乙腈萃取-氣相色譜法快速測定食用油中的3種抗氧化劑

周 玨，李云虹

（1.常熟市檢驗檢測中心，常熟市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇常熟 215500；2.蘇州大學(xué)，蘇州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院， 江蘇蘇州 215123）

食用油是生活中最常見的油脂，可為人體提供所需的能量和必需脂肪酸，能增強脂溶性維生素（A、D、E、K）的吸收和轉(zhuǎn)運[1]。當(dāng)食用油存儲時間過久時，會發(fā)生酸敗，導(dǎo)致無法食用。一般情況下，酸敗是油脂內(nèi)的脂肪酶催化所致的。食用油脂中，日常消費量最大的是植物油。植物類油脂的性質(zhì)不穩(wěn)定，主要與這類油脂中各類不飽和脂肪酸所含雙鍵有關(guān)。此外，植物油在受熱、光照等條件下會發(fā)生氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致油脂的口感下降，同時營養(yǎng)價值也明顯 降低[2]。

為了防止氧化酸敗，通常會在食用植物油中加入叔丁基羥基茴香醚（Butylated Hydroxyanisole，BHA）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-Di-tertbutyl-4-methylphenol，BHT）和 特 丁 基 對 苯 二 酚（Tertiary Butylhydroquinone，TBHQ）等抗氧化劑?？寡趸瘎┍扔椭菀籽趸?，結(jié)合容器中的氧而保護了油脂，其能與過氧化自由基結(jié)合生成穩(wěn)定的化合物，阻止連鎖反應(yīng)的傳播，延長誘導(dǎo)期[3]。

人工合成抗氧化劑的過量使用會對人體產(chǎn)生不利影響，如TBHQ對動物可能有致突變的作用，BHA和BHT有潛在致癌作用[4-8]。因此，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）對這3類抗氧劑均有限量要求。這3類抗氧化劑常用的檢測方法有比色法[9]、電分析法[10-11]、薄層色譜法[12]、化學(xué)發(fā)光法[13]、氣相色譜法[14-18]、氣相色譜-質(zhì)譜法[19-22]、液相色譜法[23-26]和液相色譜-質(zhì)譜法[27-28]。比色法雖然操作簡單，但精確度不高，達不到日常檢測精確度要求；電分析法分析多個合成抗氧化劑時存在伏安圖重疊峰，限制了其檢測范圍[29-30]；薄層色譜法大多穩(wěn)定性差，準(zhǔn)確度低；氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法前處理煩瑣且使用儀器昂貴，成本過高。氣相色譜法和液相色譜法成為定量檢測食用油中BHA、BHT和TBHQ最常用的分析方法?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測定》（GB 5009.32—2016）中的氣相色譜法（第四法）前處理用凝膠滲透色譜凈化，該處理法試劑損耗大，時間長，凈化效果一般，而且樣品回收率不高。本文探究當(dāng)樣品批數(shù)較多時，用溶劑進行快速提取的氣相色譜方法，探究提取過程中的關(guān)鍵影響因素和不同植物油的提取回收率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BHA（固體標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.6%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；BHT（固體標(biāo)準(zhǔn)品純度為100%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；TBHQ（固體標(biāo)準(zhǔn)品純度為98.0%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；乙腈（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；環(huán)己烷（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；乙酸乙酯（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；食用油樣品：均采集于超市。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890氣相色譜儀[≤0.5 ng/s（FID），安捷倫科技有限公司（美國）]；渦旋混合器（德國Heidolph公司）；氮吹儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）；TGL-16M冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

氣相色譜柱：毛細(xì)管柱HP-5（30 m×320 μm× 0.25 μm）；柱溫：起始溫度80 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min；載氣：氮氣，純度≥99.999%；流速1 mL/min；進樣口溫度：230 ℃；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣；檢測器：FID；檢測器溫度：250 ℃；空氣流速：300 mL/min；氫氣流速：30 mL/min；氮氣流速： 25 mL/min。

