光遺傳技術(shù)終止大鼠心房顫動的在體研究?

羅俊苗 徐建昌 饒盼盼 王晞

2006 年,Deisseroth等[1]首次提出了光遺傳學(xué)(optogenetics)的概念。該技術(shù)充分結(jié)合了遺傳學(xué)與光學(xué)的優(yōu)勢[2],即特定細(xì)胞類型的基因靶向能力和光投射的非接觸準(zhǔn)直定向性等,通過借助基因編輯和修飾技術(shù)將光敏感蛋白高效穩(wěn)定地表達(dá)于靶部位,并基于不同波長的光照對細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行電生理調(diào)節(jié)。光遺傳學(xué)在調(diào)控心律方面表現(xiàn)出了巨大的潛力,起初Arrenberg等[3]通過光照表達(dá)陽離子通道視紫紅質(zhì)-2(ChR2)的斑馬魚心肌成功實現(xiàn)了光遺傳學(xué)對心率的調(diào)控。隨后Bruegmann等[4]使用4個間隔為1 s的藍(lán)光脈沖終止了心臟表達(dá)ChR2的離體小鼠心房顫動(簡稱房顫)。因此將光遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用于心臟研究,尤其是心律失常的治療有望成為繼藥物或電復(fù)律等之后的又一可行方案。筆者通過構(gòu)建心臟廣泛表達(dá)光控ChR2的大鼠在體房顫模型,驗證光遺傳技術(shù)終止在體房顫的有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級SD 孕鼠2只,購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司,動物飼養(yǎng)繁殖和實驗操作于武漢大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物中心進(jìn)行。

1.2 基因傳遞及分組 隨機(jī)選取孕鼠繁殖的12只SD 幼年大鼠于10 日齡時通過面罩吸氧持續(xù)給予2%～3%異氟醚麻醉,經(jīng)頸靜脈注射50μl重組腺相關(guān)病毒[r AAV9-CAG-hCh R2(XXM)-e YFP]。重組腺相關(guān)病毒由武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司包裝、純化,其中Ch R2_XXM 質(zhì)粒由德國維爾茨堡大學(xué)Georg Nagel教授課題組惠贈。病毒注射7周后,大鼠隨機(jī)分為房顫組和對照組,每組6只。房顫組:經(jīng)尾靜脈注射Ach-CaCl2混合溶液(Ach 66 ug/kg,CaCl210 mg/kg),連續(xù)給藥7天。對照組:操作同房顫組,Ach-CaCl2混合溶液用等量PBS代替。

1.3 心電圖(ECG)、單相動作電位(MAP)記錄及電生理檢查 病毒注射8周后,通過腹腔注射3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)對大鼠進(jìn)行麻醉。仰臥固定,切開氣管,連接微型動物呼吸機(jī)(特力TKR 400 H),頻率65次/分,潮氣量15 ml,并記錄ECG(Powerlab)。穩(wěn)定5 min后,進(jìn)行開胸手術(shù),開瞼器撐開胸廓充分暴露右房。采用程序刺激對兩組大鼠進(jìn)行電生理檢查,每串程序包括8個連續(xù)的S1S1刺激,刺激周期為150 ms,記錄MAP。使用Labchart8.0分析并統(tǒng)計RR 間期、P波幅度、心率及動作電位復(fù)極90%的時程(APD90)。

