三種胡枝子對干旱脅迫的生理響應

劉建勇，王照蘭，杜建材，張穎娟，3

（1.內蒙古師范大學 生命科學與技術學院，內蒙古 呼和浩特 010022；2.中國農業(yè)科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010；3.內蒙古師范大學 學報編輯部，內蒙古 呼和浩特 010022）

胡枝子屬（Lespedeza）植物，為豆科（Leguminosae）重要的野生牧草種質資源，全世界有60 余種，我國26 種［1］，屬多年生草本狀半灌木或灌木。其根系發(fā)達，抗干旱、寒冷，耐貧瘠，生態(tài)適應性強，廣泛分布于沙石地、丘陵水土流失嚴重地帶及退化沙化草地等，在我國北方地區(qū)水土保持、退化沙化草地植被恢復、荒漠化防治中具有重要的開發(fā)利用潛力［2］。但是，與紫花苜蓿（Medicago sativa）、三葉草（Trifolium repens）、錦雞兒（Caragana sinica）等其他豆科牧草相比，對胡枝子屬植物的研究和利用相對滯后，培育出的胡枝子品種較少［3］。

隨著國家生態(tài)治理和荒漠化防止政策的實施，胡枝子屬植物的重要價值，引起了許多學者的關注。黃瑾等［4］研究了達烏里胡枝子在黃土丘陵區(qū)的生產力及土壤水分。趙國靖等［5］揭示了達烏里胡枝子根系形態(tài)特征對土壤水分變化的響應。薛菲等［6］開展了胡枝子對鹽堿脅迫的生理響應。有關尖葉胡枝子（Lespedeza hedysaroides）、牛枝子（Lespedeza potaninii）和達烏里胡枝子（Lespedeza davurica）3 個物種抗旱機理的研究報道尚少。

尖葉胡枝子（L.hedysaroides）為小灌木，主要分布于我國東北及華北，是華北地區(qū)山地天然草地中最常見的豆科牧草之一［1］。牛枝子（L.potaninii）為半灌木，分布于我國華北、西北、華中等多個省區(qū)，生長于荒漠草原、草原帶的沙質地、丘陵地、礫石地、石質山坡及山麓，耐干旱，可作水土保持及固沙植物［1］。達烏里胡枝子（L.davurica）為草本狀半灌木，主要分布在我國東北、華北、西北、華中至云南，生長于森林草原和草原地帶的干山坡，丘陵坡地、沙質地，為草原群落的次優(yōu)勢成分或伴生成分，耐旱耐瘠薄，適于放牧或刈割，也可作為山地、丘陵地及沙化草地的水土保持植物［1］。

本實驗測定上述3 種植物在干旱脅迫條件下的生理指標，了解3 種植物的抗旱機理，旨在探討其抗旱生理變化特征，為開展其轉錄組研究、新品種培育以及在干旱條件下的種植利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究材料

研究材料為課題組通過前期研究培育出的尖葉胡枝子、牛枝子和達烏里胡枝子，均來自中國農業(yè)科學院草原研究所。

1.2 試驗設計

1.2.1 種子處理 選取上述3 種胡枝子粒大飽滿的成熟種子（果實），分別用砂紙進行打磨，去除其果皮并破除其種子硬實性（通過預備試驗，確保打磨后的種子發(fā)芽率達75% 以上）。將打磨好的干凈種子，按不同種分別放入盛有75% 乙醇的燒杯中，滅菌處理3 min 后，倒出75% 乙醇，加入蒸餾水，快速沖洗多次。之后分別取出各種子，置于多層干濾紙上，風干待用。

1.2.2 發(fā)芽試驗 在15 cm 口徑的培養(yǎng)皿中，鋪兩層濾紙，將上述處理好的種子置于濾紙上，每個培養(yǎng)皿200 粒種子，每種胡枝子50 個培養(yǎng)皿。之后，將培養(yǎng)皿放入植物培養(yǎng)箱進行發(fā)芽（溫度25 ℃，光強5 500 lx，光/黑=12 h/12 h）。發(fā)芽24 d 后，倒出培養(yǎng)皿中的水，再向各培養(yǎng)皿中加入15%PEG‐6000 溶液，進行模擬干旱脅迫處理。在脅迫的0 h（對照）、6.5 h、13 h、19.5 h、26 h，依次取各種胡枝子的幼苗（包括根和葉），測定RWC（相對含水量）、REC（相對電導率）、SOD（超氧化物歧化酶）活性和MDA（丙二醛）含量，每種胡枝子的4 個指標在各個處理時間點，均設3 次重復。

