自組裝多肽骨修復(fù)水凝膠的研究進(jìn)展

徐 柳，徐 姍，相堂永，沙政舟，張 鍵，陳志鵬

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023）

隨著高強(qiáng)度體育活動(dòng)的流行和人口老齡化加劇，我國每年因各種原因?qū)е碌墓莻颊哌_(dá)數(shù)百萬，尤其是60歲以上的老人，而骨質(zhì)疏松直接導(dǎo)致骨折率上升。另外，由于年齡的增加，骨折部位血管新生、淋巴循環(huán)以及祖細(xì)胞等機(jī)能降低，受損骨組織的自我修復(fù)功能受限，導(dǎo)致病程延長(zhǎng)［1］，患者長(zhǎng)期臥床極易導(dǎo)致褥瘡、肺部感染、尿路感染、四肢靜脈栓塞等并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生血栓脫落易導(dǎo)致腦梗塞、腦卒中、心肌梗死等致命性疾病，使得與骨創(chuàng)傷相關(guān)醫(yī)療和社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本急劇上升，給患者和社會(huì)帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。因而，尋找一種快速修復(fù)受損骨組織，縮短患者病程的治療策略具有重要的臨床和社會(huì)意義［2］。目前，臨床上骨缺損的治療主要包括：自體骨或異體骨移植［3］、支架固定［4］、陶瓷［5］、生物玻璃［6］、骨水泥［7］、脫礦骨基質(zhì)［8］、聚合物［9］填充等。但免疫排斥、感染等原因嚴(yán)重限制了移植在臨床上的應(yīng)用。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球能夠成功進(jìn)行移植手術(shù)的患者不到10%［10］。此外，陶瓷、生物玻璃和骨水泥等傳統(tǒng)生物材料由于缺乏成骨誘導(dǎo)性，其對(duì)骨再生的促進(jìn)作用也是有限的。因此，開發(fā)具有成骨誘導(dǎo)的生物材料是促進(jìn)骨再生的重要發(fā)展方向。凝膠遞送系統(tǒng)其多孔性和滲透性不僅可以用作空間填充劑以及生物活性分子的輸送媒介促進(jìn)組織細(xì)胞生長(zhǎng)；還可以配備多種功能，通過提供使細(xì)胞歸巢的微環(huán)境以及誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和組織形成的微環(huán)境促進(jìn)骨再生；也可以裝載藥物直接作用于骨缺損部位，提高藥物的生物利用度，此外，骨修復(fù)凝膠可以通過微創(chuàng)的方式在骨缺損局部給藥，與骨缺損部位緊密貼合，成為骨修復(fù)遞送系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)［11］。

目前研究的可注射凝膠遞送系統(tǒng)基質(zhì)多由明膠［12］、海藻酸鹽［13］、透明質(zhì)酸［14］、硫酸軟骨素［15］、聚乙二醇［16］、和聚乙烯醇［17］等構(gòu)成。與傳統(tǒng)材料相比，自組裝多肽分子通過多種非共價(jià)相互作用組裝成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，其形成過程是從分子到納米纖維再到最終水凝膠網(wǎng)絡(luò)，通常表現(xiàn)出層次化的微觀結(jié)構(gòu)［18］，且自組裝多肽水凝膠結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相似，降解速率與許多組織的生長(zhǎng)速率相適應(yīng)，是理想的組織工程的支架［19］。通過設(shè)計(jì)和調(diào)控多肽序列，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)外界刺激（pH、溫度、壓力等）產(chǎn)生良好的響應(yīng)能力和靶向識(shí)別能力，這些賦予了多肽凝膠材料作為藥物載體在藥物遞送領(lǐng)域中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［20］。此外，多肽還具有合成簡(jiǎn)單、易于功能化修飾以及降解產(chǎn)物（氨基酸）易于清除或重新吸收等優(yōu)點(diǎn)，成為凝膠遞送系統(tǒng)研究的新星［21］。本文討論了自組裝肽水凝膠在骨再生領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，首先介紹了不同種類自組裝多肽設(shè)計(jì)及其形成凝膠的自組裝機(jī)制，然后重點(diǎn)總結(jié)了自組裝多肽水凝膠在骨組織再生中的應(yīng)用，最后討論了自組裝多肽水凝膠在骨再生領(lǐng)域面臨的問題及未來發(fā)展方向。

