南美白對(duì)蝦肝胰腺蛋白提取方法優(yōu)化及無(wú)水?；瞽h(huán)境脅迫對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白的影響

鄭曉嫻 吳嘉鑫 徐德峰 孫力軍 王雅玲 秦小明 范秀萍

摘 要：為提高Western Blotting結(jié)果的可靠性，以蛋白溶出率和凝膠電泳蛋白條帶完整性為指標(biāo)，比較提取液種類、研磨方式、酶抑制劑種類及其體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺蛋白提取效果的影響。采用優(yōu)化后的提取方法獲得高質(zhì)量蛋白樣品，并采用Western Blotting法分析無(wú)水環(huán)境脅迫后南美白對(duì)蝦肝胰腺組織中細(xì)胞凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明：RIPA裂解液作為提取溶劑所得的蛋白溶出率高于水提和磷酸鹽緩沖液，電動(dòng)勻漿和液氮研磨所得蛋白條帶更完整，4%蛋白酶磷酸酶混合抑制劑能有效抑制肝胰腺內(nèi)源酶引起的蛋白降解;采用Western Blotting法分析無(wú)水?；钇陂g南美白對(duì)蝦肝胰腺蛋白，發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)休眠的同時(shí)會(huì)引起細(xì)胞輕微凋亡，且凋亡水平呈應(yīng)激時(shí)間依賴性增加，環(huán)境脅迫解除后有所回調(diào)。

關(guān)鍵詞：南美白對(duì)蝦;肝胰腺;蛋白提取;?；钸\(yùn)輸;細(xì)胞凋亡

Optimization of Protein Extraction from Hepatopancreas of Litopenaeus vannamei and Effect of Environmental Stress during Waterless Transportation on Apoptosis-Related Proteins

ZHENG Xiaoxian1， WU Jiaxin1， XU Defeng1，2，*， SUN Lijun1， WANG Yaling1， QIN Xiaoming1， FAN Xiuping1

（1.Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Food， Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety， College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China;

2.Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， China）

Abstract： In the present study， in order to improve the reliability of Western blotting results， the effects of extraction buffers， grinding methods， inhibitor type and concentration， and extraction time on protein extraction from the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei were explored by considering protein dissolution rate and the completeness of protein bands in electrophoretic gels. Next， the expression levels of apoptosis-related proteins in the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei were detected with Western blotting. The results showed that the protein dissolution rate was higher using RIPA lysis buffer compared with phosphate buffer saline （PBS） or water as the extraction solvent. Electric homogenization and liquid nitrogen grinding provided more complete protein bands. The degradation of proteins by endogenous proteases was obviously suppressed by addition of 4% protease and phosphatase inhibitor cocktail. In addition， Western blotting results revealed that in addition to inducing Litopenaeus vannamei into dormancy， low temperatures induced slight apoptosis in the hepatopancreas tissue. Furthermore， the apoptosis level increased with waterless duration and this effect was alleviated after removal of environmental stress.

Keywords： Litopenaeus vannamei; hepatopancreas; protein extraction; live transportation; apoptosis

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220315-018

中圖分類號(hào)：TS254.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2022）06-0009-07FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

引文格式：

鄭曉嫻， 吳嘉鑫， 徐德峰， 等. 南美白對(duì)蝦肝胰腺蛋白提取方法優(yōu)化及無(wú)水?；瞽h(huán)境脅迫對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白的影響[J].

肉類研究， 2022， 36（6）： 9-15. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220315-018.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHENG Xiaoxian， WU Jiaxin， XU Defeng， et al. Optimization of protein extraction from hepatopancreas of Litopenaeus vannamei and effect of environmental stress during waterless transportation on apoptosis-related proteins[J]. Meat Research， 2022， 36（6）： 9-15. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220315-018.? ? http：//www.rlyj.net.cn

南美白對(duì)蝦是我國(guó)沿海地區(qū)最受歡迎的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，其養(yǎng)殖產(chǎn)量位居我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖首位[1]。近年來(lái)，隨著南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖面積及養(yǎng)殖產(chǎn)量的不斷攀升以及消費(fèi)者對(duì)水產(chǎn)品品質(zhì)要求的提高，人們更青睞于消費(fèi)鮮活水產(chǎn)品，因而帶動(dòng)了水產(chǎn)品活體運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展[2-3]。