1.3.2 BHA、BHT、TBHQ混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取BHA、BHT、TBHQ各50 mg（精確至 0.1 mg），用環(huán)己烷-乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶劑定容至50 mL，配制成1 mg/mL的儲備液，吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL及1.00 mL于一組10 mL容量瓶中，用環(huán)己烷-乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶劑定容，此標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度為 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL及 100 μg/mL。

1.3.3 不同提取溶劑實驗

稱取均勻陰性玉米油樣品0.5000 g于50 mL離心管內(nèi)，添加1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，分別加入10.0 mL乙醇、10.0 mL甲醇、10.0 mL乙腈后放入漩渦混勻器中，以1500 r/min轉(zhuǎn)速混勻 2 min。然后放入冷凍離心機以4 ℃，6000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min。取上清液5 mL于10 mL離心管中，以50 ℃水浴加熱并氮吹至近干，用環(huán)己烷∶乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶劑定容至2 mL，樣品過濾紙（去除溶劑中剩余油脂）后進氣相色譜儀分析，每組實驗做兩組平行。

1.3.4 不同提取轉(zhuǎn)速實驗

稱取均勻陰性玉米油樣品0.5000 g于50 mL離心管內(nèi)，添加1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，加入10.0 mL乙腈后放入漩渦混勻器中，分別以 500 r/min、1000 r/min、1500 r/min和2000 r/min轉(zhuǎn)速混勻2 min。然后放入冷凍離心機以4 ℃、6000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min。取上清液5 mL于10 mL離心管中，以50 ℃水浴加熱并氮吹至近干，用環(huán)己烷∶乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶劑定容至2 mL，樣品過濾紙后進氣相色譜儀分析，每組實驗做兩組平行。

1.3.5 不同提取時長實驗

稱取均勻陰性玉米油樣品0.5000 g于50 mL離心管內(nèi)，添加1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，加入10.0 mL乙腈后放入漩渦混勻器中，以1500 r/min 轉(zhuǎn) 速 分 別 混 勻1 min、2 min、5 min、10 min和 20 min。然后放入冷凍離心機以4 ℃、6000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min。取上清液5 mL于10 mL離心管中，以50 ℃水浴加熱并氮吹至近干，用環(huán)己烷∶乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶劑定容至2 mL，樣品過濾紙后進氣相色譜儀分析，每組實驗做兩組平行。

1.3.6 不同食用油的回收率和精密度實驗

分別稱取玉米油、花生油、菜籽油和大豆油4種陰性樣品各0.5000 g，每種油類分別添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）0.04 mL、0.10 mL、0.30 mL后，各加入9.96 mL、9.90 mL、9.70 mL乙腈并放入漩渦混勻器中，以1500 r/min轉(zhuǎn)速混勻5 min。然后放入冷凍離心機以4 ℃、6000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min。取上清液5 mL于10 mL離心管中，以50 ℃水浴加熱并氮吹至近干，用環(huán)己烷∶乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶劑定容至2 mL，樣品過濾紙后進氣相色譜儀分析，每組實驗測定6次。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程和檢出限

按照實驗方法1.3.1和1.3.2對混合工作溶液進行測定，色譜圖見圖1。以BHA、BHT、TBHQ的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果表明，BHA、BHT、TBHQ的質(zhì)量濃度均在5～100 μg/mL與峰面積之間呈線性關(guān)系，并以3倍信噪比（S/N）計算方法檢出限，其測定的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表1。

圖1 3種抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

從表1中可知，BHA、BHT、TBHQ在質(zhì)量濃度為5～100 μg/mL，其相關(guān)系數(shù)R2達到0.9997以上，說明其質(zhì)量濃度和色譜峰面積呈較好的線性關(guān)系，且該濃度基本可覆蓋常規(guī)樣品檢測。檢出限為1.8～4.8 mg/kg，均低于國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.32—2016（第四法，氣相色譜法）中檢出限要求。