1 自組裝多結(jié)構(gòu)特征及組裝機(jī)制

1.1 自組裝多肽結(jié)構(gòu)特征

自組裝是自然界中普遍存在的現(xiàn)象，例如細(xì)胞膜的形成、蛋白質(zhì)折疊和DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)，這是生命科學(xué)中最重要的組成部分之一。通過模仿具有自組裝功能的蛋白結(jié)構(gòu)可以設(shè)計(jì)出多種具有組裝功能的仿生多肽。除了仿生設(shè)計(jì)，從頭設(shè)計(jì)也是自組裝多肽設(shè)計(jì)的主要途徑。從頭設(shè)計(jì)自組裝肽的關(guān)鍵是理解各種分子間相互作用，包括氫鍵、靜電相互作用、π-π 堆積、范德華力和色散力、金屬-配體配合物和熵力，如疏水性和排除體積相互作用［22］。此外，除了非共價(jià)作用力，共價(jià)鍵（例如二硫鍵等）也被證明能夠驅(qū)動(dòng)超分子組裝［23］。

自組裝肽的結(jié)構(gòu)包括：多肽氨基酸序列即一級(jí)結(jié)構(gòu)，以及相鄰氨基酸之間的分子內(nèi)相互作用形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲，以及多肽分子間形成的具有特定折疊結(jié)構(gòu)的分子組裝［24］。多肽的氨基酸類型和序列是組裝形成的基礎(chǔ)。Costantini 等［25］總結(jié)了ProteinDataBank（PDB）數(shù)據(jù)庫中二級(jí)結(jié)構(gòu)狀態(tài)的氨基酸頻率和趨勢(shì)。具有組裝能力的肽的分子結(jié)構(gòu)往往具有明顯的特征，如兩親性、芳香性、分散電荷或異性電荷的交替排列以及對(duì)稱性。其中，兩親性多肽具有與傳統(tǒng)表面活性劑相似的性質(zhì)，即結(jié)構(gòu)中包含親水和疏水兩部分。對(duì)于兩親性多肽而言，親水性和疏水性的平衡是影響其自組裝形態(tài)的關(guān)鍵。組裝的最終結(jié)構(gòu)通過調(diào)節(jié)氨基酸的類型、數(shù)量和相對(duì)位置來改變它們的兩親性特性來控制［26］。芳香肽主要是一類含有芳香族氨基酸的肽，如苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）。它們的芳香性在多肽自組裝和凝膠化過程中發(fā)揮重要作用。芳香作用作為一種強(qiáng)相互作用可以提高多肽分子的自組裝能力［27］。此外，在設(shè)計(jì)自組裝多肽時(shí)，分子的對(duì)稱性也十分重要，許多自組裝分子都具有對(duì)稱性，因?yàn)榫哂袑?duì)稱性的分子在形成組裝相互作用時(shí)需要更少的接觸界面種類，更易于形成聚集體［28］。

