王玉嬌,李彥芹,張汝美,蔡高占,趙秀新,顧祥國,李俊婷,姚文龍,李建斌*,仲躋峰*
(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所,濟南 250100;2.山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司,濟南 250108;3.寧波市牛奶集團有限公司,浙江 寧波 315033;4.寧波市鄞州瞻岐鷹山牛場,浙江 寧波 315145)
自由馬丁(freemartinism)綜合征是異性雙胎牛性器官發(fā)育紊亂疾病,主要表現(xiàn)為母牛生殖器官發(fā)育不全、雄性化或不育等特征,其主要機制是雙胎胚胎早期的尿膜絨毛膜血管之間有吻合支,雄性胎兒分泌的雄性激素會通過吻合支進入雌性胎兒體內(nèi),抑制雌性生殖器官的發(fā)育。異性雙胎對公牛生殖能力的影響尚不確定,然而確有造成生殖能力下降的報道。牛雙胎時多達97%胎兒會發(fā)生尿膜絨毛膜血管吻合。荷斯坦牛雙胎率大約為5%,個別牛群可達10%甚至更高。而且牛的雙胎率可能會越來越高,自然會造成自由馬丁發(fā)生率的增加。
自由馬丁初步診斷一般是基于小母牛生殖道的臨床檢查,以及是否來自雙胎或多胎等信息。而確診需要進行遺傳學檢查,即確定細胞中是否存在XX/XY嵌合體。細胞遺傳學和分子技術可以應用于自由馬丁診斷,一般染色體分析是最常見的方法。細胞遺傳學鑒定常用的方法包括吉姆薩染色法、染色體分帶或性染色體探針熒光原位雜交法等。分子技術主要包括PCR、qPCR或性染色體連鎖微衛(wèi)星標記分型法等。細胞遺傳學分析可以精準確定XX和XY細胞比例,但費時費力,而且整個程序涉及無菌采集血液樣本、迅速(約24 h內(nèi))運到實驗室、白細胞培養(yǎng)(48 h或72 h內(nèi))、專業(yè)人員進行分析等。Y連鎖基因的PCR方法比較容易,但不能檢測細胞中XX比例較小的XX/XY嵌合體;而且需要增加輔助研究,如其他組織(毛囊、唾液)中微衛(wèi)星標記的分析等。
微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是第三代PCR,為檢測XX/XY嵌合體提供了新的可能性。該方法利用有限稀釋和泊松分布可以實現(xiàn)樣品中目標核酸的精確定量。ddPCR是一種終點測量方法,可克服傳統(tǒng)PCR不能檢測低豐度核酸的局限性,并且不需要標準曲線實現(xiàn)目標核心的直接精確絕對定量,法醫(yī)上已經(jīng)應用于對混合遺傳特征和人類臨床嵌合現(xiàn)象的研究,在動物上已用于檢測豬白細胞嵌合體。建立快速準確的自由馬丁綜合征診斷方法對牛的繁育生產(chǎn)有著非常重要的意義。試驗對中國荷斯坦母牛的異性孿生母犢進行ddPCR檢測,現(xiàn)報道如下。
13~15月齡中國荷斯坦母牛7頭,來源于山東省某牛場。母牛個體發(fā)育與同群其他個體沒有明顯差異,因為配種5次以上未孕,進行了直腸檢查,發(fā)現(xiàn)存在子宮小、單子宮角等子宮發(fā)育不全特征。經(jīng)與技術人員溝通,這些母??赡苁钱愋噪p胎中的母犢。為鑒定是否為自由馬丁綜合征,每頭牛尾靜脈采集外周血10 mL于抗凝管中,-20℃保存,備用。
血液基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;ddPCRSupermix for Probes、微滴生成油,Bio-Rad公司產(chǎn)品。
