提高出酒率，并能縮短發(fā)酵時(shí)間[1-4]。為了提高小麥釀酒效率，本研究通過(guò)對(duì)配制復(fù)合纖維素酶降解麩皮的條件進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)提高小麥出酒率提供理論支持。

1 材料與試劑

小麥麩于(105±2)℃烘至恒質(zhì)量，過(guò)0.425 mm篩網(wǎng)。纖維素酶的酶活為30 000 U/g。

葡萄糖、檸檬酸、3,5-二硝基水楊酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取(105±2) ℃下烘干至恒質(zhì)量的無(wú)水葡萄糖1 g，加pH值為5.6的檸檬酸鹽緩沖溶液攪拌至完全溶解，定容至100 mL，使其質(zhì)量濃度為10 mg/mL。

2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)的曲線繪制

用檸檬酸鹽緩沖液將2.1.1配成質(zhì)量濃度為0、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照3,5-二硝基水楊酸法測(cè)還原糖含量[5]。以還原糖含量為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 還原糖測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸試劑法檢測(cè)還原糖含量。

2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以還原糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別以不同梯度的酶濃度、pH值、溫度和反應(yīng)時(shí)間為研究對(duì)象，觀察復(fù)合纖維素酶對(duì)小麥麩中纖維素降解工藝的影響。

2.3.1 酶濃度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

將1.0 mL pH值為5.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液加入0.02 g小麥麩樣品，分別加入濃度為30、60、90、120、150 U/mL的纖維素酶各0.5 mL,于50 ℃的水浴鍋中反應(yīng)1 h，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，以確定纖維素酶的最佳工作濃度。

2.3.2 pH值對(duì)纖維素酶催化效果的影響

取 0.02 g的小麥麩樣品分別加入pH值為3.0、3.6、4.6、5.6、6.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液1.0 mL及酶濃度為120 U/mL的纖維素酶0.5 mL，于50 ℃的水浴鍋中反應(yīng)1 h，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，以確定纖維素酶的最適pH值。

2.3.3 溫度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

取0.02 g小麥麩樣品加入1.0 mL pH值為4.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，隨后加入0.5 mL酶濃度為120 U/mL的纖維素酶，分別于40、45、50、55、60 ℃的水浴反應(yīng)1 h，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，以確定纖維素酶的最佳反應(yīng)溫度。

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)纖維素酶催化效果的影響

取0.02 g小麥麩樣品，加入1.0 mL pH值為4.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液及0.5 mL 120 U/mL的纖維素酶，于50 ℃水浴反應(yīng)的1、6、12、18、24 h，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，以確定纖維素酶的最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016軟件對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，利用軟件Design Expert 8.06對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析，以確定模型和因素的顯著性[8]。

2.4 響應(yīng)面法對(duì)降解條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定各因素的優(yōu)化水平。以還原糖含量作為響應(yīng)值，采用Box-Behnken法設(shè)計(jì)纖維素酶降解小麥麩的工藝條件，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素與水平編碼值見(jiàn)表1[6,7]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)2.1.2方法建立吸光度值與葡萄糖含量之間線性關(guān)系如圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 酶濃度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

由圖2可知,隨著酶濃度的增大,還原糖含量逐漸升高。當(dāng)酶濃度為120 U/mL時(shí)，還原糖含量最大(122.81 mg/L)；酶濃度繼續(xù)增大還原糖含量明顯下降。最佳酶濃度為120 U/mL。

圖2 酶濃度對(duì)小麥麩還原糖含量的影響

3.2.2 pH值對(duì)纖維素酶催化效果的影響

由圖3可知，隨著pH值增大還原糖濃度逐漸增大，pH值在3.0～4.6時(shí)，小麥麩中還原糖的量增至138.14 mg/L；當(dāng)pH繼續(xù)增大時(shí)，還原糖濃度顯著。因此，確定最適pH值為4.6。

圖3 pH值對(duì)小麥麩還原糖含量的影響

3.2.3 溫度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

由圖4可知，隨著溫度的升高，還原糖含量逐漸增大。當(dāng)溫度在40～50 ℃時(shí)，小麥麩中還原糖含量增至80.20 mg/L；隨著溫度繼續(xù)升高，還原糖含量顯著下降，因此確定最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

圖4 溫度對(duì)小麥麩還原糖含量的影響

3.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)纖維素酶催化效果的影響

由圖5可知，隨著酶反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)還原糖含量逐漸增大。當(dāng)酶反應(yīng)時(shí)間在1～18 h時(shí)，小麥麩中還原糖含量增至142.42 mg/L，隨著酶反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖含量略有下降。因此，確定最適反應(yīng)時(shí)間為18 h。

圖5 酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)小麥麩還原糖含量的影響

3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

3.3.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)，以還原糖含量Y作為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.06進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

