基于外翻腸囊法研究烏蕨醇提物的腸吸收特性*

胡燕珍 劉建坤 黃斌 陳樂(lè)#

（1 江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046；2 江西道地特色中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)研究室 南昌 330046；3 江西南華醫(yī)藥有限公司 南昌 330009）

烏蕨 （Odontosoria chinensisJ. Sm.） 為鱗始蕨科（Lindsaeaceae）烏蕨屬植物的全草，具有清熱解毒、利濕、止血之效，是一種民間常用中草藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，烏蕨提取物具有抗炎、抗腫瘤、降血糖等作用[1～3]。本課題組前期對(duì)近年來(lái)烏蕨的化學(xué)成分、含量測(cè)定、藥理作用等研究進(jìn)展進(jìn)行了相關(guān)綜述，在化學(xué)成分的整理中發(fā)現(xiàn)，烏蕨中的化學(xué)成分以黃酮類和有機(jī)酸類成分為主[4]。同時(shí)，本課題組也基于超高效液相色譜- 四極桿- 飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)驗(yàn)證了烏蕨的化學(xué)成分主要為黃酮類和有機(jī)酸類化合物[5]。目前，有關(guān)烏蕨的研究主要集中在有效成分含量測(cè)定、化學(xué)成分分離純化、新化合物結(jié)構(gòu)鑒定、物種鑒別以及對(duì)各種烏蕨粗提物療效物質(zhì)基礎(chǔ)的初步探索階段，尚未見(jiàn)烏蕨主要化學(xué)成分的外翻腸囊吸收特性研究。查閱烏蕨化學(xué)成分含量測(cè)定相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)不少學(xué)者通過(guò)測(cè)定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷等指標(biāo)成分的含量來(lái)制定其藥材或飲片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[6～7]。由于中藥成分復(fù)雜、藥理作用多樣，以單個(gè)或多個(gè)指標(biāo)性成分的含量高低來(lái)評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，其合理性有待考究。近年來(lái)基于“中藥成分群-吸收成分群-藥效成分群”的假說(shuō)來(lái)選擇中藥質(zhì)量控制指標(biāo)以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究已成為熱點(diǎn)。外翻腸囊法是由Wilson 和Wiseman 于1954年創(chuàng)建，最早用于研究葡萄糖和氨基酸在腸道的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)[8]，由于該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂胁僮骱?jiǎn)單、影響因素少、實(shí)驗(yàn)條件可控、容易定量、藥物積累較快、藥物用量較少等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已被廣泛用于中藥有效成分的識(shí)別及其吸收機(jī)制研究[9～11]?；诖耍狙芯坎捎猛夥c囊法制備各腸段的烏蕨腸囊吸收液，應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC 法）檢測(cè)腸囊吸收液中的化學(xué)成分（牡荊苷、原兒茶酸、原兒茶醛）含量，并對(duì)各成分的腸吸收特征進(jìn)行分析和總結(jié)，以期為烏蕨質(zhì)量控制指標(biāo)的制定及其提取物劑型的開(kāi)發(fā)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（Agilent 公司，美國(guó)）；MS105DU 型十萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多公司，瑞士）；組織-器官水浴系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；Precision HL G3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)heidolph 公司）。

1.2 藥材與試劑 烏蕨藥材于2020年5月28日采集于江西省景德鎮(zhèn)市昌江區(qū)（批號(hào)：20200528），經(jīng)江西省中醫(yī)藥研究院虞金寶研究員鑒定為鱗始蕨科植物烏蕨的全草。原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)110809-201906，純度97.7%）原兒茶醛對(duì)照品（批號(hào)110810-201608，純度99.3%），牡荊苷對(duì)照品（批號(hào)111687-201704，純度94.9%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（HPLC 級(jí)，F(xiàn)isher 公司）；甲醇（HPLC 級(jí)，F(xiàn)isher 公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；葡萄糖、氯化鎂（MgCl2）、氯化鉀（KCl）、氯化鈉（NaCl）、氯化鈣（CaCl2）、碳酸氫鈉（NaHCO3）和磷酸二氫鈉（NaH2PO4）（AR 級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)）。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量230～250 g，購(gòu)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（贛）2018-0003。