離心機(型號為iCEN-24R),杭州奧盛儀器有限公司;分光光度計(型號為NanoDrop 8000 Micro),賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;QX200數(shù)字PCR儀、PX1熱封儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品。以上試劑和儀器均來源于山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所實驗室。
使用血液基因組DNA提取試劑盒嚴格按照說明書步驟提取DNA,用分光光度計測定提取后的DNA濃度,保證DNA濃度在10 ng/μL以上。
哺乳動物中AMEL基因定位于性染色體上,該基因在不同性染色體中存在獨立進化的特征,AMEL基因在X染色體(AMEL-X)和Y染色體(AMELY)以不完全一致的形式存在,AMEL基因這一特性非常適合作為X和Y染色體區(qū)分的靶標基因。通過ddPCR技術鑒定AMEL-X和AMEL-Y基因拷貝數(shù)估算X和Y染色體的拷貝數(shù)。參考相關文獻及NCBI的引物序列,設計ddPCR的靶標基因引物和探針。序列如下:AMEL-X正向引物,5′-CATGCAGCCCTTGCA-3′;AMEL-X 反 向 引 物,5′-ATATCGGAGGCAGAGGT-3′;AMEL-Y正向引物,5′-ACCAACCCCTGCAG-3′;AMEL-Y反向引物,5′-TGCATGGGGAATATTGGAG-3′;AMEL-X 探針 (HEX),HEX -CAGCCCTTGCCGC-BHQ1;AMEL-Y探針(FAM),F(xiàn)AM-CAGCGCTTGCCACCBHQ1。
1)將ddPCRSupermix for Probes(No dUTP)在室溫下融解,上下顛倒混勻,12 000 r/min離心2 min。
2)配制ddPCR Reaction Mix,反應體系見表1。
表1 dd PCR反應體系Tab.1 dd PCR reaction system
3)配好的反應體系振蕩混勻,12 000 r/min離心2 min后,小心地轉移到微滴發(fā)生卡中間一排的樣品孔內(nèi),并在下排孔中加入70μL微滴發(fā)生油,然后在微滴生成儀中生成微滴。
4)將生成好微滴的樣品40μL從微滴發(fā)生卡的上排孔中轉移到ddPCR專用孔板中,蓋上鋁膜后用PX1熱封儀對孔板進行封膜。
5)PCR反應條件見表2。
表2 PCR反應條件Tab.2 PCR reaction conditions
6)PCR結束后,將孔板取出,在微滴讀取儀上進行微滴讀取。
7)微滴讀取結束后,在Bio-Rad QuantaSoft軟件上分析數(shù)據(jù)結果。
測定AMEL-X的一維液滴分布、AMEL-Y的一維液滴分布及AMEL-X和AMEL-Y基因拷貝數(shù),并計算AMEL-Y/AMEL-X。
本試驗為單通道試驗,在只加入AMEL-X探針樣本測定時使用通道2(見圖1),只加入AMEL-Y探針樣本時使用通道1(見圖2)。圖1中綠色的是陽性液滴,含有可擴增模板(AMEL-X片段)的液滴;灰色的是陰性液滴,不含有可擴增模板的液滴。陽性液滴為6 876,陰性液滴為107 249,其中A05、C05、D05、E05、F05、B06、C06為只加入AMEL-X探針的樣本1~7。圖2中藍色的是陽性液滴,含有可擴增模板(AMEL-Y片段)的液滴;灰色的為陰性液滴,不含有可擴增模板的液滴。陽性液滴為3 253,陰性液滴為106 866,其中A07、C07、D07、E07、F07、F06、G06為只加入AMEL-Y探針的樣本1~7。圖1和圖2中的陰性液滴和陽性液滴明顯分成兩簇,表明試驗結果良好。根據(jù)陰性液滴和陽性液滴的比例可以得出ddPCR反應中可擴增模板的拷貝數(shù),見圖3。