苦蕎漆酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析

楊曉琳 段 迎 蔡蘇云 賀潤(rùn)麗 尹桂芳王艷青 盧文潔 孫道旺 王莉花

（1山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，030619，山西太原；2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，650221，云南昆明）

苦蕎[Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn]為雙子葉蓼科一年生草本植物，作為藥食兼用作物，富含抗性淀粉、高活性蛋白和膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)成分，以及蘆丁和槲皮素等黃酮類生物活性成分，具有降壓、降脂和降膽固醇等功效[1-4]。由于苦蕎米具有極高的營(yíng)養(yǎng)藥用價(jià)值，其產(chǎn)品也在不斷被研發(fā)，開(kāi)發(fā)方向日益廣泛，使得人們對(duì)苦蕎米的需求量不斷提高。根據(jù)果殼厚度，苦蕎可分為厚殼型和薄殼型2類[5]。普通栽培苦蕎由于種皮厚、難脫殼形成整粒生蕎米，降低了苦蕎的營(yíng)養(yǎng)活性成分和加工利用價(jià)值；薄果殼突變體由于易脫殼成整粒生蕎米，但適應(yīng)性差和產(chǎn)量低等導(dǎo)致其難以推廣種植，所以薄果殼苦蕎成為研究和育種的熱點(diǎn)。

漆酶（laccase）是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于真菌、細(xì)菌和植物中，在高等植物中通過(guò)氧化還原反應(yīng)催化各種底物，參與到植物的各種生理反應(yīng)中。研究[6-8]發(fā)現(xiàn)擬南芥共有17條漆酶基因（AtLAC1～AtLAC17)，根據(jù)功能分為6類，其中AtLAC4和AtLAC17參與木質(zhì)素合成，既引導(dǎo)又指導(dǎo)細(xì)胞壁的木質(zhì)化。已有證據(jù)[9-10]表明漆酶能夠參與細(xì)胞壁形成，參與調(diào)控木質(zhì)素單體的聚合過(guò)程，在植物木質(zhì)素合成中起著重要的作用。在楊樹(shù)中抑制漆酶基因的表達(dá)，木質(zhì)素總含量組成都沒(méi)有發(fā)生變化，但導(dǎo)致楊樹(shù)木質(zhì)部纖維細(xì)胞壁的變形脫落，表明漆酶對(duì)木質(zhì)部纖維及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性有重要影響[11]。

吳朝昕[12]對(duì)苦蕎果殼成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)厚果殼苦蕎果殼木質(zhì)素含量高于薄果殼苦蕎。本課題組前期研究以云蕎1號(hào)與小米蕎雜交F2為遺傳材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，分析比較苦蕎薄果殼和厚果殼中差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素生物合成途徑大部分基因在苦蕎厚果殼的表達(dá)量高于薄果殼，推測(cè)苦蕎薄果殼性狀與木質(zhì)素成分合成和積累量低有關(guān)。對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中木質(zhì)素合成途徑差異基因分析結(jié)果表明，漆酶基因在薄果殼苦蕎中的表達(dá)量顯著低于厚果殼苦蕎?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，本試驗(yàn)以苦蕎為材料，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵基因漆酶基因進(jìn)行克隆，并對(duì)其進(jìn)行序列、蛋白理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析，為闡明苦蕎薄果殼形成的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別采用云蕎1號(hào)（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所選育的厚果殼品種）和小米蕎（云南地方薄果殼品種）不同發(fā)育期果實(shí)的混合材料進(jìn)行基因克隆。選用云蕎1號(hào)和小米蕎結(jié)實(shí)期不同部位組織材料（即結(jié)實(shí)期的葉、花、莖、果殼和種子）進(jìn)行熒光定量PCR分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列及漆酶中4個(gè)銅原子附近的氨基酸保守序列，分別設(shè)計(jì)了8條引物用于RT-PCR基因克?。ū?），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列及用途Table 1 Sequences of primers and their usage

1.2.2 RNA提取與cDNA第1鏈合成 根據(jù)Trizol提取試劑盒，由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，操作說(shuō)明分別對(duì)苦蕎厚果殼和薄果殼混合材料進(jìn)行總RNA提取。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取結(jié)果，選擇完整性較好、條帶清晰且無(wú)降解的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