表1 線性參數(shù)和檢出限

2.2 提取溶劑的選擇

按照實驗1.3.3用不同溶劑對油脂樣品中的BHA、BHT和TBHQ進行提取，其回收率差異見圖2。由圖2可知，當(dāng)乙醇為提取溶劑時，3種抗氧化劑的回收率收率低于80%，特別是BHT的回收率更是低于70%；當(dāng)甲醇為提取溶劑時，BHA和TBHQ的回收率都在90%以上，但BHT的回收率低于80%；當(dāng)乙腈為提取溶劑時BHA、TBHQ的回收率都在93%以上，BHT的回收率到達80%，并且此時平行實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.0%以內(nèi)。綜上所述，選取乙腈為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對BHA、BHT和TBHQ的回收率影響

2.3 提取轉(zhuǎn)速的選擇

按照實驗1.3.4考察了不同提取轉(zhuǎn)速對玉米油中BHA、BHT和TBHQ的提取效率的影響，其回收率差異見圖3。由圖3可知，當(dāng)提取轉(zhuǎn)速在 500 r/min時，3種抗氧化劑的回收率都不高；當(dāng)轉(zhuǎn)速 從500 r/min提 高 到1500 r/min時，BHA、BHT及TBHQ的回收率顯著上升，TBHQ的回收率達到95%以上；當(dāng)轉(zhuǎn)速達到2000 r/min時，與轉(zhuǎn)速1500 r/min相比，3種抗氧化劑的回收率沒有顯著提高，而是達到相對穩(wěn)定狀態(tài)，該平行實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.5%以內(nèi)。根據(jù)實驗結(jié)果選取提取轉(zhuǎn)速為 1500 r/min。

圖3 不同提取轉(zhuǎn)速對BHA、BHT和TBHQ的回收率影響

2.4 提取時間的選擇

實驗1.3.5考察了不同提取時長對玉米油樣品中BHA、BHT和TBHQ的提取效率的影響，其回收率差異見圖4。由圖4可知，隨著提取時長由1 min增加到5 min，3種抗氧化劑的回收率也在不斷提高，當(dāng)提取時長為5 min時，BHA和TBHQ的回收率都達到95%以上，BHT也達到85%以上。此后，隨著提取時長的增加，3種抗氧化劑的回收率沒有顯著提高，達到相對穩(wěn)定的狀態(tài)，該實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差在3%以內(nèi)。因此，此實驗選取的提取時長為5 min。

圖4 不同提取時長對BHA、BHT和TBHQ的回收率影響

2.5 4種食用油的回收率和精密度結(jié)果

按照實驗1.3.6考察了用優(yōu)化后的提取方法對玉米油、花生油、菜籽油和大豆油這4種常見植物油的提取效率，其回收率和精密度結(jié)果如下表2。由表2可知，4種食用油中BHA和TBHQ的加標(biāo)量為 40 μg、100 μg和300 μg時，回 收 率 在95.0%～ 102.4%，不同加標(biāo)量的BHT回收率也基本達到85%以上，并且3種抗氧化劑的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差都在1.0%～2.9%。試驗結(jié)果表明，本方法具有較高的精確度和較好的準(zhǔn)確度，符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）。

表2 回收率和精密度實驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本實驗通過創(chuàng)建和優(yōu)化測定食用油中BHA、BHT、TBHQ的前處理方法，建立了一種快速、大量測定這3種抗氧化劑含量的乙腈萃取-氣相色譜方法。在5～100 μg/mL范圍內(nèi)，3種抗氧化劑具有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2達到0.9997以上，方法檢出限范圍為1.8～4.8 mg/kg。在3個不同濃度的添加水平下，平均回收率為85.0%～102.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～2.9%（n=6）。綜上可知，此處理方法較為簡單和快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠和穩(wěn)定，試劑消耗較少，具有較好的靈敏度和回收率，可適用于大批量快速檢測。其中BHT的回收率較BHA和TBHQ低，下一步可以嘗試對提取溶劑進行優(yōu)化來進一步改進該方法，以及用此方法來對其他抗氧化劑進行前處理探究[31]。