在低溫?zé)o水?；钸\(yùn)輸過(guò)程中，南美白對(duì)蝦易受到低溫、缺氧、空氣暴露及機(jī)械振動(dòng)等環(huán)境因素的影響，引起一系列生理應(yīng)激[4]。當(dāng)對(duì)蝦處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，機(jī)體通過(guò)細(xì)胞凋亡來(lái)清除損傷細(xì)胞，而細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡，分為線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡和死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡[5-6]。在機(jī)體響應(yīng)外界環(huán)境脅迫時(shí)，促凋亡B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族中的Bax蛋白被激活并遷移到線粒體外膜，降低線粒體膜電位，使線粒體膜通透性增加，而細(xì)胞色素C被釋放到胞質(zhì)中，促進(jìn)凋亡小體的形成，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡;同時(shí)Caspase家族中的啟動(dòng)者（Caspase-9蛋白）和執(zhí)行者（Caspase-3蛋白）被連續(xù)激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。此外，Caspase-3的活化會(huì)進(jìn)一步水解胞內(nèi)蛋白，引起細(xì)胞骨架分子降解，導(dǎo)致肌肉軟化及持水性下降，影響食用口感，對(duì)水產(chǎn)品?；钸\(yùn)輸業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。因此，明確細(xì)胞凋亡規(guī)律及其機(jī)制對(duì)提升水產(chǎn)動(dòng)物?；钯|(zhì)量具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

肝胰腺作為甲殼類動(dòng)物生理代謝的重要器官之一，擔(dān)負(fù)著消化酶的分泌、生理調(diào)節(jié)、防御及造血等功能，是響應(yīng)外界環(huán)境脅迫的關(guān)鍵器官[10-12]，因此可以作為評(píng)價(jià)?；盍魍ㄟ^(guò)程細(xì)胞凋亡水平的靶組織。此外，蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的功能執(zhí)行者，在機(jī)體應(yīng)答環(huán)境生物或非生物脅迫、調(diào)控內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡、維持個(gè)體存活等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。楊明等[13]研究低氧脅迫期間日本沼蝦鰓、肝胰腺及肌肉組織中抗氧化酶活力變化，發(fā)現(xiàn)與其他組織相比，肝胰腺抗氧化酶活力變化更明顯。本課題組前期研究證明，無(wú)水?；盍魍ㄟ^(guò)程中南美白對(duì)蝦應(yīng)答急冷和無(wú)水暴露雙重脅迫時(shí)肝胰腺氧化與免疫防御、生理代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)均發(fā)生了顯著變化，且肝胰腺組織超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的結(jié)構(gòu)損傷[14-16]，提示肝胰腺蛋白特異性變化可作為判斷機(jī)體早期生理功能變化的輔助指標(biāo)，而獲取高質(zhì)量肝胰腺蛋白樣品是后續(xù)蛋白分析的前提。

但對(duì)蝦肝胰腺組織柔軟、水分含量高、富含絲氨酸蛋白酶等內(nèi)源性蛋白酶[17-21]，因此研磨時(shí)內(nèi)源性蛋白酶的溶出會(huì)造成蛋白質(zhì)快速降解。前期實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)典的組織/細(xì)胞蛋白提取法在對(duì)蝦肝胰腺蛋白提取過(guò)程中存在提取不充分和提取過(guò)程快速降解的典型問(wèn)題[22-23]，而適用于對(duì)蝦肝胰腺蛋白的高質(zhì)量提取方法鮮見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。為此，本研究針對(duì)肝胰腺蛋白提取過(guò)程中可能誘發(fā)組織蛋白降解的典型環(huán)境和操作因子，以蛋白溶出率和蛋白完整性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，依次考察提取液種類、研磨方式、抑制劑種類及其體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)肝胰腺蛋白提取效果的影響，旨在優(yōu)化南美白對(duì)蝦肝胰腺蛋白提取方法，為后續(xù)在蛋白質(zhì)水平上解析機(jī)體應(yīng)答環(huán)境脅迫的生理調(diào)控機(jī)制提供高質(zhì)量蛋白樣品。并在此基礎(chǔ)上，采用Western Blot方法研究對(duì)蝦在無(wú)水?；盍魍ㄟ^(guò)程中的凋亡進(jìn)展規(guī)律，為靶向提升對(duì)蝦存活質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對(duì)蝦購(gòu)于廣東省湛江市霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)。將鮮活的南美白對(duì)蝦充氧?；钸\(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，之后迅速放入1 m3新鮮海水中暫養(yǎng)12 h，水溫（23±1） ℃，pH 7.69±0.50，增氧泵連續(xù)曝氧，期間不投放餌料。