在0.2mL的PCR管中加入總RNA 5μL、隨機(jī)引物 1μL和 ddH2O 1μL，70℃溫浴 5min，冰浴2min；離心加入試劑 5× First-Strand Buffer 2.0μL、10mmol/L dNTP 0.5μL、Rnase inhibitor 0.25μL 和Reverse Transcriptase 0.25μL，總體積 10.0μL，42℃溫浴60min，72℃溫浴10min。

1.2.3 RT-PCR基因克隆 以苦蕎總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第1鏈為模板，采用25μL的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，包括2×GC Buffer I 12.5μL、上游引物(10μmol/L)0.5μL、下游引物（10μmol/L）0.5μL、dNTP（10mmol/L）0.2μL、ddH2O 10.1μL、cDNA模板1μL和Taq酶（5U/μL）0.2μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性3min；94°C變性30s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 90s，循環(huán) 33 次；72°C修復(fù)延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用試劑盒回收純化目的條帶，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 漆酶基因及其編碼蛋白序列分析 將克隆所得基因序列在NCBI（http://www.ncbi.nim.nih.gov/blast/Blast.cgi）進(jìn)行 Blast比對(duì)，在 ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）中查找基因的ORF，翻譯獲取氨基酸序列。使用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）工具在線對(duì)苦蕎漆酶蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；用在線軟件EX Pasy（https://web.expasy.org/protparam/）分析編碼蛋白基本理化特性，用protscale（https:/web.expasy.org/protscale/）工具對(duì)其親、疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線分析苦蕎漆酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；應(yīng)用SWISS-MODEL（http://swiss model.expasy.org/）模擬構(gòu)建FtLAC-1和FtLAC-2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。在NCBI上的Blastp同源比對(duì)，將高分值序列在DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)，并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建苦蕎漆酶與其他植物漆酶NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[13-15]。

1.2.5 漆酶基因熒光定量PCR（qRT-PCR）分析用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因及內(nèi)參基因引物序列（表1）。qRT-PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30s，隨后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)：95℃變性5s，60℃退火30s。以苦蕎FtH3（JF769134.1）為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法計(jì)算出基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎RNA提取及漆酶基因的克隆結(jié)果

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示，在800和2500bp左右有明顯的擴(kuò)增條帶。PCR產(chǎn)物回收測(cè)序，將測(cè)序序列進(jìn)行拼接組裝，得到最終序列。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)克隆到的2條laccase基因在云蕎1號(hào)（厚果殼）和小米蕎（薄果殼）中的序列一致性為100%，且與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列高度一致，可見(jiàn)LAC-1和LAC-2基因在薄殼苦蕎和厚殼苦蕎中沒(méi)有突變和分化，所以命名為FtLAC-1和FtLAC-2。FtLAC-1和FtLAC-2基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度分別為1695和1707bp，各編碼564和568個(gè)氨基酸。

圖1 苦蕎LAC-1和LAC-2克隆基因電泳圖Fig.1 Amplification of the LAC-1 and LAC-2 genes from tartary buckwheat

2.2 苦蕎漆酶基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 漆酶蛋白理化性質(zhì)分析 使用Pfam對(duì)漆酶蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖2）顯示，2個(gè)基因編碼蛋白均含有3個(gè)經(jīng)典銅離子結(jié)構(gòu)域，即Cu-oxidase-3、Cu-oxidase和Cuoxidase-2結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明FtLAC-1和FtLAC-2均可能具有漆酶蛋白的基本功能。利用EX PASy工具進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)一步了解苦蕎漆酶蛋白的理化特性以及潛在功能，結(jié)果顯示，F(xiàn)tLAC-1和FtLAC-2蛋白分子量分別為61.41和62.47kD，理論等電點(diǎn)為9.45和9.41，F(xiàn)tLAC-1蛋白分子式為C2796H4336N760O771S15，帶負(fù)電氨基酸35個(gè)，帶正電氨基酸53個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為35.29；FtLAC-2蛋白分子式為C2837H4329N765O804S14，帶負(fù)電氨基酸27個(gè)，帶正電氨基酸41個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為28.46。

圖2 FtLAC-1和FtLAC-2蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved domains of gene-encoded proteins of FtLAC-1 and FtLAC-2