1.3 測試方法

相對含水量測定采用了飽和稱量法；質膜透性測定采用了相對電導率法；丙二醛含量測定采用了硫代巴比妥酸法［7］。超氧化物歧化酶測定使用上海生物科技有限公司試劑盒進行測定，具體方法采用分光光度法（具體操作略有改動），即首先將各個處理梯度的胡枝子幼苗樣品（約0.15 g），從-80 ℃超低溫冰箱取出，置于預冷好的研缽，加液氮快速研磨好后，轉入提前預冷好的離2.5 mL 心管，之后加入1 mL 提取液，充分震蕩均勻。在8 000 r/min 離心機離心10 min，溫度保持4 ℃，取上清液，置于冰上。之后按照試劑盒步驟依次加入試劑，混勻，室溫靜置30 min，加入1 mL 比色皿中，測定各處理在560 nm 處的吸光度（測定前將分光光度計預熱30 min 以上，并調節(jié)波長至560 nm，用蒸餾水調零）。按照下式計算各處理樣品SOD 酶活性。

式中：I為抑制百分率；M為樣本質量；C為對照管；D為吸光度測定管。

1.4 數據分析

采用EXCEL2019 和SPSS26 軟件對數據進行處理、統(tǒng)計分析和作圖。

2 結果分析

2.1 干旱脅迫下三種胡枝子幼苗的相對含水量

15% 的PEG 溶液模擬干旱脅迫不同時間梯度下，3 種胡枝子幼苗的相對含水量變化如圖1 所示。從圖1 可以看出，在未受脅迫的條件下，牛枝子的相對含水量最高，為90.75%，其次是尖葉胡枝子（89.82%），相對含水量最低的是達烏里胡枝子（83.99%）。

圖1 不同時間梯度15% PEG 溶液干旱脅迫下三種胡枝子的相對含水量變化Fig.1 Changes of relative water content of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

隨著脅迫（15%PEG 溶液處理）時間的延長，尖葉胡枝子和牛枝子的幼苗相對含水量均呈現(xiàn)下降趨勢，但二者對干旱脅迫的響應情況有所不同。尖葉胡枝子在脅迫6.5 h、13 h 時與未脅迫對照相比差異不顯著（P>0.05），在脅迫19.5 h 時，其幼苗相對含水量發(fā)生顯著下降（P<0.05）；而牛枝子在脅迫6.5 h 時，幼苗相對含水量發(fā)生顯著下降（P<0.05），為80.10%，之后隨著脅迫時間的延長，其幼苗相對含水量基本保持穩(wěn)定（P>0.05）。

達烏里胡枝子幼苗在15%PEG 溶液處理6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 下的相對含水量與其未脅迫對照相比差異均不顯著（P>0.05），其幼苗對干旱脅迫表現(xiàn)出了相對較好的耐受性。

2.2 干旱脅迫下三種胡枝子幼苗相對電導率

理論上，植物受到干旱脅迫時，若細胞膜結構受到傷害，則會引起細胞膜透性增大，細胞內容物外滲，使外滲液電導值增大。三種胡枝子相對電導率隨脅迫時間的變化如圖2 所示。由圖2 可見，在未受脅迫的環(huán)境下，達烏里胡枝子的相對電導率最高，為30.62%，其次是尖葉胡枝子（26.86%），相對電導率最低的是牛枝子（14.82%）。

圖2 不同時間梯度15%PEG 溶液干旱脅迫下三種胡枝子電導率變化Fig.2 Changes of electrical conductivity of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

隨著脅迫時間的延長，尖葉胡枝子和達烏里胡枝子的幼苗相對電導率均在6.5 h 時，出現(xiàn)了下降趨勢，但尖葉胡枝子的各個處理和對照之間均差異不顯著（P>0.05）。達烏里胡枝子在脅迫6.5 h 時，幼苗電導率顯著低于對照（P<0.05），在處理6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 之間差異不顯著（P>0.05），但均顯著低于對照（P<0.05）。

牛枝子在脅迫6.5 h 時，幼苗相對電導率亦發(fā)生顯著下降（P<0.05），降為11.56%，之后隨著脅迫時間的延長，從整體來看產生了上升趨勢。

2.3 干旱脅迫下三種胡枝子幼苗丙二醛含量

植物在干旱脅迫到超過其可以承受的程度時，會產生膜脂過氧化作用。膜脂過氧化的最終結果是產生丙二醛。丙二醛的積累對膜和細胞造成一定的傷害。

三種胡枝子的幼苗，在6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 各個時間點處理的丙二醛含量與未經處理的對照相比，經統(tǒng)計分析差異均不顯著（P>0.05），如圖3 所示。表明15% 的PEG 溶液模擬干旱脅迫6.5 h~26 h，尚未對參試的尖葉胡枝子、牛枝子和達烏里胡枝子的細胞膜產生顯著傷害。

圖3 不同時間梯度15% PEG 溶液模擬干旱脅迫下三種胡枝子丙二醛含量變化Fig.3 Changes of MDA of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

