核酸擴(kuò)增技術(shù)在食品快檢中的應(yīng)用進(jìn)展

杜思

摘 要：核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)，是基于分子生物技術(shù)檢測食源性病源體最常用的方法之一。該技術(shù)通過檢測特定的靶DNA序列來檢測食物中的單一細(xì)菌病原體，能夠?qū)⑻囟ò袠?biāo)放大十億倍以上，因此在許多應(yīng)用中發(fā)揮了重要作用，包括檢測各種病源體和基因克隆。本文就不同核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測食源性病原菌的原理和應(yīng)用進(jìn)行了分類綜述。

關(guān)鍵詞：核酸擴(kuò)增技術(shù);快檢技術(shù);食品

Application Progress of Nucleic Acid Amplification Technology in Food Rapid Detection

DU Si

（Wuhan Product Quality Supervision and Inspection Institute， Wuhan 430000， China）

Abstract： Nucleic acid amplification is a technique for amplifying specific pieces of DNA， which is one of the most commonly used methods for detecting foodborne pathogens based on molecular biotechnology. It can detect single bacterial pathogens in food by detecting specific target DNA sequences. Because of its ability to amplify specific targets by more than a billion times， it plays an important role in many applications， including the detection of various pathogens and gene clones. In this paper， the principles and applications of different nucleic acid amplification techniques for the detection of foodborne pathogens are reviewed.

Keywords： nucleic acid amplification techniques; rapid detection; food

食源性病源微生物引起的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生，部分商家對肉類成分摻假讓消費(fèi)者蒙受損失。因此，如何提高食品病源性微生物檢測、摻假檢測和轉(zhuǎn)基因成分檢測的速度和效率，是監(jiān)管部門和食品檢驗(yàn)員關(guān)心的重點(diǎn)問題。

自DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型被提出，對生物的研究就進(jìn)入到了分子水平。Kary Mullis提出并發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），使得微量DNA模板在體外大幅增加成為現(xiàn)實(shí)。熒光染料和Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了新的發(fā)展。為了操作簡便，同時(shí)提高檢測特異性和檢測效率，利用不同DNA聚合酶在恒定溫度下反應(yīng)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)被提出，現(xiàn)已有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）、滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification，RCA）技術(shù)和重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）等多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)被應(yīng)用于食品檢測領(lǐng)域。本文就不同核酸擴(kuò)增技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 變溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

變溫核酸擴(kuò)增技術(shù)會(huì)經(jīng)過高溫變性、低溫退火和適溫延伸3個(gè)步驟，一般是指PCR技術(shù)及其衍生技術(shù)。變溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)減短了檢測時(shí)間，提高了檢測靈敏度和檢測特異性。通過對一般PCR技術(shù)的改進(jìn)和PCR技術(shù)結(jié)合其他技術(shù)，得到了很多新的檢測方法體系，這些檢測方法具有檢測速度更快，檢測精度更高等優(yōu)點(diǎn)，可區(qū)分活死菌和同時(shí)檢測多種病原菌等。

1.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Applied Biosystems在1996年提出了實(shí)時(shí)定量PCR，該技術(shù)通過使用熒光染料或者熒光探針對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，可實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程。不飽和DNA雙鏈染料SYBR Green Ⅰ由C.T.Wittwer報(bào)道使用，是目前使用最廣的標(biāo)志性熒光染料。但SYBR Green Ⅰ對PCR反應(yīng)體系存在一定抑制作用。除了常見的SYBR Green Ⅰ外，邵曉青等[1]發(fā)現(xiàn)飽和雙鏈熒光染料LC Green PLUS和EvaGreen，對PCR沒有抑制作用且樣品間定量均一性和異常復(fù)孔出現(xiàn)率均優(yōu)于SYBR Green Ⅰ。包海燕等[2]使用EvaGreen染料建立基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的蠟樣芽孢桿菌快檢技術(shù)，對混檢的8株蠟樣芽孢桿菌全部檢出不受干擾，對人工污染的飼料樣品增菌18～20 h

后，檢測限可達(dá)10 CFU/mL。熒光標(biāo)記探針（TaqMan）是一種雙標(biāo)記的水解探針，5’末端帶有熒光基團(tuán)，3’末端帶有猝滅基團(tuán)，具有高特異性和高靈敏度，且對擴(kuò)增反應(yīng)不存在抑制。高正琴[3]建立了TaqMan-MGB雙重探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測空腸彎曲菌辦法，最低檢測限可達(dá)4 CFU/mL，且穩(wěn)定性和重復(fù)性良好;應(yīng)用該方法從78例標(biāo)本中檢出28例，而普通PCR僅檢出6例。楊瑤等[4]以豬細(xì)胞CACA為目的基因，建立了Taq-Man實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測辦法，可準(zhǔn)確檢測豬DNA含量低至0.1%的DNA樣品，豬肉含量低至5.0%（w/w）的肉制品，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤25%。魏婉晴等[5]基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測試劑盒結(jié)合疊氮溴化丙錠對活死菌的選擇性構(gòu)建了大腸桿菌O157：H7活菌定量檢測技術(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對菌液稀釋檢測，最低檢測限為84 CFU/mL;將4種常見病原菌基因混檢能夠準(zhǔn)確抗干擾檢出大腸桿菌O157：H7;對人工污染樣品檢測可檢測到初始污染量為7.79 CFU/mL。

1.2 微滴數(shù)字PCR

微滴PCR被稱為第三代PCR技術(shù)，其利用油包水乳液體系將一份檢測樣品分為20 000個(gè)納升級(jí)微滴，理論狀況下，每個(gè)獨(dú)立的微滴含有一個(gè)或不含待檢樣品目標(biāo)基因，且每個(gè)微滴為一個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)體系。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，通過對每個(gè)微滴的熒光信號(hào)進(jìn)行分析檢測，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和陽性微滴比例以絕對定量的方式直接給出靶基因的個(gè)數(shù)。微滴PCR各個(gè)反應(yīng)體系在相同的反應(yīng)條件下平行擴(kuò)增，消除了PCR反應(yīng)中不同引物和不同產(chǎn)物之間的相互雜交和競爭抑制;不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，不依賴擴(kuò)增曲線的Ct值，不需要內(nèi)參基因，具有高通量靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。趙麗青等[6]針對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的hlyA基因建立ddPCR檢測方法，檢測限可達(dá)90 CFU/mL。對人工污染肉制品檢測，最低可檢出20 CFU/mL單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。趙新等[7]通過ddPCR技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’的外源基因插入拷貝數(shù)，結(jié)果顯示外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因組上的插入拷貝數(shù)均值為0.99和1.01，此方法體系檢測時(shí)間僅需6～8 h，對DNA需求量僅為200 ng。

管錦繡等[8]通過優(yōu)化RT-ddPCR的退火溫度，對稀釋后的GⅡ型諾如病毒RNA進(jìn)行檢測，檢測靈敏度為5.40 copies/μL，高于RT-qPCR。在對人工污染的西生菜檢測中，RT-ddPCR最低檢測為54.00 copies/μL，且重復(fù)性好。翁文川等[9]通過結(jié)合PMA（疊氮溴化丙錠）活細(xì)胞熒光染料技術(shù)和ddPCR技術(shù)，對副溶血性弧菌不同活菌比例的菌液進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PMA-ddPCR可在活菌比例大于1%時(shí)測定活菌濃度，檢測靈敏度為2 CFU/mL;在對人工污染的樣品檢測時(shí)，污染樣品基圍蝦檢測靈敏度為1.12×101 CFU/g，污染樣品帆立貝檢測靈敏度為8.96 CFU/g，均低于PMA-qPCR檢測限，在低濃度污染量樣品的檢測中具有更大優(yōu)勢。

2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程始終維持在恒定溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物達(dá)到快速擴(kuò)增核酸的目的。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有快速、高效、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)不需要專用的設(shè)備，且操作簡單，適用于對檢測速度要求高的檢測場合，同時(shí)對于基礎(chǔ)薄弱的基層檢測部門具有易普及的優(yōu)點(diǎn)。常見的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（RCA）、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（LMAP）、重組聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)（RPA）以及交叉引物擴(kuò)增技術(shù)（Cross Priming Amplification，CPA）等。相比變溫技術(shù)PCR，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于其運(yùn)用的酶的多樣性，各個(gè)技術(shù)的擴(kuò)增原理千差萬別，不同技術(shù)使用的最佳反應(yīng)溫度各不相同。

