向日葵HaLACS7基因的生物信息學(xué)和表達(dá)分析

周菲

（1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，150086，黑龍江哈爾濱；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，150086，黑龍江哈爾濱）

向日葵（Helianthus annuus L.）是世界上重要的油料作物之一。植物油的脂肪酸組成決定了它們的品質(zhì)和用途，從營養(yǎng)價(jià)值和工業(yè)應(yīng)用的角度來看，有必要降低植物油中飽和脂肪酸含量。高油酸是一種單不飽和脂肪酸，由于含高油酸的食用油在烹飪、加工或儲(chǔ)存時(shí)具有更高的抗氧化穩(wěn)定性，因此，提高種子中油酸所占比例也是向日葵品質(zhì)改良的重要目標(biāo)。LACS編碼長鏈?；鵆oA合成酶，在高等植物中，LACS參與了多種代謝途徑且被定位在多種細(xì)胞器中，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[1]、葉綠體[2]和過氧化物酶體[1]。LACS能把游離脂肪酸轉(zhuǎn)化成長鏈?；鵆oA，在脂肪酸合成、分解及其他相關(guān)代謝過程中發(fā)揮重要功能[3]。油菜BnLACS2基因的過表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因油菜中的油含量明顯增加，而BnLACS2-RNAi轉(zhuǎn)基因油菜的油含量降低[4]。在向日葵中，LACS1和LACS2蛋白分別在質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上表達(dá)，參與種子發(fā)育過程中油脂的合成[5]。

本研究通過分析實(shí)驗(yàn)室前期獲得的高、低油酸向日葵種子的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，在脂肪酸生物合成代謝通路中鑒定出顯著差異表達(dá)的HaLACS7基因，以此為基礎(chǔ)，對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)HaLACS7在高、低油酸向日葵不同發(fā)育時(shí)期的種子以及其他組織部位的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為后續(xù)該基因功能的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2019年將向日葵高油酸保持系“L-1-OL-1”和低油酸保持系“86-1”種植在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所試驗(yàn)基地（哈爾濱呼蘭區(qū)康金鎮(zhèn)）。從開花7d起，每5d取1次樣，取至開花后37d，每次取花盤最外3圈的種子，同時(shí)取開花后7d的向日葵根、莖、葉、管狀花和舌狀花，將材料經(jīng)液氮速凍后存于-80℃冰箱，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因的生物信息學(xué)分析 在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性比對(duì)和相似性搜索。利用ExPASy系統(tǒng)下的蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)工具 Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)氨基酸組成、相對(duì)分子量、等電點(diǎn)和原子組成等參數(shù)。利用SOPMA在線程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.ht ml）分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用ProtScale在線軟件（http://web.expasy.org/protscale/）分析基因氨基酸序列的親/疏水性。利用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件預(yù)測(cè)基因的亞細(xì)胞定位。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 熒光定量PCR分析 利用植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]對(duì)向日葵種子總RNA進(jìn)行提取，取0.5μg RNA利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）合成cDNA第1條鏈。采用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）試劑，Roche LightCycler 480II熒光定量PCR儀，以向日葵β-actin基因（AF282624）為內(nèi)參基因，Real-Time PCR 總反應(yīng)體系為 20μL（cDNA 1.2μL，SYBR Green 10μL，前、后引物各 0.6μL，ddH2O 7.6μL）。Real-Time PCR 反應(yīng)程序如下：98℃ 2min；98℃10s，58℃10s，68℃30s，共45個(gè)循環(huán)，待PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析，采用2-ΔΔCt法分析HaLACS7基因的表達(dá)量。內(nèi)參基因β-actin引物為 F：GCAAAAAGCAGCTCGTCTGT，R：AGCA GCTTCCATTCCAATCA。HaLACS7基因熒光定量引物為F：TGCTTTGGTTGTCCTGT，R：CGAGG TGACATCGTTGA。