續(xù)表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

3.3.2 回歸模型的建立

用Design-Expert 8.06軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到以還原糖含量為響應(yīng)函數(shù)和建立各參數(shù)編碼值的二次響應(yīng)面回歸模型：Y=110.73+7.47A+4.76B-2.22C-5.21D+3.39AB+5.46AC-6.94AD+11.57BC-3.42BD+6.96CD-24.96A2-15.76B2-18.12C2-18.59D2

由表3可以得出，本試驗(yàn)的二次多項(xiàng)模型顯著(P<0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.1)，回歸方程決定系數(shù)R2=0.951，表示該模型解釋了95.40%的響應(yīng)值變化，方程擬合程度較好，可以用作纖維素酶對(duì)小麥麩中纖維素降解條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型的方差分析

3.3.3 響應(yīng)面分析和優(yōu)化

為分析各因素在交互項(xiàng)上對(duì)纖維素酶降解小麥麩效果的影響，利用Design-Expert 8.06分析軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行運(yùn)算，得出各因素交互項(xiàng)的響應(yīng)面(圖6)。

(a)溫度和時(shí)間不變，酶濃度和pH值交互作用對(duì)還原糖含量的影響；(b)溫度和pH值恒定，酶濃度和酶反應(yīng)時(shí)間交互作用對(duì)還原糖含量的影響；(c)pH值和時(shí)間恒定，酶濃度和溫度交互作用對(duì)還原糖含量的影響；(d)溫度和酶濃度恒定，pH值和酶反應(yīng)時(shí)間交互作用對(duì)還原糖含量的影響；(e)酶濃度和酶反應(yīng)時(shí)間恒定，pH值和溫度交互作用對(duì)還原糖含量的影響；(f)酶濃度和pH值恒定，酶反應(yīng)時(shí)間和溫度交互作用對(duì)還原糖含量的影響。圖6 各因素間交互作用對(duì)小麥麩還原糖含量的影響

a圖顯示酶反應(yīng)時(shí)間為18 h，溫度為50 ℃時(shí)，酶濃度與pH值的交互作用對(duì)小麥麩中纖維素降解成還原糖的影響。還原糖含量的最大區(qū)域位于酶濃度114～138 U/mL，pH值在4.1～5.1。b圖顯示，pH值為4.6，溫度為50 ℃時(shí)，酶濃度為114～132 U/mL，酶反應(yīng)時(shí)間在15～21 h，還原糖含量最大。c圖顯示，pH值為4.6，酶反應(yīng)時(shí)間為18 h，酶濃度為102～144 U/mL，溫度在45～53 ℃，還原糖含量最大。d圖顯示，酶濃度為120 U/mL，溫度為50 ℃時(shí)，pH值為3.6～5.6，酶反應(yīng)時(shí)間在12～24 h，還原糖含量最大。e圖顯示，酶濃度為120 U/mL，酶反應(yīng)時(shí)間為18 h，pH值為4.1～5.1，溫度在47～51 ℃，還原糖含量最大。f圖顯示，酶濃度為120 U/mL，pH值為4.6時(shí)，酶反應(yīng)時(shí)間為15～21 h，溫度在47～51 ℃，還原糖含量最大。

最終確定纖維素酶對(duì)小麥麩中纖維素降解的最優(yōu)條件為酶濃度為125 U/mL、pH 值為4.8、酶反應(yīng)時(shí)間為18 h、反應(yīng)溫度為48 ℃，小麥麩中還原糖含量最大為114.31 mg/L。

3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到各因素最佳參數(shù)為優(yōu)化結(jié)果，確定最佳降解工藝條件是pH值為4.8，酶濃度為125 U/mL，溫度為48 ℃、反應(yīng)時(shí)間為18 h，這時(shí)小麥麩中還原糖含量平均值為114.31 mg/L。本研究得到的還原糖含量相對(duì)于理論數(shù)據(jù)誤差為2.04 mg/L，表明響應(yīng)面所得的最佳組合適用于復(fù)合纖維素酶降解小麥麩生成還原糖，試驗(yàn)可行。

4 結(jié)論

纖維素酶是一組復(fù)合酶，可以通過(guò)外切酶和內(nèi)切酶作用破壞原料中不溶性纖維素鏈狀結(jié)構(gòu)，逐步釋放出還原糖，以利于酒曲中酵母將還原糖發(fā)酵為乙醇。在釀酒前添加纖維素酶有利于提高原料的出酒率[9]。本試驗(yàn)以小麥纖維素含量最高的種皮為研究對(duì)象，在復(fù)合纖維素酶單因素試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析得出酶最佳降解條件：酶濃度為125 U/mL、pH值是4.8、溫度為48 ℃、酶反應(yīng)時(shí)間為18 h，這時(shí)小麥麩中還原糖含量為114.31 mg/L。未經(jīng)纖維素酶處理的小麥麩還原糖含量為48.25 mg/L，復(fù)合纖維素酶處理組還原糖含量提高了137%。