1.4 房顫的光遺傳學(xué)終止 電生理檢查后,通過激光器(LFM470,長春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司)發(fā)放連續(xù)20個473 nm 藍(lán)光的脈沖(頻率:8 Hz;脈沖寬度:20 ms照射大鼠右房,將光源置于右房上方1.5 cm 處,使其照射面積為20 mm2,根據(jù)同步記錄的光輸出信號與體表心電圖判斷心臟節(jié)律是否被光脈沖奪獲,并將可以1∶1奪獲心房的最小功率密度定義為光起搏閾值[5－6](功率密度＝光照強(qiáng)度/光照面積)。給予Burst刺激(6 V,波寬20 ms,持續(xù)2～4 s)誘發(fā)房顫,以f波出現(xiàn)和P 波消失作為房顫發(fā)生的標(biāo)志,以出現(xiàn)竇性心律作為恢復(fù)的標(biāo)志,持續(xù)時間超過1 s被定義為誘發(fā)成功。為排除短時間內(nèi)因為自然轉(zhuǎn)復(fù)的房顫對實驗的影響,后續(xù)的光遺傳實驗只納入并統(tǒng)計持續(xù)時間超過5 s的房顫。房顫持續(xù)5 s后于右房施加4個間隔為1 s,脈沖寬度為1 s,面積為20 mm2,功率密度為20倍閾值的程控光照(N＝35,n＝6)[7]。未給予任何光照干預(yù)的自然轉(zhuǎn)復(fù)房顫作為自身對照(N＝30,n＝6)。房顫終止成功的標(biāo)準(zhǔn)為光照結(jié)束后1 s內(nèi)或房顫持續(xù)13 s內(nèi)(13 s為5 s房顫持續(xù)時間＋8 s光照觀察期)心電圖由房顫波形恢復(fù)為竇性心律。光照終止率為房顫組大鼠單只終止率的均數(shù),N 為房顫誘發(fā)次數(shù)(每只房顫組大鼠誘發(fā)超過5 s的房顫次數(shù)至少大于10次)。對照組大鼠因無法穩(wěn)定誘發(fā)超過5 s的房顫,則不進(jìn)行光遺傳學(xué)實驗,且不納入統(tǒng)計。

1.5 心房組織病理學(xué)及eYFP 熒光觀察 實驗結(jié)束后處死動物,取心臟,小心切取右心耳,用生理鹽水洗除血漬,置于體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛液中固定24 h,脫水、包埋、切片,之后進(jìn)行HE和Masson三色染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察心房病理變化。剩余組織沿心臟長軸縱切制備四腔心熒光切片,使用熒光蛋白抗體標(biāo)記eYFP顯示熒光信號以確定病毒轉(zhuǎn)染情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±σ)表示,使用SPSS Statistics v26.0(IBM 公司)進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組均數(shù)間的比較采用t檢驗,以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 兩組ECG 及MAP 參數(shù)對比 與對照組比較,房顫組RR 間期延長,P波幅度、心率和APD90均減少(P均＜0.05),見表1。

表1 兩組心電圖及單相動作電位指標(biāo)比較

2.2 房顫的光遺傳學(xué)終止 光起搏閾值以上的藍(lán)光照射可以完全奪獲心房節(jié)律,給予房顫組大鼠20個8 Hz的473 nm 藍(lán)光照射右房,照射面積為20 mm2,光照脈沖信號與心房波呈1∶1關(guān)系(圖1),而閾值以下則不能或不能完全奪獲心房(圖2)。完全奪獲心房所需的最小功率密度為(0.057±0.016)MW/mm2。使用Burst刺激(6 V,波寬20 Hz,持續(xù)2～4 s)直至誘發(fā)房顫,房顫持續(xù)5 s后于右心房施加4個間隔為1 s的程控光照,在13s的觀察期內(nèi)房顫終止率為80.7%±5.8%,房顫持續(xù)時間為(10.9±1.1)s;而未給予任何光照干預(yù)時,在13 s內(nèi)房顫自發(fā)終止率為30%±8.6%,房顫持續(xù)時間為(41.6±10.4)s,圖3。上述實驗結(jié)果表明,心臟光遺傳學(xué)可以有效終止房顫并減少房顫持續(xù)時間,兩組結(jié)果具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

圖1 光起搏閾值以上的藍(lán)光照射可以完全奪獲右房

圖2 光起搏閾值以下的藍(lán)光照射不能奪獲右房

圖3 房顫組房顫的光終止和自然轉(zhuǎn)復(fù)的比較

2.3 兩組心房組織病理學(xué)及四腔心eYFP 熒光觀察 HE染色結(jié)果顯示,對照組與房顫組大鼠均無明顯差異,細(xì)胞膜完整,輪廓清晰,排列整齊,未見炎性細(xì)胞浸潤。Masson結(jié)果顯示,房顫組心肌纖維間膠原沉積輕微高于對照組(圖4)。

圖4 兩組大鼠右房的HE染色和Masson染色(標(biāo)尺:40 um)

大鼠四腔心熒光切片顯示出均勻分布的e YFP綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞,證明重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染成功,且在全心均有較為廣泛的表達(dá)(圖5)。

圖5 大鼠四腔心的eYFP綠色熒光圖(標(biāo)尺:2 000 um)