對(duì)疏水/親水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖 3，F(xiàn)tLAC-1和FtLAC-2平均親水性分別為-0.030和-0.121，可知這2個(gè)氨基酸序列編碼蛋白均為親水性蛋白。

圖3 苦蕎漆酶親疏水性分析Fig.3 Analysis of hydrophobicity of laccase proteins

2.2.2 漆酶蛋白結(jié)構(gòu)分析 利用SOPMA在線對(duì)苦蕎漆酶蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，表明FtLAC-1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占15.07%、無(wú)規(guī)則卷曲占50.89%、延伸鏈占27.48%和β-轉(zhuǎn)角占6.56%；FtLAC-2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由12.68%的α-螺旋、6.34%的β-轉(zhuǎn)角、52.29%的無(wú)規(guī)則卷曲和28.70%的延伸鏈構(gòu)成。利用SWISS-MODEL對(duì)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，可能的構(gòu)型如圖4所示。

圖4 苦蕎漆酶蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The prediction of tertiary structural model of laccase proteins

2.2.3 漆酶蛋白同源比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析 在NCBI中對(duì)FtLAC-1和FtLAC-2進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示2個(gè)氨基酸序列相似性并不高。經(jīng)BLAST序列分析得到FtLAC-1與橡膠樹(shù)Hevea brasiliensis（Willd.ex A.Juss.）Muell.Arg.（XP 021662642.1）和阿月渾子Pistacia vera L.（XP 031276156.1）的序列一致性分別高達(dá)82.62%和80.72%，F(xiàn)tLAC-2與甜菜亞種Beta vulgaris subsp.vulgaris（XP 010685719.1）和林煙草 Nicotiana sylvestris Speg.（XP 009796024.1）序列一致性分別為72.17%和72.06%。選取BLAST比對(duì)一致性較高的序列與之進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 漆酶氨基酸序列比對(duì)Fig.5 Amino acid sequence alignment of different plant laccase proteins

為了分析苦蕎漆酶蛋白基因FtLAC-1和FtLAC-2的親緣進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA 6.0對(duì)苦蕎漆酶基因編碼的氨基酸序列同來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中其他植物漆酶氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果如圖6所示，從進(jìn)化樹(shù)中可以看出FtLAC-1和FtLAC-2分別與不同植物分為兩大類，F(xiàn)tLAC-2與甜菜單獨(dú)聚在一個(gè)小分支，說(shuō)明二者具有較近的親緣關(guān)系；FtLAC-1與擬南芥AtLAC4聚在一大簇，F(xiàn)tLAC-2與擬南芥AtLAC17聚在一大簇，已有研究[6-7]證實(shí)擬南芥AtLAC4和AtLAC17參與木質(zhì)素合成，推測(cè)FtLAC-1和FtLAC-2基因也可能參與木質(zhì)素的合成。

圖6 不同植物漆酶蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree analysis of laccase proteins from different species

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）表達(dá)分析

應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)分析FtLAC-1和FtLAC-2基因在厚果殼和薄果殼苦蕎不同組織器官的表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖7。從不同組織器官來(lái)看，漆酶基因FtLAC-1和FtLAC-2在苦蕎不同組織的表達(dá)量不同，在厚果殼與薄果殼苦蕎中均表現(xiàn)為在種子中的表達(dá)量高于其他組織器官，推測(cè)材料選取時(shí)期正處于苦蕎果實(shí)生長(zhǎng)膨大期，相關(guān)基因活躍，表達(dá)量較其他部位高。FtLAC-1在厚果殼苦蕎果殼中的表達(dá)量約是薄果殼的9倍，在厚果殼苦蕎花的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于薄果殼；FtLAC-2在苦蕎厚、薄果殼中表達(dá)量基本一樣，但在厚果殼苦蕎莖、花和葉中的表達(dá)量高于薄果殼苦蕎?？傮w來(lái)看，F(xiàn)tLAC-1和FtLAC-2基因在厚果殼苦蕎不同組織器官的表達(dá)量均高于薄果殼苦蕎。

圖7 FtLAC-1和FtLAC-2基因在各器官的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression of FtLAC-1 and FtLAC-2 genes in various organs

3 討論

隨著我國(guó)“三高”人數(shù)越來(lái)越多，苦蕎顯著的藥理作用及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值引來(lái)食品和藥品等行業(yè)越來(lái)越多的關(guān)注，所以開(kāi)展易于加工且高產(chǎn)質(zhì)優(yōu)的薄果殼苦蕎品種選育研究是醫(yī)療保健行業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和加工企業(yè)的共同需求[16]。

