QuEChERS超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法 測定速凍調(diào)理肉制品中6種喹諾酮類藥物殘留量

李 毅，張玉潔

（1.山東省中準(zhǔn)檢測技術(shù)有限公司，山東威海 264209；2.威海市食品藥品檢驗檢測研究院，山東威海 264209）

隨著人們生活節(jié)奏的加快，生存壓力的增大，速凍調(diào)理肉制品以其方便快捷、簡單易操作的優(yōu)勢特點進入人們的餐桌并逐步占據(jù)主導(dǎo)。速凍調(diào)理肉制品是指以畜禽肉為主要原料，經(jīng)攪拌、調(diào)味等工藝加工而成的非即食類肉制品。

喹諾酮類抗生素作為廣譜抗菌藥物，廣泛用于革蘭陰性細菌感染的治療，由于價格低且藥效明顯而廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖[1]。喹諾酮類等獸藥的安全合理使用，可以降低畜禽發(fā)病率與死亡率，促進畜禽生長，但部分養(yǎng)殖戶過分追求經(jīng)濟利益、盲目加大用藥，導(dǎo)致藥物在畜禽體內(nèi)富集，人食用此類動物組織后，造成人體疾病或?qū)λ幬锂a(chǎn)生耐藥性，長期攝入可能引起食用者惡心、嘔吐、疼痛等胃腸道不適及腸道菌群失調(diào)[2]；也會引起頭痛、頭暈、睡眠不良等癥狀[3]；并有潛在的致癌、致畸、致突變風(fēng)險。因此，喹諾酮類藥物殘留問題越來越引起人們的關(guān)注。美國食品藥品監(jiān)督管理局于2005年宣布禁止用于治療家禽細菌感染的抗菌藥物恩諾沙星的銷售和使用。我國也在GB 31650—2019中規(guī)定環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星和洛美沙星等6種喹諾酮類藥物在動物肌肉組織中的最高殘留限量為10～500 μg/kg。

喹諾酮類藥物在動物組織中的殘留分析方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定法、高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法。傳統(tǒng)方法多采用液液萃取法或者固相萃取法，液液萃取法浪費溶劑，準(zhǔn)確度低，若提取溶劑中含有乙腈，旋蒸容易報廢且最終會有水分殘留，影響最終的定量分析結(jié)果；固相萃取法需要經(jīng)過活化、上樣、淋洗、洗脫和氮吹等諸多步驟，消耗時間太長，大批量檢測樣品時會降低工作效率。本方法基于QuEChERS原理，采用快速過濾柱對樣品提取液進行凈化。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈（CH3CN），色譜純，美國FISHER公司；甲酸（CH3COOH），色譜純，上海麥克林生化科技有限公司；恩諾沙星（Enrofloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；氧氟沙星（Ofloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；培氟沙星（Pefloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；諾氟沙星（Norfloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；洛美沙星（Lomefloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 3500液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配電噴霧離子源，美國AB SCIEX公司；SQP電子天平，美國Sartorius公司；超純水機，法國Millipore公司；移液槍，美國Sartorius公司；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司；渦旋混合器，德國IKA公司；色譜柱：Kinetex C18100 mm×2.1 mm×2.6 μm。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的速凍牛排樣品5.00 g置于50 mL離心管中，加入含5%甲酸的乙腈溶液 10 mL，渦旋混合，15 ℃超聲15 min。加入2 g氯化鈉，渦旋混合90 s，以轉(zhuǎn)速8 500 r/min，溫度2 ℃， 冷凍離心10 min，取1 mL上清液待凈化。將1 mL提取液轉(zhuǎn)移到ProElut QuE 2mL Tube，渦旋30 s，離心后取上清液，加水100 μL，渦旋混合，氮吹至近干，加乙腈-0.1%甲酸水（1∶9）定容至1 mL， 過0.22 μm微孔濾膜，進液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 分析。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。流動相：A 0.1%甲酸溶液，B 乙腈，梯度洗脫，見表1；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧（ESI）離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；電離電壓：3 000 V；源溫：100 ℃；霧化溫度：350 ℃；錐孔氣流速：25 L/h；霧化氣流速：450 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在參考GB/T 21312—2007[4]、農(nóng)業(yè)部1077號公告—1—2008[5]的基礎(chǔ)上，首先對質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，以離子豐度比較大且干擾較小為原則，選擇適合的子離子，同時以豐度值較大的子離子作為定量離子。采用多反應(yīng)監(jiān)測模式進行分析，表2為該方法獲得的最佳質(zhì)譜檢測參數(shù)，圖1為特征峰。

圖1 6種喹諾酮類特征峰

表2 定向離子對、定量離子對和碰撞能量

在優(yōu)化質(zhì)譜條件的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化了流動相比例，最終確定在正離子模式下，以乙腈和0.1%甲酸水為流動相，6種喹諾酮類藥物能夠在10 min內(nèi)實現(xiàn)色譜分離，且互不干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品各約100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/L的喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20 ℃保存，有效期3個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：取喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)貯備液各 1 mL于10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度均為100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取20 μL、50 μL、100 μL、200 μL和400 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動相稀釋至1 mL配制成濃度為2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL和40 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

將100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋至1.00 ng/mL、 2.50 ng/mL、5.00 ng/mL后依次添加至樣品中，按照上述實驗操作進行測定，以3倍信噪比計算檢出限，結(jié)果見表3。

表3 線性參數(shù)和檢出限

2.3 精密度

對實驗操作樣品進行了方法精密度試驗，用來保證實驗結(jié)果的重復(fù)性，用加標(biāo)濃度為5.00 ng/mL的喹諾酮類樣品，重復(fù)檢測6次，結(jié)果精密度如表4 所示。

表4 精密度試驗結(jié)果（n=6）

2.4 回收試驗

按照上述實驗步驟對速凍牛排制品進行了3個不同濃度（2.50 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL）的加標(biāo)回收試驗，計算出以下6種喹諾酮類藥物的回收率，結(jié)果見表5。

表5 加標(biāo)回收結(jié)果

3 結(jié)論

經(jīng)多次試驗驗證，本實驗采用的ProElut QuE 2 mL Tube快速凈化技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法成功解決了檢測大批量樣品喹諾酮時面對的時效長、準(zhǔn)確度低的問題，對速凍調(diào)理肉制品中喹諾酮類藥物殘留的測定具有重要意義。