測得樣本1~7的AMEL-X和AMEL-Y的基因拷貝 數(shù) 分 別 為147 copies/μL 和62 copies/μL,99 copies/μL和22.3 copies/μL,60.4 copies/μL和17.8 copies/μL,27.3 copies/μL和24.6 copies/μL,97 copies/μL和71.9 copies/μL,65.2 copies/μL和34.8 copies/μL,36.6 copies/μL和17.9 copies/μL。根據(jù)ddPCR測定的濃度推算出原樣本的基因濃度見表3。計算得出這7個原樣本中AMEL-X拷貝數(shù)濃度范圍為273 ~1 470 copies/μL,AMEL-Y拷貝數(shù)濃度范圍為178 ~719 copies/μL;以此計算,得出AMEL-Y基因濃度與AMEL-X基因濃度的比例范圍為0.23~0.90。這說明試驗檢測的7頭母牛血液樣本中均含有Y染色體,為XX/XY嵌合體,可以判定為異性孿生母犢不孕的個體。該結果與母牛直腸檢查結果一致。
表3 ddPCR定量結果Tab.3 ddPCR quantitative results
圖1 AMEL-X的一維液滴分布圖Fig.1 One-dimensional droplet distribution map of AMEL-X
圖2 AMEL-Y的一維液滴分布圖Fig.2 One-dimensional droplet distribution map of AMEL-Y
圖3 AMEL-X和AMEL-Y基因拷貝數(shù)Fig.3 AMEL-X and AMEL-Y gene copy numbers
一般情況下,異性孿生母牛在性成熟前與正常個體發(fā)育相似,但在性成熟后表現(xiàn)與正常母牛不同,體型和公牛相似,頭和角都變得粗大,哞叫聲也像公牛,性情粗暴,乳房極不發(fā)達,子宮和卵巢發(fā)育不全,但如果不仔細觀察很難發(fā)現(xiàn)。尤其在大型規(guī)?;翀龈y發(fā)現(xiàn),只有到配種時發(fā)現(xiàn)屢配不孕,進一步檢查時方能檢查。
先前有研究者對異性孿生母犢不孕個體中的染色體進行研究,發(fā)現(xiàn)異性孿生母犢的染色體有XX、XXY、XY等組型,正常母犢個體的染色體應該為XX組型,因此在孿生母牛樣本中檢測到Y染色體就可以判定為異性孿生不孕個體。也有研究表明,XX/XY嵌合體的公牛睪丸發(fā)育不全。
基于時間和成本及檢測準確度、靈敏度方面的考慮,ddPCR技術是一個有效的檢測XX/XY嵌合體的方法。ddPCR檢測嵌合體的方法曾應用于豬等動物。ddPCR是第三代PCR技術,是一種終點測量方法,無需使用標準曲線即可進行定量,通過與X和Y染色體相關聯(lián)的基因可以對染色體拷貝數(shù)進行定量。在哺乳動物中高度保守的AMEL基因恰好滿足這個要求,AMEL基因在X和Y染色體上均表達但并不完全一致,AMEL基因已用于綿羊、水牛等多種哺乳動物的性別鑒定。
I.Szczerbal等為了評判ddPCR在檢測牛XX/XY染色體嵌合方面的特異性,按比例稀釋雌性(XX)DNA與雄性(XY)DNA混合樣本,利用ddPCR進行檢測,結果表明,ddPCR可以檢測到XX(98%)/XY(2%)到XX(4%)/XY(96%)比例的混合樣本。證明ddPCR技術在檢測牛XX/XY染色體嵌合方面可以達到較高的準確性,并且檢測結果與細胞遺傳學檢測結果相符。本試驗中,基因濃度的比例范圍為0.23~0.90。
在本試驗中,選擇ddPCR方法對7頭中國荷斯坦異性孿生雙胎的母牛外周血進行鑒定,并根據(jù)異性孿生母犢不孕的個體染色體為XX/XY嵌合、正常母牛染色體為XX來判定是否為嵌合體。結果表明,此7個樣本均存在XX/XY染色體嵌合,均為異性孿生不孕母犢。