豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗安全性及免疫效力的評價

何錫忠，趙本進，林 鷙，朱永軍，李嘉皓，丁衛(wèi)星，彭麗英*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海佳牧生物制品有限公司，上海 201403)

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)引 起的傳染性疾病，已給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，其臨床表現(xiàn)主要是以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征為主[1-2]。該病主要發(fā)生在7～15周齡的斷奶仔豬，發(fā)病率4%～30%，死亡率可達50%～90%[3-4]，PCV2感染豬后可對機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫抑制作用[5]。目前對于PCV2引起的豬圓環(huán)病毒病尚無有效的治療方法，且該病毒對外界抵抗力強，造成豬場凈化難度高。豬圓環(huán)病毒病防控的主要手段是對豬接種疫苗。滅活疫苗的安全性高，所以滅活疫苗仍然是當前主要的疫苗研發(fā)類型，但其免疫效果卻不十分理想[4]。

本試驗是將所制備的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗接種豬后對其安全性及免疫效力進行評價。

1 材料

1.1 疫苗

豬圓環(huán)病毒2型疫苗，批號分別為20200401、20200409和20201001，由上海佳牧生物制品有限公司制備。

1.2 試驗動物

21日齡的健康易感仔豬(用豬圓環(huán)病毒2型特異性PCR方法檢測PCV2基因、PCV2抗體均為陰性)，購自江蘇省茅山鎮(zhèn)某家實驗動物養(yǎng)殖場。

1.3 豬圓環(huán)病毒2型

豬圓環(huán)病毒2型SN07-12株(滴毒，TCID50107.33/mL)，由上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所制備、鑒定和保存。

1.4 主要試劑和儀器

DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、PCV2間接免疫熒光試劑盒(韓國JBT生物技術公司)、Retiga 2000R高敏感度冷CDD熒光數(shù)碼顯微鏡(日本OLYMPUS)、GeneAmp9700-PCR擴增儀(美國AppliedBiosytems公司)、紫外凝膠成像系統(tǒng)(法國 Vilber Lourmat)、DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.5 PCR方法

PCR引物P1：5'－AAGAGAAATGGCATCTTCAACACC-3'，P2：5'－CAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3'，條帶大小為580 bp。反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)，72 ℃ 7 min。

2 方法

2.1 安全性試驗

將21日齡健康易感仔豬(PCV2抗原和抗體檢測均為陰性)20頭分為4組，每組5頭，3組為免疫組，1組為對照組。免疫組仔豬頸部肌內(nèi)注射疫苗，2.0 mL/頭，隨后觀察14 d內(nèi)的采食、飲水、精神是否正常，有無不良臨床反應，注射部位有無異常反應。免疫前3 d和免疫后10 d內(nèi)，測量體溫。免疫后14 d，從免疫組和對照組各選擇2頭仔豬進行剖檢，觀察各臟器有無病理變化。

2.2 免疫效力試驗

取21日齡健康易感仔豬(PCV2抗原和抗體檢測均為陰性)25頭，分為5組，每組5頭，第1～3組為免疫組，第4組接種安慰劑，為攻毒對照組，第5組不免疫不攻毒，為空白對照組，各組分別隔離飼養(yǎng)。免疫組仔豬頸部肌內(nèi)注射疫苗 1.0 mL/頭，首免后隔14 d用相同劑量加強免疫一次，二免后18 d分別在每頭仔豬的兩側(cè)腋下和臀部注射1.0 mL弗氏不完全佐劑乳化的鑰孔血藍蛋白(KLH/ICFA、0.5 mg/mL)，同時腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基，10 mL/頭。

2.2.1 PCV2抗體水平檢測

二免后第21天對所有仔豬采血，分離血清，用無血清培養(yǎng)基將PCV2稀釋為103.5TCID50/mL，接種于單層PK-15細胞，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，80%冷丙酮固定細胞30 min。采用免疫熒光方法檢測待檢血清的PCV2抗體水平，熒光顯微鏡下見綠色特異性熒光為陽性，無綠色特異性熒光為陰性，出現(xiàn)特異性熒光的血清最高稀釋倍數(shù)為抗體效價。根據(jù)抗體效價檢查結(jié)果進行判定，免疫組至少4頭仔豬的PCV2抗體效價不低于1∶ 1 600，攻毒對照組及空白對照組仔豬的檢測結(jié)果均陰性(不高于1∶400)。

2.2.2 免疫攻毒

二免后第21天，用PCV2 SN07-12強毒株(病毒含量為TCID50107.33/mL)對各免疫組和對照組仔豬進行攻毒，滴鼻1.0 mL、頸部肌內(nèi)注射8.0 mL，逐日測量體溫并觀察25 d。攻毒后第4天分別在每頭仔豬的兩側(cè)腋下及臀部注射1.0 mL弗氏不完全佐劑乳化的鑰孔血藍蛋白(合計4.0 mL/頭)，同時腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基10 mL/頭；攻毒后第11、19天再次腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基10 mL/頭。觀察期結(jié)束時，將試驗仔豬稱重后撲殺，采集每頭仔豬的腹股溝淋巴結(jié)，通過免疫組化法對PCV2抗原進行檢測[4]。根據(jù)體溫、平均日增重和病毒抗原檢查結(jié)果進行判定，免疫組應至少4頭仔豬受到保護，攻毒對照組應至少4頭仔豬發(fā)病。

