大米中三種香蘭素的GC-MS分析方法

劉莉，周相娟*，鐘麗君

國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心（北京 100094）

香蘭素是一類人工合成的香精，通常分為甲基香蘭素和乙基香蘭素，具有香莢蘭香氣及濃郁的奶香，廣泛用于食品、飲料以及日化用品[1]。香蘭素及其衍生物甲基香蘭素和乙基香蘭素是香料工業(yè)中重要的品種，因具有增香、抑菌、抗氧化、醫(yī)藥中間體等作用，在食品、化妝品、飼料、醫(yī)藥等方面用途廣泛[2-4]。我國國標GB 2760—2014[5]中香蘭素是允許使用的食品用合成香料。但有研究指出，食用香蘭素含量過多的食品可能會對肝、腎、脾等臟器產(chǎn)生副作用，同時香蘭素含量過多會影響食品的口感，導(dǎo)致頭暈、惡心等不適癥狀[6]，因此食品中香蘭素的含量是評價食品安全的一個重要指標。

目前關(guān)于香蘭素和乙基香蘭素的測定方法主要有分光光度法[7-9]、電化學(xué)法[10-13]、高效液相色譜法[14-17]。鮮有文獻用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用對大米中甲基香蘭素、乙基香蘭素、香蘭素同時測定的報道。為了解香米中香料的添加情況，我們對大米中三種香蘭素含量進行研究，通過優(yōu)化前處理條件和色譜條件，實現(xiàn)了對大米中三種香蘭素的同時測定，為我國食品的質(zhì)量安全提供了一種靈敏、準確、快捷的檢測方法，對保障消費者權(quán)益和人體健康具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫6890A-5973氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）；Vortex-genie2漩渦振蕩器（美國Scientific Industries）；CH-30L超聲提取儀（北京國環(huán)高科自動化技術(shù)研究院）；5810R低溫離心機（美國Eppendorf 公司）。

標準品：香蘭素，甲基香蘭素，乙基香蘭素，純度均大于99.9%，北京振翔科技有限公司。乙酸乙酯：色譜純，美國Fisher公司。

1.2 樣品前處理

稱取1 g大米于50 mL離心管中，加入5 mL蒸餾水超聲提取30 min，取出后加入5 mL乙酸乙酯，渦旋震蕩30 min，以8 000 r/min低溫離心后取上清液上機進行測定。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）或性能相當者；載氣是高純氦氣，純度＞99.999%，載氣流速：1.0 mL/min，恒流模式；采用程序升溫：色譜柱初始溫度100 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min的速率升至220 ℃，最后在220 ℃保持4 min；再以40 ℃/min的速率升至250 ℃，保持8 min；進樣方式：不分流進樣：進樣體積1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度：280 ℃。離子源溫度230 ℃；溶劑延遲時間8 min；選擇離子檢測模式（SIM），具體見表1。

表1 三種化合物的保留時間和檢測離子

1.4 標準溶液的配制

用乙醇配成各組分質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標準使用液。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

目標化合物的有效提取是大米中甲基香蘭素、乙基香蘭素、香蘭素檢測的前提。稱取1 g樣品，研究比較了二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、乙腈的提取效果，結(jié)果如表2所示，乙酸乙酯和乙腈的提取效果差不多，但乙腈提取的基線噪音比較大，因此選用乙酸乙酯作為試驗的提取試劑。不同溶劑提取率見表2。

表2 不同溶劑對三種香蘭素的提取率 單位：%

稱取1 g樣品，研究比較了直接乙酸乙酯提取和水浸溶后乙酸乙酯提取兩種方法的提取效果。結(jié)果表明，兩種方法的提取回收率都可達到90%以上。由于水浸潤后的大米幾乎都有香蘭素檢出，因此選用陽性樣品進行不同加水量提取效率的比較分析。結(jié)果表明添加1，2，3，4和5 mL的水量，測定結(jié)果沒有顯著變化，水的添加僅能促進乙酸乙酯對大米中香蘭素的提取。