1.2 自組裝多肽凝膠化機(jī)制

親疏水作用、靜電作用、氫鍵以及π-π 堆積等分子間相互作用是驅(qū)動(dòng)多肽自組裝實(shí)現(xiàn)凝膠化的主要作用力。亮氨酸拉鏈（leucine zipper，LZ）是典型的基于疏水作用形成的α-螺旋結(jié)構(gòu)，這種卷曲的螺旋結(jié)構(gòu)能夠在疏水作用下進(jìn)一步互相聚集，形成物理交聯(lián)凝膠。Huang 等［29］利用亮氨酸拉鏈的構(gòu)建了骨再生凝膠，用于負(fù)載BMP-2、VEGF 和TGF-β1 以及干細(xì)胞等，在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的成骨誘導(dǎo)作用。利用正負(fù)電荷間的靜電吸引作用，Kisiday等［30］設(shè)計(jì)了以Lys-Leu-Asp（KLD）為重復(fù)序列的十二肽KLD-12，序列中K 與D 相反電荷間的靜電作用驅(qū)動(dòng)肽鏈間的交聯(lián)組裝形成凝膠。Zanotto等［31］構(gòu)建了自組裝KLD 水凝膠負(fù)載血小板生長(zhǎng)因子和肝素結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，在體內(nèi)能夠促進(jìn)股骨軟骨缺損的再生。類似的，具有16個(gè)Glu-Ala-Lys 重復(fù)單元的多肽（EAK16）和16 個(gè)Arg-Ala-Asp-Ala 重復(fù)單元的多肽（RADA16）可以通過肽鏈間的氫鍵形成β折疊的平面，這些平面再通過靜電作用進(jìn)行堆疊，從而交聯(lián)形成凝膠［32］。在凝膠化過程中，π-π 堆積也是形成凝膠的關(guān)鍵。尤其是源于淀粉樣蛋白組裝聚集的核心序列Phe-Phe（FF）具有很強(qiáng)的組裝能力，被用于構(gòu)建多種多肽水凝膠。例如，Zuo 等［33］利用NapFFY 制備超分子水凝膠通過共組裝遞送成骨生長(zhǎng)肽，能夠有效地促進(jìn)顱骨再生。Ghosh 等［34］將芴甲氧羰基-二苯丙氨酸（Fmoc-FF）作為形成可注射凝膠的關(guān)鍵組成部分，構(gòu)建了能夠模擬天然骨細(xì)胞外基質(zhì)的水凝膠，表現(xiàn)出良好的誘導(dǎo)成骨分化和促進(jìn)鈣礦化作用。

2 自組裝多肽分類

2.1 膠原蛋白樣多肽

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要結(jié)構(gòu)成分，占人體蛋白質(zhì)含量的25% ～35%。目前，已至少發(fā)現(xiàn)了30 余種膠原蛋白鏈的編碼基因，可以形成16種以上的膠原蛋白分子。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和超分子組織，它們可分為原纖維形成膠原蛋白（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和XI型）、基膜膠原蛋白（Ⅳ型）、微纖維膠原蛋白（Ⅵ型）、六邊網(wǎng)狀膠原蛋白（Ⅷ、Ⅹ型）等［35］。其中，常見的I 型、Ⅱ型和V 型膠原原纖維可構(gòu)成肌腱、皮膚和骨等組織的結(jié)構(gòu)主干，II 型和XI 型膠原主要構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的纖維基質(zhì)［36］。盡管不同類型的膠原蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上存在差異，但都包含三螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)是膠原蛋白組裝聚集的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，由甘氨酸-X-Y 三肽組成的重復(fù)序列，其中X 和Y 通常代表脯氨酸和羥脯氨酸，它們通過周期性鏈間氫鍵形成螺旋纖維結(jié)構(gòu)［37］。在過去的幾十年中，研究人員在膠原蛋白組裝結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出了多種自組裝膠原蛋白樣（CLP）肽。CLP 不僅被設(shè)計(jì)用于模擬天然膠原原纖維，還能夠通過π-π 堆積作用、靜電吸引以及金屬離子螯合組裝形成高度有序的納米結(jié)構(gòu)［38］。Pires 等［39］通過改變CLP 的長(zhǎng)度，可以產(chǎn)生納米花、納米片和纖維狀網(wǎng)格等多種形貌。Pal等［40］在CLP的重復(fù)單元甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸（Gly-Pro-Hyp）的基礎(chǔ)上，分別用賴氨酸和天冬氨酸取代脯氨酸（Pro）后，在靜電、π-π 堆積、鹽橋等多種作用力的驅(qū)動(dòng)下共組裝形成水凝膠，實(shí)驗(yàn)證明了這種仿生多肽水凝膠具有良好的生物相容性（圖1）。Sun等［41］通過模擬Ⅰ型膠原蛋白纖維的形成，合成了鑭系元素觸發(fā)的肽組裝CLP-Ln3+系統(tǒng)，為構(gòu)建模擬天然膠原蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的納米纖維提供了簡(jiǎn)便而有效的策略。