3 討論

目前使用最廣泛的光學(xué)工具蛋白是從藻類克隆的光門控陽離子通道Ch R2[8]。這種具有七個跨膜區(qū)的蛋白質(zhì)含有全反式視網(wǎng)膜作為發(fā)色團(tuán),通過470 nm 的藍(lán)光照射后其異構(gòu)化為13-順式視網(wǎng)膜,并隨后打開主要傳導(dǎo)Na＋和K＋的通道孔,產(chǎn)生一個去極化內(nèi)向電流,稱為“光”電流。本次研究選擇了ChR2的一個新型突變版本Ch R2_D156H,因其超高表達(dá)能力(extra high expression)及中等開放狀態(tài)(medium open state)而被命名為ChR2_XXM[9]。

2005年,Boyden 等[10]將Ch R2應(yīng)用于哺乳動物神經(jīng)元中,并引發(fā)了精確的神經(jīng)脈沖。2010年,Arrenberg等[3]通過光照表達(dá)通道Ch R2的斑馬魚心肌成功實現(xiàn)了光遺傳技術(shù)對心律調(diào)控。2018年,Bruegmann等[4]使用光遺傳技術(shù)成功終止了小鼠房顫,其中房顫模型的構(gòu)建通過了Cx40基因突變或低K＋灌流等手段。以上措施降低了心房傳導(dǎo)速度及P波幅度,使得心臟波長減少從而有利于心房容納折返波。Ach-CaCl2混合物可通過降低有效不應(yīng)期(ERP)及APD 同樣達(dá)到減少心臟波長及增加心房易損性的效果[11],這是由于Ach和Ca2＋參與心房電重構(gòu),Ach激活心肌M 受體依賴的K＋通道,縮短APD,增加心房易損性,而Ca2＋則使心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載,縮短心房肌細(xì)胞有效不應(yīng)期,促進(jìn)房顫的維持[11]。本項研究通過尾靜脈注射Ach-CaCl2構(gòu)建了在體大鼠房顫模型,并通過頸靜脈系統(tǒng)注射重組腺相關(guān)病毒[r AAV9-CAG-hCh R2(XXM)-eYFP],實現(xiàn)了目的蛋白Ch R2在全心廣泛表達(dá)。Ch R2在6～8周表達(dá)達(dá)到高峰,因此筆者在病毒注射后第8周進(jìn)行光遺傳學(xué)相關(guān)實驗。

Bruegmann等[4]的研究表明,在一定范圍內(nèi)增加對心房的有效照射面積可以提高房顫終止效率,因此筆者選取了20 mm2的光照面積進(jìn)行了房顫的光終止研究,結(jié)果顯示房顫的終止率高達(dá)80.7%±5.8%。目前光遺傳終止房顫潛在機(jī)制:①持續(xù)性去極化產(chǎn)生傳導(dǎo)阻滯:光遺傳學(xué)的一個主要優(yōu)點是通過連續(xù)照射的持續(xù)去極化能力,在這種情況下,去極化將激活快速電壓門控Na＋通道,隨后持續(xù)的光照導(dǎo)致細(xì)胞膜電位去極化至更低的負(fù)電位,并阻止Na＋通道的復(fù)活,導(dǎo)致照明區(qū)域的心臟的興奮性降低[4]。②使用光遺傳學(xué)消除轉(zhuǎn)子終止房顫[12－13]:轉(zhuǎn)子被認(rèn)為是房顫的重要驅(qū)動因素,光照可使轉(zhuǎn)子半徑顯著增加,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)子與邊界碰撞、泯滅而終止房顫[12]。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是由于被照射區(qū)域的“匯”-“源”失配,而導(dǎo)致轉(zhuǎn)子核心曲率半徑增加。

光遺傳學(xué)通過基因修飾技術(shù)能夠使光敏蛋白精確表達(dá)至心臟特定區(qū)域甚至整個心臟上[14],光提供的精確時空控制和基因技術(shù)提供的靶向表達(dá),為心臟光遺傳學(xué)治療房顫提供了巨大潛力和幫助。在光門控去極化離子通道的表達(dá)下,通過短暫和局部的心外膜照明能產(chǎn)生足以終止房顫的去極化電流。這種生物性電流能夠在時間上和空間上精確地且無痛地干擾心律,從而使紊亂的心律得以恢復(fù)正常。在近年的研究中,心臟光遺傳學(xué)在小動物上證明了它治療房顫的基本效用,但在將光遺傳技術(shù)引入臨床之前,還需要對大動物進(jìn)行后續(xù)研究,來進(jìn)一步評估光遺傳學(xué)臨床轉(zhuǎn)化的有效性及安全性。