挑選大小、顏色均一、無(wú)機(jī)械性損傷且狀態(tài)良好的對(duì)蝦進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、考馬斯亮藍(lán)染色液、考馬斯亮藍(lán)脫色液、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)公司;BCA蛋白定量分析試劑盒、預(yù)染蛋白Marker 美國(guó)Thermo Scientific公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrohoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒 陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司;Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9單克隆抗體 美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3-30KS高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;Varioskan Flash全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)、Mini-PROTEAN Tetra垂直電泳系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司;塑料周轉(zhuǎn)箱（490 mm×345 mm×285 mm） 東莞市茶山中距塑膠卡板廠。FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

1.3 方法

1.3.1 南美白對(duì)蝦肝胰腺蛋白提取流程

參照Luo Zhizhan等[24]方法，選用暫養(yǎng)12 h的南美白對(duì)蝦進(jìn)行肝胰腺蛋白提取方法優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。稱取200 mg研磨均勻的對(duì)蝦肝胰腺組織，加入1 mL含酶抑制劑的提取液后置于冰上提取一段時(shí)間，期間多次振蕩混勻。取出后于4 ℃、14 000 r/min離心15 min，去除上層懸浮液和下層沉淀，收集澄清液即肝胰腺蛋白提取液，于-20 ℃冰箱中短暫保存。

肝胰腺蛋白提取的主要影響因素為提取液種類（水、RIPA裂解液和PBS）、研磨方式（研缽研磨、電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿、液氮研磨）、酶抑制劑種類及其體積分?jǐn)?shù)（PMSF：0.5%、1.0%、2.0%;蛋白酶磷酸酶混合抑制劑：2%、4%、6%）、提取時(shí)間（30、60、120、180 min），

以蛋白溶出率和SDS-PAGE蛋白條帶完整性為指標(biāo)，依次考察上述4 個(gè)因素對(duì)肝胰腺蛋白提取效果的影響，確定南美白對(duì)蝦肝胰腺蛋白提取的最佳工藝參數(shù)。

本研究使用的蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物為50×的儲(chǔ)備液商品，使用時(shí)按照需求分別以體積比1∶50、2∶50、3∶50加入裂解液中，體積分?jǐn)?shù)分別為2%、4%和6%。同樣，所使用的PMSF為100×的儲(chǔ)備液，按照需求以不同比例加入裂解液中。

1.3.2 南美白對(duì)蝦肝胰腺蛋白溶出率測(cè)定

參照代佳和等[25]的方法，采用BCA法測(cè)定不同處理?xiàng)l件下肝胰腺蛋白的溶出量，以牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.001 3x+0.176 3（R2=0.997），其中y為蛋白質(zhì)量濃度，x為吸光度。按式（1）計(jì)算肝胰腺蛋白溶出率。

（1）

式中：ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）;V為待測(cè)溶液體積/mL;n為待測(cè)體積稀釋倍數(shù);m為肝胰腺樣品質(zhì)量/g。

1.3.3 蛋白完整性分析

參照許倩倩等[26]方法，對(duì)肝胰腺蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。將上述提取的肝胰腺總蛋白與上樣緩沖液混合后于沸水浴中變性5 min，每個(gè)泳道蛋白上樣量為200 ?g，上樣體積20 ?L，80 V電泳30 min后，120 V繼續(xù)電泳至結(jié)束。將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)染色液中搖床染色2 h，回收考馬斯亮藍(lán)染色液，加入脫色液脫色至背景透明后進(jìn)行凝膠電泳成像。