2.2 離子互補(bǔ)型多肽

通常，離子自互補(bǔ)型肽的結(jié)構(gòu)是由疏水氨基酸殘基（丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或苯丙氨酸）和帶有正電荷（賴氨酸或精氨酸）或負(fù)電荷（天冬氨酸或谷氨酸）的親水氨基酸殘基交替排列［42］。根據(jù)帶電氨基酸殘基的分布不同，離子互補(bǔ)型肽電荷分布類型主要可分為3 種模式：模式Ⅰ“----++++”，模式Ⅱ“--++--++”和模式Ⅲ“-+-+-+-+”［43］。RADA16-Ⅰ是最典型的離子互補(bǔ)型自組裝肽，已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化（PuraMatrix?）。RADA16-Ⅰ序列中氨基酸殘基電荷呈現(xiàn)模式Ⅰ分布，此外，由于其與RGD 序列相似，該序列構(gòu)建的自組裝肽水凝膠在體內(nèi)外具有良好的成骨表現(xiàn)［44］。多肽中電荷分布模式不同，自組裝形貌亦有所差異。Hu 等［45］合成了兩種電荷分布的離子肽，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明有一種電荷的肽EF4E 和KF4K在同電荷排斥下只能形成窄的扭曲帶和細(xì)纖維。但當(dāng)將帶相反電荷的E 和K 殘基引入同一個(gè)條多肽序列中，形成離子互補(bǔ)型肽（EF4K）時(shí)，正負(fù)電荷相互中和，屏蔽了分子之間的靜電排斥，組裝體橫向生長(zhǎng)，最終形成寬帶（圖2）。通過蒙特卡羅模擬發(fā)現(xiàn)肽自組裝納米纖維親水表面上帶電氨基酸殘基之間的靜電相互作用可以穩(wěn)定纖維結(jié)構(gòu)，證明了靜電相互作用在肽自組裝過程對(duì)維持組裝形態(tài)中具有重要作用［46］。當(dāng)帶相反電荷的氨基酸殘基分布在肽序列的兩端時(shí)，肽在自組裝過程中傾向于采用反平行分子排列［47］。Behanna 等［48］證實(shí)在帶相反電荷的氨基酸殘基之間的靜電吸引力作用下形成的納米纖維具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

Figure 1 Self-assembly and potential characterization of peptide amphiphilesA: Mechanism of self-assembly of peptide amphiphiles; B: Self-assembly of peptide amphiphiles in their respective environment, leading to hydrogel formation at different pHs through counter ion stabilization,and upon mixing them together,they showed gelation at physiological pH because of electrostatic interaction;C:Zeta potential graph showing the overall surface charge at different mixing ratios of the peptides [40]

Figure 2 Charge distribution pattern and assembly mechanism of ionic self-complementary peptidesA: Self-assembly of a peptide consisting of alanine, glutamic acid and lysine (dEAK) into nanofibers, which were then entangled into 3D scaffolds.The self-assembling process was a consequence of complementary ionic interactions between charged residues (red for negatively charged glutamic acid and blue for the positively charged lysine residues),which could have different arrangements:modulus I,----++++;modulus II,--++--++;modulus III,-+-+-+-+[49]. Mechanism of twisted ribbon,belt and fibril formation by the peptides EF4E(B),EF4K,EF4E/KF4K mixture(C),and KF4K(D)[45]