吳朝昕[12]研究發(fā)現(xiàn)薄殼苦蕎果殼纖維素和木質(zhì)素含量顯著低于厚殼苦蕎。本課題組前期研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素合成途徑基因大多在薄果殼苦蕎的表達(dá)量低于厚果殼，為了深入驗(yàn)證苦蕎薄果殼形成的分子機(jī)制，本試驗(yàn)運(yùn)用RT-PCR技術(shù)從云蕎1號(hào)和小米蕎的不同發(fā)育時(shí)期混合材料中成功克隆獲得2條苦蕎漆酶基因FtLAC-1和FtLAC-2，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度分別為1695和1800bp，編碼564和568個(gè)氨基酸，經(jīng)預(yù)測(cè)2個(gè)蛋白均為親水性蛋白，此外，苦蕎漆酶蛋白FtLAC-1和FtLAC-2都具有3個(gè)典型的銅區(qū)保守域Cu-oxidase-3、Cu-oxidase和Cu-oxidase-2，表明其與其他植物漆酶蛋白具有相似的功能。但2個(gè)蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)特征存在差異，2個(gè)基因序列不具有較高相似性，其氨基酸序列同源性低。

研究[17]表明，植物漆酶參與調(diào)控單體聚合，在木質(zhì)部或正在木質(zhì)化的組織中表達(dá)量高，參與調(diào)控木質(zhì)素的積累過(guò)程。陳亮[18]研究發(fā)現(xiàn)，在丹參中過(guò)表達(dá)漆酶基因促進(jìn)發(fā)根的生長(zhǎng)，使得根系加粗，用顯微鏡觀察丹參發(fā)根的橫截面，看到木質(zhì)部范圍變大，染色后凱式帶的紫色加深，說(shuō)明漆酶加強(qiáng)了其木質(zhì)化程度。漆酶基因在高等植物木質(zhì)素合成中起著重要作用，其表達(dá)差異也會(huì)引起植物木質(zhì)化結(jié)構(gòu)表現(xiàn)差異。有研究[19-23]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)漆酶表達(dá)受到抑制時(shí)會(huì)減少木質(zhì)素的積累，而木質(zhì)素含量降低會(huì)影響植物木質(zhì)化結(jié)構(gòu)的表達(dá)，例如果核的殘核和軟核，利用該表達(dá)特點(diǎn)可進(jìn)一步研究漆酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制。本研究采用qRT-PCR技術(shù)分析基因表達(dá)模式，結(jié)果顯示FtLAC-1和FtLAC-2在厚、薄果殼型苦蕎不同組織器官中表達(dá)量不同，其中在種子的表達(dá)量最高。FtLAC-1和FtLAC-2在厚果殼苦蕎不同組織器官的表達(dá)量均高于薄果殼苦蕎，推測(cè)厚果殼木質(zhì)素積累多與漆酶基因的高表達(dá)有一定的關(guān)系。經(jīng)課題組前期轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析，薄果殼苦蕎中與木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)的大部分基因表達(dá)下調(diào)，且在厚果殼中的表達(dá)量高于薄果殼苦蕎，與本研究漆酶基因表達(dá)趨勢(shì)相同，但有研究[24-25]發(fā)現(xiàn)在軟籽石榴種皮的硬度發(fā)育中，漆酶基因會(huì)促進(jìn)木質(zhì)素合成積累，可以推斷漆酶基因與苦蕎果殼木質(zhì)素合成代謝有緊密聯(lián)系。但FtLAC-1和FtLAC-2基因在果殼不同組織器官表達(dá)模式不同，其在果殼木質(zhì)素合成和積累中的具體功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

從苦蕎中克隆出2條漆酶基因FtLAC-1和FtLAC-2，生物信息學(xué)分析結(jié)果推測(cè)二者具有其他植物漆酶蛋白相似功能。qRT-PCR基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)tLAC-1和FtLAC-2在厚果殼苦蕎中的表達(dá)量高于薄果殼苦蕎，推測(cè)其在薄果殼苦蕎中低表達(dá)與薄果殼的木質(zhì)素合成積累低有關(guān)，但具體功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。