1.3.4 南美白對(duì)蝦分組及處理

預(yù)先準(zhǔn)備3 個(gè)塑料周轉(zhuǎn)箱，并連續(xù)編號(hào)。按照本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[27]，將暫養(yǎng)12 h后的南美白對(duì)蝦分為3 組，每組120 條，其中1 組放入含有新鮮海水的1號(hào)箱中作為正常對(duì)照（normal control，NC）組，其余2 組分別放入含有（12±1） ℃海水的2號(hào)和3號(hào)箱中低溫誘導(dǎo)休眠。觀察對(duì)蝦的活動(dòng)狀態(tài)，至側(cè)倒、腹肢無(wú)明顯擺動(dòng)、觸及反應(yīng)微弱后撈出，2號(hào)箱中對(duì)蝦為急性冷應(yīng)激（acute cold，AC）組。3號(hào)箱中對(duì)蝦分裝于塑料密封袋中，每袋10 只，共12 袋，排出袋內(nèi)空氣后充氧密封，放入12 ℃層析柜中模擬無(wú)水?；钸\(yùn)輸（waterless duration，WD）。

將?；?、6、9 h，及?；? h后放入常溫海水中復(fù)蘇（recover，R）2 h的對(duì)蝦分別記為WD3h、WD6h、WD9h、WD9h+R組。

1.3.5 肝胰腺中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定

采用優(yōu)化后的蛋白提取方法，分別提取NC組、AC組、WD3h組、WD6h組、WD9h組及WD9h+R組對(duì)蝦肝胰腺蛋白。按照Luo Zhizhan等[24]的方法，采用Western Blot法檢測(cè)肝胰腺中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。BCA試劑盒測(cè)定各組的蛋白質(zhì)量濃度后取等量蛋白樣品上樣，SDS-PAGE分離蛋白組分，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，7 g/100 mL脫脂牛乳封閉，TBST緩沖液洗膜。然后加入一抗（Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3），4 ℃孵育過(guò)夜，并回收對(duì)應(yīng)的一抗;之后加入二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，ECL顯色，最后將目標(biāo)條帶放入發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)照相，采用Image J軟件進(jìn)行條帶的灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參，定量分析目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。各目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量按式（2）計(jì)算。

（2）

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 25軟件進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)分析，其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用GraphPad Prism 8和Power Point軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 南美白對(duì)蝦肝胰腺蛋白提取方法優(yōu)化

2.1.1 提取液種類對(duì)肝胰腺蛋白提取效果的影響

目前，常用于組織蛋白提取的方法有PBS提取法、三氯乙酸/丙酮沉淀法、裂解液提取法等[28]，其中PBS提取法和裂解液提取法在甲殼類動(dòng)物肝胰腺蛋白的提取中多有報(bào)道[29-32]。本實(shí)驗(yàn)以水作為對(duì)照，采用PBS和RIPA裂解液分別提取對(duì)蝦肝胰腺中的蛋白。

小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。圖3～5同。

由圖2可知，RIPA裂解液提取所得的蛋白溶出率最高，為（54.63±0.67）%，而PBS組與對(duì)照組（水）之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同提取液提取所得的蛋白經(jīng)電泳染色后結(jié)果如圖2B所示，與PBS相比，RIPA裂解液提取所得的蛋白條帶更清晰，在60～130 kDa處條帶更清晰、數(shù)量更多。RIPA裂解液更利于組織中蛋白的釋放，蛋白總體提取效果優(yōu)于PBS組。因此確定肝胰腺蛋白最佳提取液為RIPA裂解液。

2.1.2 研磨方式對(duì)肝胰腺蛋白提取效果的影響FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

目前，動(dòng)物組織研磨破碎的方法主要有超聲破碎法、玻璃珠勻漿法、機(jī)械研磨法和液氮研磨法等[26]，可進(jìn)一步將其分為勻漿法和研磨法兩大類。采用電動(dòng)勻漿機(jī)和液氮研磨提取動(dòng)物組織蛋白已多有報(bào)道[28，33-34]。因此，本研究以研缽研磨為對(duì)照，選取較有代表性的電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿和液氮研磨2 種方法進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。