2.3 兩親性多肽

兩親性多肽（PA）是另一種典型的自組裝多肽，PA 結(jié)構(gòu)中主要包含N 端疏水端、誘導(dǎo)形成β 折疊的中間肽序列和一個(gè)親水的C 端肽序列［50］。由于PA 在結(jié)構(gòu)上與天然哺乳動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)中的絲狀結(jié)構(gòu)相似，因此被廣泛用于仿生人工基質(zhì)的構(gòu)建。氫鍵和疏水作用是影響PA 自組裝能力的關(guān)鍵［51］。de Groot 等［52］發(fā)現(xiàn)異亮氨酸-苯丙氨酸（Ile-Phe）二肽在疏水作用力驅(qū)動(dòng)下能夠自組裝形成纖維網(wǎng)絡(luò)狀納米結(jié)構(gòu)，最終在水溶液中能夠形成水凝膠。但當(dāng)將異亮氨酸（Ile）換成少一個(gè)甲基（疏水基團(tuán)）的纈氨酸（Val）時(shí)，二肽纈氨酸-苯丙氨酸（Val-Phe），不能自組裝形成凝膠，表明疏水作用對(duì)自組裝能力的決定性作用。為了研究氫鍵對(duì)兩親性多肽自組形貌的影響，Sahoo 等［53］制備了含有不同分子間氫鍵鍵合傾向的三肽：FGD、FAD、FVD、FLD 和FID（圖3-A），固定N 端和C 端分別為一個(gè)疏水苯丙氨酸殘基（F）和親水天冬氨酸殘基（D），為了改變形成β-折疊的傾向，改變中間氨基酸殘基分別為甘氨酸（G）、丙氨酸（A）、纈氨酸（V）、亮氨酸（L）或異亮氨酸（L）。結(jié)果表明，通過改變這些肽中的一個(gè)氨基酸，可以產(chǎn)生具有不同縱橫比和幾何形狀的多種納米結(jié)構(gòu)，如：球形、斑塊、長(zhǎng)帶狀、直纖維和交聯(lián)纖維（圖3）。三肽FID甚至還能夠在非常低的濃度下形成有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的水凝膠。此外，PA 水凝膠是生物礦化的理想基質(zhì)［54］，有利于鈣沉積。Sargeant 等［55］設(shè)計(jì)了含有絲氨酸或磷酸絲氨酸殘基的PA 納米纖維水凝膠，在細(xì)胞培養(yǎng)條件下能夠促進(jìn)成骨分化和礦化。

Figure 3 Construction and characterization of amphiphilic tripeptidesA: Schematic illustration of the amphiphilic tripeptides, designed with an N-terminal phenylalanine residue and a C-terminal aspartic acid residue flanking a variable residue (X). This variable residue was modified to alter R-group volume and hydrogen bonding propensity by including a glycine(G),alanine (A),valine (V),leucine (L),or isoleucine (I)residue at this position;B:(Top row)Representative images of 20 mmol/L tripeptide solutions in water demonstrating those that form sol (FGD and FAD) and others that form hydrogels (FVD, FLD, and FID). (Second and third row) Representative TEM images for each tripeptide sequence,acquired from films cast from the 20 mmol/L solutions and negatively stained with uranyl acetate[53]

3 自組裝多肽凝膠在骨修復(fù)方面應(yīng)用

自組裝多肽水凝膠能夠仿生模擬細(xì)胞外基質(zhì)，有助于細(xì)胞的黏附、遷移，具有低免疫原性、易于負(fù)載多種細(xì)胞及生物活性物質(zhì)等優(yōu)勢(shì)，一直以來，被廣泛用于遞送干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及多種成骨蛋白或因子等，此外，水凝膠還可以通過摻入不同的納米填料，增強(qiáng)水凝膠的機(jī)械性能，在體內(nèi)外表現(xiàn)出良好的成骨性能。