2.1.2 提取方式的優(yōu)化

我們比較了渦旋振蕩和超聲兩種方式對陽性樣品的提取效果。結(jié)果表明超聲提取效果明顯優(yōu)于渦旋振蕩。

比較了5，10，15，20和25 min不同超聲時間對三種化合物的提取效率。結(jié)果表明：隨著超聲時間的延長，乙酸乙酯對三種化合物的提取回收率增加，時間到達20 min以上時，提取效率未表現(xiàn)出明顯的變化，本研究最終確定超聲提取時間為25 min，以保證樣品充分提取。

2.2 色譜柱的選擇

試驗比較了HP-5、HP-1701和HP-INNOWAX三種不同極性毛細管色譜柱對香蘭素的響應(yīng)和分離度效果。結(jié)果表明，上述色譜柱對三種香蘭素都有響應(yīng)，但是響應(yīng)大小有差異：香蘭素在極性的HP-INNOWAX色譜柱中響應(yīng)最好。故研究選用HP-INNOWAX毛細管柱來進行分離。通過對色譜條件的進一步優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在HP-INNOWAX條件下，香蘭素與雜質(zhì)能有效分離且目標峰峰形良好，陽性樣品和標準溶液中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的色譜圖見下圖1和圖2。

圖1 陽性樣品的選擇離子流圖

圖2 三種香蘭素標準溶液的選擇離子流圖

2.3 方法的精密度與回收率

對6個品牌的大米樣品分別進行3次平行處理和分析檢測，對于香蘭素每個品牌都有檢出，范圍在78～210 μg/kg，而甲基香蘭素和乙基香蘭素均未有檢出。其檢測結(jié)果及相對標準偏差見表3。

表3 6個品牌大米的分析結(jié)果

準確稱取空白樣品18份，平均分為3組，分別定量加入20，100和200 μg/kg的香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的混合標準溶液，進行6次平行處理和分析檢測，樣品檢測結(jié)果及加標回收率見表4。從表4可以看出不同濃度的平均方法回收率在94.3%～99.6%，平均相對標準偏差在0.19%～3.03%（n=6）。

表4 方法回收率和精密度（n=6）

2.4 方法的檢出限

根據(jù)國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）對檢出限的定義，稀釋并檢測系列混合標準溶液，計算信噪比（S/N）。以S/N=3為檢出濃度，以S/N=10為最低定量濃度。向不含目標物質(zhì)的樣品中定量添加混合標準溶液，按前處理方法處理后，進行檢測，計算信噪比（S/N）。以S/N=3為檢出限，以S/N=10為定量下限。由此分別得到3種目標物的方法檢出限和定量限。按稱樣量為1.00 g，最終定容5 mL，方法中三種香蘭素的最低檢出質(zhì)量分數(shù)均為15 μg/kg，最低定量質(zhì)量分數(shù)均為50 μg/kg。香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的檢測限、定量限見表5。

表5 三種化合物的檢出限和定量限

2.5 方法的線性關(guān)系

標準系列工作液：分別準確吸取不同體積的混合標準儲備液（1 mg/mL），將其稀釋成香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素質(zhì)量濃度分別為10，20，40，100，200，400和1 000 μg/L的標準系列工作液。按濃度由低到高分別進樣1 μL，測定結(jié)果經(jīng)線性回歸，回歸方程（Y為峰面積，x為質(zhì)量濃度，μg/L）在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性均良好，香蘭素的線性方程為y=23.63x-50.01；r2=0.999 8。甲基香蘭素的線性方程為y=50.05x+605.2；r2=0.998 9乙基香蘭素的線性方程為y=44.54x+188.0；r2=0.999 9。

3 結(jié)論

方法通過對氣相色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，以及前處理方法的研究，建立了同時測定大米中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的檢測方法。運用該方法對市售30個批次大米中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素進行分析，得到了滿意的結(jié)果。相比于固相萃取方法操作繁瑣、耗時，無法滿足大批量樣品快速檢測的特點，本方法采用乙酸乙酯提取，超聲提取，快速、簡便和高效，試劑耗材用量少，能節(jié)約檢測成本，提高檢測效率。相比于液相色譜法、氣相色譜法，靈敏度更高，基質(zhì)干擾小，無需衍生化即可對三種常用香料進行同時測定，有效提高了檢測速度和檢測效率，為食品安全性監(jiān)管提供技術(shù)支撐。