由圖3可知，電動(dòng)勻漿法所得的蛋白溶出率最高，達(dá)到（63.82±0.62）%，與液氮研磨的蛋白溶出率有極顯著差異，可能是因?yàn)殡妱?dòng)勻漿機(jī)是將肝胰腺組織勻漿成液態(tài)，使樣品與裂解液充分接觸，更利于蛋白的溶出。電動(dòng)勻漿法和液氮研磨法在40 kDa以上的蛋白完整性明顯優(yōu)于研缽研磨。其中液氮研磨法所得的蛋白在55 kDa和70～100 kDa處的清晰度和條帶數(shù)量略高于電動(dòng)勻漿法，可能是因?yàn)橐旱某蜏貙⒔M織迅速凍結(jié)，保護(hù)蛋白不被破壞或降解，但二者差異并不明顯。根據(jù)上述結(jié)果，確定肝胰腺蛋白最佳研磨方式為電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿法。

2.1.3 抑制劑種類及其體積分?jǐn)?shù)對(duì)肝胰腺蛋白提取效果的影響

溫度的回升會(huì)激活對(duì)蝦肝胰腺中的內(nèi)源酶，極易造成蛋白質(zhì)的降解和去修飾，影響后續(xù)蛋白的檢測(cè)[35]。因此，低溫環(huán)境和添加酶抑制劑是抑制蛋白酶活性的主要措施。PMSF是一種絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑，是組織蛋白提取過(guò)程常用的蛋白酶典型抑制劑。蛋白酶磷酸酶混合抑制劑（以下分析簡(jiǎn)稱為混合抑制劑）包含廣譜的絲氨酸、半胱氨酸和酸性蛋白酶等抑制劑。

由圖4可知，與PMSF組相比，混合抑制劑組的蛋白溶出率和蛋白完整性明顯更優(yōu)，其中以體積分?jǐn)?shù)4%混合抑制劑組的蛋白溶出率最高，可達(dá)（62.39±0.76）%，但其蛋白條帶與6%混合抑制劑組無(wú)差異，同時(shí)2%混合抑制劑組在35～60 kDa處的蛋白條帶清晰度略差，提示蛋白可能發(fā)生降解。因此確定肝胰腺蛋白最佳抑制劑為體積分?jǐn)?shù)4%混合抑制劑。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)肝胰腺蛋白提取效果的影響

由圖5可知，提取時(shí)間延長(zhǎng)有利于肝胰腺蛋白的溶出。當(dāng)冰上提取時(shí)間達(dá)120 min時(shí)蛋白溶出率達(dá)到最大，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，蛋白溶出率略有下降但變化不顯著。不同提取時(shí)間所得的蛋白條帶之間無(wú)明顯差異，且蛋白完整、豐度較高。除此之外，樣品的貯藏條件對(duì)肝胰腺蛋白的提取也有一定的影響。前期實(shí)驗(yàn)分別提取當(dāng)天和低溫放置一段時(shí)間后的蛋白樣品，發(fā)現(xiàn)蛋白樣品放置的時(shí)間越長(zhǎng)，貯藏溫度越高，其蛋白降解程度越大，蛋白豐度顯著降低，該結(jié)果再一次表明對(duì)蝦肝胰腺組織的獨(dú)特性。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)，推測(cè)繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間可能會(huì)降低蛋白溶出率，誘發(fā)肝胰腺中蛋白酶激活進(jìn)而導(dǎo)致蛋白降解。因此，出于對(duì)蛋白溶出率和蛋白完整性的綜合考慮，確定肝胰腺蛋白最佳提取時(shí)間為120 min。同時(shí)應(yīng)盡可能保持全程環(huán)境低溫，使用新鮮的肝胰腺，且蛋白提取后應(yīng)盡快完成后續(xù)測(cè)定。

2.2 低溫?zé)o水?；钇陂g南美白對(duì)蝦細(xì)胞凋亡信號(hào)通路

蛋白表達(dá)水平變化

A.免疫印跡圖;B～F. Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)水平;與NC組相比，*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001，****. P<0.000 1。

采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)線粒體凋亡信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的主要蛋白（Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9）。由圖6可知，與NC組相比，低溫誘導(dǎo)休眠（AC組）使Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)