2 結(jié)果與分析

2.1 HaLACS7生物信息學(xué)分析

2.1.1 蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)HaLACS7基因包含948bp的開放閱讀框，編碼315個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)表明，HaLACS7基因編碼蛋白的原子總數(shù)為4990個(gè)，分子式為C1611H2477N421O464S17，蛋白分子量35.71kD，等電點(diǎn)理論值5.82，預(yù)測(cè)該蛋白是酸性蛋白，HaLACS7編碼蛋白氨基酸組成見表1。

表1 向日葵HaLACS7編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of protein encoded by HaLACS7 in sunflower

2.1.2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)分析HaLACS7編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)具有24.76%的α-螺旋、45.08%的無規(guī)則卷曲、23.81%的延伸鏈和6.35%的β-轉(zhuǎn)角。預(yù)測(cè)結(jié)果（圖1）表明，HaFATB編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲。

圖1 向日葵HaLACS7編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Secondary structure prediction of protein encoded by HaLACS7 in sunflower

2.1.3 蛋白質(zhì)親疏水性分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 由圖2可知，大于0部分多于50%為疏水性蛋白，而小于0部分多于50%為親水性蛋白，HaLACS7編碼蛋白為親水性蛋白。Cell-PLoc 2.0軟件預(yù)測(cè)HaLACS7編碼蛋白亞細(xì)胞定位于過氧化物酶體。

圖2 向日葵HaLACS7編碼蛋白質(zhì)親/疏水性分析Fig.2 Hydrophilic/hydrophobic analysis of protein encoded by HaLACS7 in sunflower

2.1.4 HaLACS7基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 將向日葵HaLACS7與大豆（Glycine max L.）、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）和蓖麻（Ricinus communis L.）等物種的LACS基因以及擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）LACS家族9個(gè)基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與分析（圖3），發(fā)現(xiàn)向日葵HaLACS7與其他物種的LACS7和LACS6基因進(jìn)化關(guān)系較近，且與同屬菊科的萵苣（Lactuca sativa L.）和洋薊（Cynara cardunculus var.scolymus L.）的LACS6進(jìn)化關(guān)系最近，序列相似性均為84%，向日葵HaLACS7與擬南芥LACS6和LACS7聚在一個(gè)大分支上，而擬南芥LACS家族其他7個(gè)基因聚在另一個(gè)大分支上。

圖3 向日葵HaLACS7基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of HaLACS7 gene in sunflower

2.2 HaLACS7基因表達(dá)分析

由圖4可知，HaLACS7在高、低油酸向日葵種子不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量變化趨勢(shì)明顯不同，在“86-1”種子花后27d表達(dá)量最高，其次是花后37d，在花后22d不表達(dá)，其他時(shí)期表達(dá)量較低。“L-1-OL-1”種子在花后37d表達(dá)量最高，其次是花后22和32d，在花后7d表達(dá)量較低，其他時(shí)期不表達(dá)（圖4）?？傮w來說，HaLACS7在2份材料種子發(fā)育后期表達(dá)量均較高。HaLACS7在向日葵開花后7d時(shí)組織中的表達(dá)量排序?yàn)樯酄罨ǎ靖痉N子＞管狀花＞葉＞莖。

圖4 HaLACS7基因在不同發(fā)育時(shí)期及不同部位表達(dá)模式Fig.4 The expression patterns of HaLACS7 gene at different development stages and different parts