1.4 Tyrode 緩沖液配制 準(zhǔn)確稱取 NaCl 8.0 g，MgCl20.1 g，KCl 0.28 g，NaH2PO40.05 g，NaHCO31.0 g 溶于500 ml 蒸餾水中（溶液Ⅰ），密閉冷藏；準(zhǔn)確稱取0.2 g CaCl2溶于500 ml 蒸餾水中（溶液Ⅱ），密閉冷藏；使用前將溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混勻，并加入1.0 g葡萄糖充分溶解，即得。

2 方法

2.1 色譜條件 迪馬鉆石Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：A 相為 0.4%磷酸水溶液，B 相為乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：原兒茶酸、原兒茶醛均為260 nm，牡荊苷為340 nm；流速1.0 ml/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量 10 μl。洗脫梯度：0～20 min，A 相 95%～90%；20～20.1 min，A 相 90%～82%；20.1～60 min，A相82%～82%。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取原兒茶酸6.43 mg、原兒茶醛7.10 mg、牡荊苷6.28 mg，加70%甲醇配成濃度0.251 3 mg/ml 的原兒茶酸對(duì)照品母液、0.282 0 mg/ml 的原兒茶醛對(duì)照品母液、0.238 4 mg/ml 的牡荊苷對(duì)照品母液，備用。

2.3 供試品溶液制備 稱取烏蕨（批號(hào)20200528）藥材粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率為40 kHz）60 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22 μm 微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 烏蕨醇提物的制備及烏蕨含藥Tyrode 緩沖液的配制 將烏蕨鮮品用清水洗凈，水分瀝干后，置于70℃烘箱中烘干。將烘干的烏蕨藥材粉碎（過(guò)3 號(hào)篩），稱取烏蕨藥材粉末500 g，加6 倍量95%乙醇，回流提取2 次，每次2 h，趁熱過(guò)濾，合并兩次濾液，濃縮干燥得烏蕨醇提物。使用前用Tyrode 緩沖液配制高、中、低質(zhì)量濃度的烏蕨醇提物供試藥液。

2.5 烏蕨腸囊吸收液的制備 參照文獻(xiàn)方法[8,11]，復(fù)制大鼠外翻腸囊實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?8 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分成三組，每組6 只，對(duì)應(yīng)高、中、低3個(gè)劑量烏蕨醇提物供試藥液。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食（自由飲水）12 h 后，斷頸椎處死，沿腹部中線剖開(kāi)，迅速取出小腸和大腸，分別剪取十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸各10 cm，將剪下的腸管放置于盛有0℃Tyrode 緩沖液的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，用0℃Tyrode 緩沖液沖洗腸管，至無(wú)內(nèi)容物沖出為止，并小心剝離腸管表面的腸系膜和脂肪。將腸管的一端結(jié)扎在自制硅膠套管上，小心翻轉(zhuǎn)腸管，用0℃Tyrode 緩沖液沖洗內(nèi)表面，洗凈后將另一端結(jié)扎，形成囊狀腸管。在囊狀腸管中注入2 ml 37℃Tyrode 緩沖液，置于預(yù)先加入25 ml 烏蕨醇提物供試藥液（高、中、低3個(gè)劑量）的麥?zhǔn)显」苤?，通入混合氣體（95%O2，5%CO2），整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持37℃恒溫。分別于 30 min、45 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集 0.4 ml 腸囊吸收液置于EP 管中，同時(shí)各腸管補(bǔ)充0.4 ml 37℃的Tyrode 緩沖液，各樣品于-20℃密封保存，待用。

2.6 腸囊吸收液樣品處理 精確量取“2.5 項(xiàng)”下各時(shí)間點(diǎn)烏蕨腸囊吸收液200 μl，使用氮吹儀吹干腸囊吸收液樣品后，加入等體積70%甲醇復(fù)溶，超聲樣品 15 min，渦旋 30 s，樣品經(jīng) 0.22 μm 濾膜過(guò)濾待測(cè)。烏蕨供試品溶液及空白腸囊吸收液Tyrode 緩沖液采用與烏蕨醇提取腸囊吸收液相同的處理方式。