3.1 自組裝多肽水凝膠負(fù)載細(xì)胞

將功能性細(xì)胞如干細(xì)胞直接遞送至在骨傷處能夠通過成骨分化以及分泌相關(guān)生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨再生。自組裝多肽水凝膠因其良好的生物相容性以及能夠?yàn)榧?xì)胞黏附、遷移和培養(yǎng)提供良好條件已成為多種干細(xì)胞遞送和培養(yǎng)的重要基質(zhì)［56］。BD PuraMatrix 肽水凝膠是一種源于自組裝肽RADA16 凝膠3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型，已廣泛應(yīng)用于骨組織再生。Moradi 等［57］利用PuraMatrix 凝膠裝載培養(yǎng)Schwann 細(xì)胞（SCs）然后移植到大鼠脊髓損傷模型中。體內(nèi)研究結(jié)果表明，不僅植入的SCs能夠在自組裝多肽水凝膠中增殖和遷移，還發(fā)現(xiàn)宿主SCs 大量遷移到凝膠中，表現(xiàn)出優(yōu)異的骨髓損傷修復(fù)作用。He 等［58］還報(bào)道了功能化的D-RADA16-RGD 多肽水凝膠在促進(jìn)髁突缺損的骨修復(fù)方面具有重要的潛力。Kisiday 等［59］設(shè)計(jì)了一種封裝BMSCs 的可注射自組裝多肽水凝膠，表現(xiàn)出優(yōu)異的軟骨再生能力。Lv 等［60］設(shè)計(jì)了一種含有連接蛋白N肽（LPP）的新型功能化自組裝肽水凝膠（KLD-12/KLD-12-LPP，KLPP），KLPP 水凝膠能夠在體外3D培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)和增強(qiáng)軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移。將KLPP 水凝膠注射體內(nèi)后，能夠?yàn)檐浌羌?xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移提供支撐，促進(jìn)透明樣軟骨修復(fù)。此外，Vitale 等［61］設(shè)計(jì)了能夠裝載破骨細(xì)胞的自組裝多肽凝膠體系，將羥基磷灰石（Hap）納米粒子填充入基于Fmoc 自組裝的RGD 功能化多肽水凝膠能夠模擬破骨細(xì)胞-骨骼界面微環(huán)境。與其他破骨細(xì)胞培養(yǎng)水凝膠（如結(jié)冷膠［62］、藻酸鹽［63］或膠原水凝膠［64］）不同的是，所設(shè)計(jì)的多肽水凝膠在沒有RANKL［65］等誘導(dǎo)因子加入的情況下就能夠促使Raw 264.7 巨噬細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞。該多肽水凝膠還被可以負(fù)載破骨細(xì)胞分化抑制劑，用于構(gòu)建出骨再生/吸收研究的新型體外模型［66］。