3 討論

擬南芥中發(fā)現(xiàn)的LACS基因家族共有9個(gè)成員，命名為AtLACS1-9[6]，其中AtLACS6和AtLACS7存在于過氧化物酶體中，能夠參與擬南芥脂肪儲(chǔ)備中脂肪酸的降解[7]，并與脂肪酸β-氧化途徑有關(guān)[1]。本研究通過對(duì)向日葵HaLACS7與其他物種LACS基因系統(tǒng)進(jìn)化的分析，發(fā)現(xiàn)向日葵HaLACS7與擬南芥AtLACS6和AtLACS7聚在一個(gè)大分支上，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)HaLACS7編碼蛋白定位于過氧化物酶體，這也與AtLACS6和AtLACS7亞細(xì)胞定位結(jié)果一致，這表明HaLACS7與擬南芥AtLACS6和AtLACS7功能上可能存在一定的相似之處，可能在脂肪酸β-氧化等代謝的過程中起關(guān)鍵作用，這些生理過程可為向日葵種子發(fā)育油脂積累提供必要的能量和碳源[8]，本研究可為向日葵HaLACS7基因功能的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

擬南芥LACS基因表達(dá)分析顯示，除AtLACS5在花中特異表達(dá)之外，其他成員在各組織中普遍轉(zhuǎn)錄，但具有明顯的器官或組織特異性，且大部分AtLACS基因在花以及萌發(fā)的種子中大量表達(dá)，表明這些基因不僅參與花組織的油脂代謝，而且對(duì)種子甘油酯的合成起到關(guān)鍵作用[9]。與擬南芥AtLACS7同源性較高的油茶CoLACS1基因在種子發(fā)育各時(shí)期平穩(wěn)表達(dá)，表達(dá)豐度變化不大[10]。LACS6在花生子房柄和花的表達(dá)量極高，與根、莖、葉和仁等組織有極顯著差異，其表達(dá)量為花＞子房柄＞葉＞仁＞莖＞根[11]。本研究中HaLACS7在向日葵舌狀花中相對(duì)表達(dá)量非常高，這與花生LACS6和擬南芥LACS基因表達(dá)結(jié)果一致，在2份高、低油酸向日葵材料種子發(fā)育后期表達(dá)量均較高，可能主要在于彌補(bǔ)呼吸作用等引起的能量消耗以及維持種仁油脂含量動(dòng)態(tài)平衡[12]。

目前，關(guān)于植物L(fēng)ACS基因影響脂肪酸組成研究的報(bào)道較少。在亞麻中通過體內(nèi)、體外試驗(yàn)[13]發(fā)現(xiàn)，LuLACS8A和LuDGAT2-3共表達(dá)能催化亞麻酸（18:0）在三酰甘油中富集。分別與擬南芥LACS9和LACS8基因序列同源的向日葵HaLACS1和HaLACS2在發(fā)育中的種子中表達(dá)水平較高，2種酶表現(xiàn)出相似的底物特異性，均對(duì)油酸的選擇性很高[5]。本研究中HaLACS7在低油酸材料種子發(fā)育前期，隨著種子油脂積累，HaLACS7表達(dá)逐漸上調(diào)，在發(fā)育后期表達(dá)量較高；而在高油酸材料中除了在種子發(fā)育中期和后期表達(dá)量較高，其他時(shí)期基本不表達(dá)，HaLACS7在高、低油酸向日葵種子不同發(fā)育階段表達(dá)變化趨勢(shì)明顯不同，推測(cè)HaLACS7表達(dá)可能影響向日葵種子油酸的合成，由于植物油脂的合成涉及多層次的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，基因具體功能仍需后續(xù)進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

預(yù)測(cè)向日葵HaLACS7編碼蛋白為酸性且為親水性蛋白，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲，預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位于過氧化物酶體。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，HaLACS7與萵苣和洋薊的LACS6進(jìn)化關(guān)系最近，序列相似性均為84%，且與擬南芥LACS6和LACS7聚在一個(gè)大分支上，表明它們功能可能相似。HaLACS7在向日葵組織中的表達(dá)量為舌狀花＞根＞種子＞管狀花＞葉＞莖，HaLACS7在高、低油酸向日葵種子發(fā)育后期表達(dá)量均較高，但在2份材料種子不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)變化趨勢(shì)明顯不同，推測(cè)HaLACS7表達(dá)可能影響向日葵種子油酸的合成。