3 結(jié)果

3.1 專屬性 在建立的色譜條件下，烏蕨供試品溶液中的原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷3 種活性成分的峰與其他非被檢測(cè)峰均能夠達(dá)到基線分離，色譜峰形尖銳、對(duì)稱性良好，分離度＞1.5。對(duì)照品和供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 不同波長(zhǎng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取“2.2”項(xiàng)下原兒茶酸、原兒茶醛和牡荊苷對(duì)照品母液，用70%甲醇依次稀釋，得不同溶度混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述各溶液 10 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄各成分峰面積，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。線性方程如下：原兒茶酸（Y=3.466 2×103X+0.394 1，r=0.999 9，0.050 26～0.502 6 μg）；原兒茶醛（Y=1.132 5×103X+1.693 8，r=0.999 9，0.056 40～0.564 0 μg）；牡荊苷（Y=1.100 8×103X+0.252 8，r=0.999 8，0.143 04～1.430 4 μg）。

3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一樣品10 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷3 種成分的峰面積，計(jì)算各成分峰面積的RSD，分別為0.23%、0.28%、0.13%（RSD 均小于2%），表明液相色譜儀精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，分別于 0 h、2 h、6 h、10 h、16 h、20 h、24 h 進(jìn)樣，記錄原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷3 種成分的峰面積，計(jì)算各成分峰面積的RSD，分別為 0.69%、0.61%、0.68%（RSD 均小于 2%），表明烏蕨樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取烏蕨（批號(hào)：20200528）藥材粉末6 份，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，得6 份供試品溶液。精密吸取上述溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷：3 種成分的含量，各成分的平均含量分別為0.03%、0.04%、0.24%（RSD 均小于2%），表明該法重復(fù)性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取烏蕨（批號(hào)：20200528）藥材粉末 6 份，分別為 0.493 2 g、0.491 9 g、0.493 1 g、0.492 5 g、0.493 4 g、0.493 5 g，依次精密加入含原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷的混合對(duì)照品溶液25 ml（原兒茶酸6.760 8×10-3mg/ml、原兒茶醛9.493 1×10-3mg/ml、牡荊苷 39.28×10-3mg/ml），按“2.3”項(xiàng)方法處理。精密吸取供試品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷3種成分含量，計(jì)算各成分的平均加樣回收率，分別為103.36%、99.47%、97.23%，RSD 分別為 3.17%、3.37%、4.45%，符合樣品分析要求。

3.7 烏蕨醇提物腸囊吸收液各成分測(cè)定分析 在建立的色譜條件下，烏蕨醇提物中的原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷3 種活性成分的峰與其他非被檢測(cè)峰能夠達(dá)到基線分離。但烏蕨醇提物腸囊吸收液中未檢測(cè)出原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷3個(gè)指標(biāo)性成分。見(jiàn)圖2。

圖2 不同波長(zhǎng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜圖

4 討論

外翻腸囊法保留了腸道組織的完整性和黏膜的特性，可在體外模擬體內(nèi)生理狀態(tài)下小腸對(duì)藥物的吸收情況，能較為真實(shí)地反映藥物在腸道中的吸收情況[12]。本研究建立了HPLC 同時(shí)測(cè)定烏蕨醇提物中的原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷3 種成分的方法，并對(duì)該法進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明該法重復(fù)性好、檢測(cè)效率高、專屬性強(qiáng)，適于烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷3 種化學(xué)成分的定量分析。但在本研究建立的色譜條件下，烏蕨醇提物腸囊吸收液未檢測(cè)出原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷3 種成分。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能有以下幾方面：（1）原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷三者非以原型形式在小腸吸收；（2）原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷三者在小腸吸收過(guò)程中，需要某些特定轉(zhuǎn)運(yùn)載體介導(dǎo)，而烏蕨中其他成分對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體具有一定的抑制作用，有關(guān)推測(cè)需進(jìn)一步研究確證；（3）烏蕨腸囊吸收液樣品中3 種活性成分（原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷）含量較低，低于檢測(cè)限。針對(duì)上述原因，本研究后續(xù)將進(jìn)一步深入探索。