（P<0.000 1），Bcl-2蛋白的表達(dá)水平有所上調(diào)但不顯著。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中的重要一員，可與促凋亡蛋白（如Bax）結(jié)合，抑制細(xì)胞凋亡，在抗凋亡過(guò)程中起積極作用[36]。AC組Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的變化說(shuō)明在單一的低溫脅迫過(guò)程中，對(duì)蝦受到冷應(yīng)激，激活凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者Caspase-3，并通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)抑制凋亡信號(hào)通路活化。AC組的凋亡指數(shù)（Bax/Bcl-2）并未明顯變化，可能是由于低溫誘導(dǎo)休眠階段的時(shí)間較短，并不足以徹底激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。在WD組中，Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平及凋亡指數(shù)不斷升高，WD6h組達(dá)到峰值后有所下降，說(shuō)明對(duì)蝦在無(wú)水?；钇陂g由于低溫及空氣暴露等多種脅迫，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路已被完全激活，WD9h組對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的減弱可能源于機(jī)體的抗氧化及免疫防疫系統(tǒng)的充分激活。環(huán)境脅迫解除后Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2均恢復(fù)到正常水平。與NC組相比，WD9h+R組Bcl-2蛋白的表達(dá)水平有所回升但未能恢復(fù)至正常水平，可能源于環(huán)境脅迫后Bcl-2與Bax之間的結(jié)合被解離，Bcl-2被迅速降解，顯著降低了Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。

環(huán)境脅迫造成的氧化應(yīng)激是觸發(fā)機(jī)體細(xì)胞凋亡的主要誘因，生物體在應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)積累過(guò)量的氧自由基，引起多不飽和脂肪酸等生物大分子發(fā)生過(guò)氧化，產(chǎn)生丙二醛（malondialdehyde，MDA），其含量通常用來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體的氧化損傷程度[37]。黎一鳴等[38]利用TUNEL法分析肝細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞MDA含量與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)。細(xì)胞凋亡水平除了可以側(cè)面反映生物體的

氧化應(yīng)激水平，還能反映細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷程度。團(tuán)隊(duì)前期研究[11-12，15]發(fā)現(xiàn)，南美白對(duì)蝦在受到AC+WD脅迫時(shí)，肝胰腺組織中的MDA含量顯著升高，在?；? h達(dá)到最高值后隨著?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)有所下降，且肝胰腺組織的病理性損傷程度呈時(shí)間依賴性增大，而在AC組中未發(fā)現(xiàn)明顯異常，在急性冷應(yīng)激及無(wú)水脅迫的交互作用下，對(duì)蝦的氧化應(yīng)激及肝胰腺組織病理性損傷程度隨?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)而加劇，該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞凋亡水平具有相似的變化趨勢(shì)，提示細(xì)胞凋亡與機(jī)體應(yīng)激損傷及組織損傷密切相關(guān)。

3 結(jié) 論FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺蛋白提取方法進(jìn)行優(yōu)化后，得到最佳提取條件為RIPA裂解液、電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿、4%蛋白酶磷酸酶混合抑制劑、提取60 min，在此條件下提取得到的肝胰腺蛋白溶出率可達(dá)（74.83±1.67）%，經(jīng)SDS-PAGE分離，蛋白條帶清晰、完整。蛋白免疫分析進(jìn)一步表明，肝胰腺中凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平在短時(shí)間低溫脅迫誘導(dǎo)下顯著上調(diào)，復(fù)蘇后凋亡減輕，提示細(xì)胞凋亡信號(hào)通路介導(dǎo)了對(duì)蝦?；盍魍ㄟ^(guò)程中環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的機(jī)體傷殘或死亡。

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收稿日期：2022-03-15

基金項(xiàng)目：“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2019YFD0901601）;國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31772048）;

廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2021KJ149）;廣東海洋大學(xué)研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目（202261）

第一作者簡(jiǎn)介：鄭曉嫻（1997—）（ORCID： 0000-0003-4748-8691），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閷?duì)蝦保活流通應(yīng)激損傷

機(jī)制與調(diào)控。E-mail： zhengxiaoxianzzz@163.com

*通信作者簡(jiǎn)介：徐德峰（1978—）（ORCID： 0000-0003-1218-5359），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品保鮮?；蠲笇W(xué)

機(jī)制與海洋資源高值化利用。E-mail： 13827198525@163.comFE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE