酶催化橡膠籽油基富含亞麻酸的OPL型結構酯

姚書一 滿佳妮 黃書鋮

摘 要：本文對無溶劑體系中的1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞麻酸甘油三酯（1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol，OPL）型結構酯的轉酯化合成工藝進行了研究及優(yōu)化，對以三棕櫚酸甘油三酯（Tripalmintin，PPP）為原料制備OPL結構酯的方式進行了實驗室探究。結果表明，OPL的最佳合成工藝為PPP與橡膠籽油脂肪酸按摩爾比為1∶7混合，PPP的質量為Novozym?的10.0%，以40086脂肪酶為催化劑，在55 ℃和200 r/min的搖臺下反應12 h。在此最優(yōu)條件下，OPL的產率達到了42.35%。

關鍵詞：人乳脂替代品;OPL結構酯;轉酯化反應

Enzyme Catalyzed Rubber Seed Oil-based OPL-Type Structural Ester Rich in Linolenic Acid

YAO Shuyi， MAN Jiani， HUANG Shucheng

（Beijing University of Chemical Technology， Beijing 102200， China）

Abstract： This paper studies and optimizes the transesterification synthesis process of 1-oleic acid-2-palmitate-3-linolate type 1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol （OPL） in a solvent-free system. The production method of OPL structural ester produced from Tripalmintin （PPP） was explored. The results show that the optimal synthesis process of OPL is as follows： PPP is mixed with rubber seed oil fatty acids at a molar ratio of 1：7， with PPP?mass 10.0% Novozym? 40086 lipase as catalyst and reacted in 55℃， 200 r/min shaker for 12 h. Under this optimal condition， the yield of OPL reached 42.35%.

Keywords： human milk fat substitute; OPL structural ester; transesterification reaction

母乳中富含抗體，可以促進嬰兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育，其中乳脂肪能夠為嬰幼兒提供大量易于消化吸收的營養(yǎng)成分以及能量，這是傳統(tǒng)的動物脂肪（如牛羊肉乳脂）和植物脂肪（如棕櫚油和胡麻油等）無法提供的。在胰脂肪酶的催化下，動植物脂肪酸與鈣離子結合生成不易消化的飽和脂肪酸鈣，使硬度上升，營養(yǎng)損失，益生菌的生長繁殖被抑制，造成便秘。但由于個人、社會等多方面的影響，導致我國的母乳喂養(yǎng)率較低，市場對嬰幼兒配方乳粉的需求量極大[1]。通過對母乳的分析發(fā)現，母乳脂肪的脂肪酸有大量脂肪以1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（1，3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol，OPO）的結構存在。OPO型結構酯在消化時不會產生難以消化吸收的飽和脂肪酸鈣，有利于嬰幼兒吸收營養(yǎng)。因此，OPO結構酯是目前國內外市面上常見的高端嬰幼兒奶粉的營養(yǎng)添加劑成分之一。但是，由于中國母體膳食結構原因，母乳中亞油酸含量較高，且導致亞油酸/亞麻酸較高，高于推薦值。現有母乳脂肪替代品（OPO）的不飽和脂肪酸組成和中國母乳的不飽和脂肪酸組成存在一定差異，因此需要開發(fā)一種更適合中國嬰幼兒食用的奶粉營養(yǎng)強化劑。筆者認為1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞麻酸甘油三酯（1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol，OPL）更適合作為中國嬰幼兒食用奶粉的營養(yǎng)強化劑，以代替OPO型結構酯。對比了解多種動植物原料中的成分后，發(fā)現橡膠籽油較為適合作為OPL型結構酯的合成原料[2]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

硫酸，98% AR;碳酸氫鈉，AR;氫氧化鉀，AR;乙醇，95% CP;Novozym?435，1 000 PLU/g，Novozymes;Novozym? 40086，275 IUN/g，Novozymes;Lipozym TL IM，250 IUN/g，Novozymes;Candida sp.99-125，38 KLU/g;正己烷，AR;無水硫酸鈉，AR;氯化鈉，AR。

1.2 實驗方法

1.2.1 測定酶類型對酯轉換過程的影響

產酶菌株和固定化方法不同，脂肪酶活性、底物選擇和最佳反應條件存在很大差異，因此選擇合適的脂肪酶在酯轉換化制備OPL過程中非常重要。選擇Novozym?435，Lipozyme TL IM，Novozym? 40086和Candida sp.99-125作為轉酯化酶，分別研究了不同類型的脂肪酶對轉酯化反應的影響。以PPP∶橡膠籽油脂肪酸=1∶7為底物，添加PPP質量10%的脂肪酶，在55 ℃，200 r/min的條件下，在搖床設備上催化反應24 h。通過測量甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）的含量來比較轉化速度的快慢。

1.2.2 溫度對脂肪酶活性有決定性的影響

一般情況下，當溫度適當升高時，酶催化反應的活性會增加，但溫度過高會導致酶蛋白的不可逆變性和生物活性的喪失。因此，研究實驗過程中的最適溫度也是研究的熱點之一。以45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃為溫度變量，在Novozym? 40086的基礎上，振蕩反應24 h，每4 h用氣相色譜法測定一次樣品中各組分的表征[4]。

1.2.3 脂肪酶添加量對水解反應的影響

在反應過程中，脂肪酶先通過活性位點與底物結合形成中間復合物。當脂肪酶的用量達到一定濃度時，其對反應的積極作用逐漸減弱[5]。同時，過多的脂肪酶會增加生產成本。因此，不同脂肪酶對轉酯化程度的影響也是生產過程中考量的重要因素之一。本實驗在前期實驗條件的基礎上，繼續(xù)研究同種催化脂肪酶Novozym? 40086在不同的用量條件下（3%、5%、10%和15%）對轉酯生產OPL結構酯的影響。

1.3 油脂酸價的測定

PPP樣品油的酸值按GB 5009.229—2016[3]進行測定。取少量油樣，準確稱量，加入20 mL中性乙醇醚（1∶1）溶液，用超聲波機溶解樣品，加入2滴酚酞，得到待測溶液。用預先校準的氫氧化鉀乙醇溶液滴定，濃度約為0.1 mol/L，當溶液開始出現粉紅色停止滴定，按下式計算油的酸值：

式中：Av為樣品酸價，mg/g;56.11為KOH的摩爾質量，單位mg/mmol;C為氫氧化鉀-乙醇溶液濃度，mol/L;V為氫氧化鉀-乙醇溶液消耗體積，mL;m為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 測定酶類型對酯轉換過程的影響分析

由圖1知，各脂肪酶的初始產率均較高，但隨著反應過程的進行，脂肪酶的催化效率逐漸降低，12 h后反應體系中不同TAG的含量趨于平衡。Lipozyme? TL IM和Novozym? 40086的催化反應率和OPL產率（36.300%和37.540%）均高于Candida sp.99-125與Novozym? 435脂肪酶（30.585%和34.545%）。然而，如表1所示，使用Lipozyme TL IM的體系中，總甘油酯（Glycerin Ester，GLE）的比例遠低于使用Novozym? 40086的體系中TAG的比例。這意味著使用Novozym? 40086的體系中TAG的水解量遠遠低于Lipozyme? TL IM，因此本實驗選用Novozym? 40086作為催化脂肪酶。

2.2 溫度對水解反應的影響

由圖2可知，反應在初始階段，反應速率隨著溫度的升高而快速上升。在55 ℃環(huán)境下，反應平衡時（即反應12 h后）產量為39.31%，而在60 ℃下，平衡時僅為35.62%，可推斷出脂肪酶在過高的溫度下發(fā)生了部分失活。雖然產量仍然比45 ℃、20 ℃高，但是綜合考慮生產成本條件和酶的可持續(xù)使用特點，得出在55 ℃時條件最適宜。

2.3 脂肪酶添加量對水解反應的影響

由圖3可知，不考慮脂肪酶Novozym? 40086用量比為3%時的反應測定，不同脂肪酶添加量下的催化效果在12 h后達到平衡。

在水平對比劑量下，反應速率隨脂肪酶用量的增加而增加，平衡時反應產率也呈正增加。但當脂肪酶含量從PPP的10%增加到15%時，反應速率沒有顯著增加，最終產物中OPL的產率為43.17%，與10%的產率（42.35%）相近。因此，綜合考慮OPL產量和生產成本，選擇10%的PPP酶劑量是最合適的。

3 結論

本文從橡膠籽中提取出OPL結構酯運用到高端的乳粉中，研究了不同酶、不同溫度下、不同反應途徑下，如何高效地提取出OPL結構酯。實驗結果表明，富含亞麻酸、亞油酸的橡膠籽油脂肪酸作為原料可以高效產出OPL結構酯，并有效防止Sn-2棕櫚酸的轉移。以橡膠籽油中的脂肪酸為基礎，研究了轉酯化制備OPL結構酯的生產過程，PPP∶橡膠籽油=1∶7（摩爾比），加入10 wt%（以PPP質量計）的Novozym? 40086脂肪酶，脫水處理，在55 ℃下，200 r/min反應12 h，可以實現OPL產率為42.35%。 符合國家的標準，使生產技術日后用于大量生產OPL結構酯成為可能。

參考文獻

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[2]Srivastava A，Akoh C C，Chang S W，et al.Candida rugosar lipase LIP1-catalyzed transesterification to produce human milk fat substitute[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（14）：5175-5181.

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[5]Wei W， Feng Y F， Zhang X，et al.Synthesis of structured lipid 1，3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol in both solvent and solvent-free system[J].LWT - Food Science and Technology，2015，60（2 ）：1187-1194.