2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是由Notomi等開發(fā)提出，恒定的溫度（61～65 ℃）下，在具有高鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）作用下，進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。LAMP技術(shù)針對靶基因上的6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)6對引物：正向內(nèi)引物、反向內(nèi)引物和外引物。相比于普通PCR兩對引物，特異性極高，且反應(yīng)溫度恒定僅需要一個(gè)水浴鍋即可完成。在反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，DNA不斷合成，生成大量白色的焦磷酸鎂沉淀，因此通過肉眼觀察白色沉淀是否產(chǎn)生即可判斷擴(kuò)增與否，不需要煩瑣的電泳和紫外觀察;或者在反應(yīng)產(chǎn)物中混入熒光染料（SYBR Green Ⅰ），擴(kuò)增發(fā)生則反應(yīng)體系為綠色，未發(fā)生則為橙色。胡仲皓等[10]針對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的保守基因actA設(shè)計(jì)引物，利用熒光染料（SYBR Green Ⅰ）作為反應(yīng)指示劑，對多種病原菌混檢，僅檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，檢測下限為4.7×101 CFU/mL。王冠蕾[11]利用PMA抑制死菌DNA擴(kuò)增的特點(diǎn)，結(jié)合PMA和LAMP技術(shù)，向反應(yīng)體系中加入羥基萘酚藍(lán)（HNB）對嬰兒配方奶粉中的沙門氏菌活菌進(jìn)行可視化快檢，結(jié)果表明對純培養(yǎng)物稀釋檢測靈敏度為4.6×101 CFU/mL，對人工污染樣品的檢測靈敏度為6.3×101 CFU/mL，且檢測時(shí)間不超過90 min。

2.2 重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在37 ℃下，5～20 min即可完成檢測，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，甚至可以直接利用人的體溫進(jìn)行檢測，適用于現(xiàn)場檢測。此技術(shù)模仿T4噬菌體內(nèi)的核酸復(fù)制機(jī)制，依賴重組酶uvsX和單鏈結(jié)合蛋白Gp32在體外恒溫條件下即可實(shí)現(xiàn)DNA模板的特異性識(shí)別和結(jié)合，再通過鏈置換DNA聚合酶Bsu實(shí)現(xiàn)模板DNA的擴(kuò)增。周樹青等[12]利用RPA檢測試劑盒建立GⅡ型諾如病毒快速檢測體系。對不同諾如病毒、星狀病毒、MS2噬菌體、人輪狀病毒和人腺病毒基因組混檢，結(jié)果表明該方法特異性良好且檢測下限為106 copies/μL，對人工污染陽性樣品進(jìn)行檢測，均可檢出且穩(wěn)定性良好。吳華華等[13]針對金黃色葡萄球菌的nuc基因的保守序列，設(shè)計(jì)RPA特異性引物，可在37 ℃孵育35 min檢測金黃色葡萄球菌，特異性極強(qiáng)，該方法對金黃色葡萄球菌的純培養(yǎng)物和人工污染樣品的最低檢出限均為10 CFU/mL。謝實(shí)龍等[14]利用RPA技術(shù)對轉(zhuǎn)基因大豆MON 89788建立了實(shí)時(shí)熒光RPA檢測體系，該方法絕對檢測限可達(dá)40拷貝，相對檢測限為0.05%，在39 ℃下僅需10 min可完成對實(shí)際樣品的檢測。

3 結(jié)語

食品安全問題受到人們的關(guān)注，因此對食品安全檢測的要求也在不斷提高。核酸擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展日新月異，不同技術(shù)具有不同的特點(diǎn)。除了本文提到的核酸擴(kuò)增技術(shù)外，核酸擴(kuò)增技術(shù)和其他技術(shù)的結(jié)合有以下幾種。例如，免疫捕獲PCR可適用于病原菌的富集和分離，以減少前增菌的時(shí)間進(jìn)一步縮短檢測時(shí)間;報(bào)告噬菌體法改造噬菌體結(jié)合報(bào)告基因，改造后的噬菌體侵入細(xì)菌釋放DNA，檢測過程可以區(qū)分活死菌。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，食品快檢技術(shù)也會(huì)隨之更新完善，對食品的檢測會(huì)變得更加快速、便捷和準(zhǔn)確。

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