3.2 自組裝多肽水凝膠負(fù)載成骨活性劑

為了促進(jìn)骨組織再生，多種成骨活性劑，包括骨形成蛋白（BMPs）［67］、成骨活性因子［68］或活性肽［69］被引入骨填充材料中，水凝膠不僅能夠很好地維持蛋白、因子的活性，還能夠控制成骨活性劑在局部的緩慢釋放，被廣泛用于骨再生活性劑的遞送。例如，Zhang 等［70］構(gòu)建了能夠同時(shí)負(fù)載血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF 和骨形成蛋白BMP-2 的自組裝多肽水凝膠RATEA16。結(jié)果表明，該凝膠遞釋系統(tǒng)能夠有效地傳遞生長(zhǎng)因子，保證釋放的VEGF/BMP-2 濃度維持在活性范圍內(nèi)，能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成以及人頂乳頭干細(xì)胞的成骨能力。Zhao 等［71］將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）裝載于自組裝多肽D-RADA16-羥基磷灰石水凝膠中，能夠維持bFGF 在骨缺損部位持續(xù)、穩(wěn)定釋放，加速骨愈合。Panek 等［72］還設(shè)計(jì)了地塞米松-RADA16 水凝膠遞釋系統(tǒng)。該研究的創(chuàng)新性在于水凝膠支架中使用FDA 批準(zhǔn)的藥物地塞米松來誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，而不是成本高昂的骨形成蛋白等生物活性劑。Zanotto 等［31］設(shè)計(jì)自組裝KLD 水凝膠負(fù)載血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB 和肝素結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 來促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)。為了增強(qiáng)自組裝多肽水凝膠的成骨活性，Onak 等［69］將成骨活性肽EEGGC 和EEEEE活性肽通過化學(xué)偶聯(lián)方式連接在自組裝多肽KLD上。結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)的自組裝生物活性肽凝膠能夠增強(qiáng)堿性磷酸酶（ALP）活性、增加鈣沉積和促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，上調(diào)ALP、Ⅰ型膠原蛋白（COL-1）、骨橋蛋白（OP）和骨鈣素（OCN）關(guān)鍵成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平。Zuo 等［33］設(shè)計(jì)了自組裝多肽水凝膠NapFFY，通過共組裝負(fù)載成骨生長(zhǎng)肽（OGP）制備超分子水凝膠NapFFY-OGP。水凝膠的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以控制OGP 連續(xù)緩慢釋放。在大鼠顱骨缺損中，使得骨再生率達(dá)到37.45%，有效促進(jìn)顱骨缺損的再生和重建（圖4）。

4 總結(jié)與展望

Figure 4 Schematic illustration of the construction of NapFFY-OGP hydrogel and its application in promoting bone regeneration [33]

近年來，自組裝多肽作為新興生物材料，其良好的生物相容性、可注射性、低免疫原性以及靈活負(fù)載細(xì)胞、蛋白、小分子藥物的能力使之在骨再生領(lǐng)域大放異彩。然而，骨再生是一個(gè)復(fù)雜的過程，受到多種因素的影響，基于凝膠靈活多樣的負(fù)載性能和仿生性能，可探索利用多肽水凝膠同時(shí)負(fù)載多種干細(xì)胞及活性因子，發(fā)揮多策略協(xié)同增效的作用。此外，通過對(duì)自組裝多肽進(jìn)行功能化修飾，結(jié)合3D 打印等技術(shù)進(jìn)一步模擬骨組織再生微環(huán)境，除了負(fù)載干細(xì)胞及活性因子，還可以嘗試在凝膠中進(jìn)行骨組織的類器官培養(yǎng)再植入體內(nèi)，以提高大段骨缺損的再生能力。本課題組在多肽長(zhǎng)效凝膠遞釋系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，在多肽凝膠中引入MMPs 的降解序列，可調(diào)控多肽凝膠在體內(nèi)的降解速率。同時(shí)，天然存在的L型氨基酸具有快速水解的特點(diǎn)，非天然D-氨基酸殘基組成的D 型多肽具有抗蛋白水解性，使得D型多肽具有比L型多肽具有更高的穩(wěn)定性。此外，多肽組裝序列的交聯(lián)度決定了凝膠的硬度和孔隙大小，對(duì)凝膠降解及其負(fù)載藥物的釋放速率都產(chǎn)生影響。為了調(diào)控凝膠的降解速率，本課題組研究了氨基酸構(gòu)型和交聯(lián)度這兩大影響凝膠降解的因素，調(diào)控凝膠的降解動(dòng)力學(xué)，能夠滿足長(zhǎng)期降解釋放藥物的治療需求?？傊?，在未來的發(fā)展中，自組裝多肽骨修復(fù)水凝膠的開發(fā)應(yīng)集中于：構(gòu)建多策略聯(lián)用的仿生凝膠、提高水凝膠力學(xué)強(qiáng)度和控制凝膠降解速率。隨著骨組織工程的不斷進(jìn)步以及多技術(shù)的交叉融合，自組裝多肽水凝膠有望為骨缺損提供更多的臨床治療方案。