2.2.3 PCV2病毒檢測

PCR法按照中國動物衛(wèi)生與流行病學中心提供的豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈式反應檢測試劑盒說明書進行。

免疫組化法是將各組仔豬的腹股溝淋巴結(jié)浸泡于2.5%戊二醛-多聚甲醛混合液中固定，8 h～12 h后將固定好的組織修剪成適當大小的塊，按免疫組化法[6]進行PCV2檢測。

2.3 仔豬發(fā)病的判定標準

2.3.1 體溫

仔豬體溫升高(≥40℃)(每日上午9點左右測定仔豬體溫一次)，至少持續(xù)3 d。

2.3.2 平均日增重

攻毒當日和攻毒結(jié)束日，分別對各組仔豬進行稱重，計算攻毒后各組仔豬的平均日增重，若攻毒仔豬的平均日增重低于空白對照組仔豬的，且差異顯著(P＜0.05)，判該組仔豬生長發(fā)育不良，均有臨床癥狀。

2.3.3 病毒抗原檢測

用常規(guī)免疫組化法檢測仔豬腹股溝淋巴結(jié)的PCV2抗原。

符合2.3.1、2.3.2、2.3.3中的任何2項，即可判為發(fā)病。

3 結(jié)果

3.1 安全性試驗結(jié)果

3.1.1 體溫測定

3批次疫苗免疫后，免疫組仔豬每日每頭測得的體溫均低于40 ℃，與對照組仔豬的相似，體溫處于正常范圍內(nèi)(表1)。

3.1.2 臨床觀察

由表2可知，3批次疫苗免疫后觀察14 d，仔豬采食、精神狀態(tài)均正常，被毛整潔有光澤，均無不良臨床反應，疫苗吸收良好，注射部位均無紅腫、硬塊等局部異常反應，與對照組仔豬相比無明顯差異。

3.1.3 剖檢

免疫后14 d各組隨機選1頭仔豬剖檢，觀察仔豬各臟器病理變化。結(jié)果顯示，免疫組及對照組仔豬各臟器均無病理變化(表3)。

3.2 效力試驗結(jié)果

3.2.1 抗體測定

由表4可知，豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗二免后3周，各批次疫苗免疫仔豬的抗體效價均不低于1∶1 600，攻毒對照組及空白對照組每頭仔豬的抗體效價不高于1∶400。

3.2.2 臨床觀察

如表5所示，攻毒后14 d內(nèi)逐日測量各組仔豬的體溫，并進行臨床觀察，各批次疫苗免疫仔豬后均無不良臨床反應，每日每頭仔豬的體溫均不高于40 ℃，與空白對照組仔豬的差異不顯著(P＞0.05)；攻毒對照組有部分仔豬在攻毒后3 d～5 d體溫略有升高，其中體溫高于40 ℃持續(xù)3 d。

3.2.3 平均日增重、剖檢以及PCR方法和免疫組化法檢測結(jié)果

攻毒后25 d對各組仔豬稱重，并計算仔豬的平均日增重。結(jié)果表明，3批次疫苗免疫組、攻毒對照組及空白對照組仔豬攻毒后的平均的日增重分別為(0.533±0.012)kg、(0.534±0.014)kg、(0.537±0.011)kg、(0.492±0.009)kg、(0.532±0.018)kg，免疫組與空白對照組之間差異不顯著(P＞0.05)。攻毒后25 d剖檢所有試驗仔豬，3批次疫苗免疫組、攻毒對照組及空白對照組仔豬各臟器均未發(fā)現(xiàn)病理變化，通過PCR方法及免疫組化法對腹股溝淋巴結(jié)檢測PCV2時發(fā)現(xiàn)，3批次疫苗免疫組和空白對照組仔豬的檢測結(jié)果均為陰性，攻毒對照組仔豬也均為陽性(表6)。

4 討論

安全性試驗表明，仔豬以2倍劑量接種3批次疫苗后，體溫、采食量、毛色、精神狀態(tài)均正常，生長發(fā)育良好，無異常臨床反應，符合疫苗安全要求。

潘杰等發(fā)現(xiàn)，在二免2周后，該疫苗不僅能提高仔豬體液免疫水平，誘導高效特異性抗體產(chǎn)生，而且能夠有效抵抗強毒株的攻擊，保護率可達100%[6]。本研究從攻毒后試驗仔豬的體溫變化、平均日增重、抗體水平、PCR方法及免疫組化法等方面對疫苗免疫保護效果進行了評價。結(jié)果表明：免疫組及空白對照組仔豬體溫正常，毛色整潔有光澤；攻毒對照組仔豬體溫升高(高于40 ℃)持續(xù)3 d，毛色紊亂無光澤。攻毒后25 d剖檢，各組仔豬均無特征性的豬圓環(huán)病毒病的病理變化；但是免疫組及空白對照組仔豬的平均日增重大于攻毒對照組仔豬的；免疫組每頭仔豬的抗體效價均不低于1∶1 600，攻毒對照組及空白對照組每頭仔豬的抗體不高于1∶400；在用PCR方法和免疫組化法檢測PCV2上，免疫組均為陰性，而攻毒對照組均為陽性。依據(jù)仔豬的發(fā)病標準判定免疫組保護率為100%，攻毒對照組保護率為0。由此可見，豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗能夠有效預防豬圓環(huán)病毒2型強毒株對豬的侵入。