2.4 干旱脅迫下三種胡枝子幼苗超氧化物歧化酶活性

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內存在的一種抗氧化金屬酶，植物細胞膜系統(tǒng)的重要保護酶之一，在細胞抗氧化、衰老 中 起 著 至 關 重 要 的 作 用［10］。 經15%PEG 溶液模擬干旱脅迫6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 后，3 種供試胡枝子幼苗的SOD 活性都有不同程度提高，但不同胡枝子間的變化趨勢不同（圖4）。由圖4 可知，尖葉胡枝子在未經脅迫處理時，其SOD 活性為59.72 U/mg，之后隨著脅迫時間的延長，SOD 活性逐漸增強，當脅迫時間達26 h，達到顯著水平（P<0.05）。此時其SOD 活性為132.64 U/mg，比未經脅迫的對照增加了72.92 U/mg，SOD 活性提高了122%。

圖4 不同時間梯度15% PEG 溶液模擬干旱脅迫下三種胡枝子超氧化物歧化酶活性變化Fig.4 Changes of SOD of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

牛枝子在未經干旱脅迫處理時，其SOD 活性為63.11 U/mg，之后隨著脅迫時間的延長，SOD 活性呈先升高后下降的趨勢。具體表現(xiàn)為：在脅迫時間6.5 h 至13 h 時，SOD 活性快速升高，并在脅迫13 h 時達到高峰，且與對照相比差異顯著（P<0.05）。此時其SOD 活性達到108.04 U/mg，比對照增加了44.93 U/mg，SOD 活性提高了72%。

達烏里胡枝子在未經干旱脅迫處理時，其SOD 活性為67.63 U/mg，之后隨著脅迫時間的延長，SOD活性也呈先升高后下降的趨勢。具體表現(xiàn)為：在脅迫時間6.5 h 至13 h 時，SOD 緩慢升高，在脅迫19.5 h時達到高峰，且與對照相比差異顯著（P<0.05）。此時其SOD 活性達到121.97 U/mg，比對照增加了54.33 U/mg，SOD 活性提高了80.72%。

3 結論與討論

相對含水量與植物的代謝活動密切相關，是用于研究植物抗旱性的重要生理指標之一［8］。有研究表明，植物通過保持較高水平的葉片相對含水量來實現(xiàn)對干旱條件的適應［9］。本研究結果顯示，尖葉胡枝子和牛枝子的幼苗相對含水量，隨脅迫時間的延長均呈現(xiàn)下降趨勢，這與譚莎等［10］在研究3 個山茶品種受水分脅迫后的相對含水量變化趨勢的結果相一致。本研究中牛枝子在15%PEG 溶液脅迫6.5 h 時，幼苗相對含水量便發(fā)生顯著下降（P<0.05），之后隨著脅迫時間的延長其相對含水量基本保持穩(wěn)定（P>0.05）；尖葉胡枝子在脅迫19.5 h 時，其幼苗相對含水量才發(fā)生顯著下降（P<0.05）；而達烏里胡枝子幼苗在6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 各個處理條件下的相對含水量與其未經脅迫的對照相比差異均不顯著（P>0.05），這一研究結果與馬彥軍等［11］的PEG 脅迫后牛枝子含水量最多，尖葉胡枝子含水量較少的研究結果略有不同。本研究結果表明3 種胡枝子對PEG 脅迫的生理響應不同。

植物細胞主要是由膜系統(tǒng)組成的多分子動態(tài)體系。干旱造成膜結構及其功能傷害的根本是因為脫水導致膜構型改變和膜脂過氧化作用，進而降解膜蛋白和使其變性等，導致細胞內溶質外滲，引起電導率的上升［12］。本研究中尖葉胡枝子、達烏里胡枝子和牛枝子的幼苗相對電導率，均在脅迫6.5 h 時，出現(xiàn)了下降趨勢。其原因可能是15% PEG 溶液短時間的處理，激發(fā)了其植物體內某種防御機制，減少了細胞內溶質的外滲。從3 個品系對各個時間梯度脅迫處理的整體響應來看，存在差異。

丙二醛為膜脂過氧化產物，其含量可以直接反映細胞膜脂過氧化程度，從而間接反映植物的受害程度［13］。在干旱程度嚴重情況下，活性氧大量積累，引發(fā)細胞膜脂過氧化，從而使細胞膜受到傷害，導致丙二醛含量上升。本研究中，3 種胡枝子在各個時間梯度處理下的丙二醛含量與其未經處理的對照相比，差異均不顯著（P>0.05），表明15% 的PEG 溶液模擬干旱脅迫6.5 h~26 h，尚未對參試的3 種胡枝子幼苗細胞膜造成顯著傷害，膜脂過氧化尚未發(fā)生或者已經發(fā)生但程度較輕。

超氧化物歧化酶是植物體內重要的抗氧化酶，能有效清除活性氧，進而保護膜系統(tǒng)［14］。本研究中15%PEG 溶液模擬干旱脅迫6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 后，3 種胡枝子幼苗的SOD 活性都有不同程度的提高。這一研究結果與劉承等［15］在玉米抗旱性上的研究結果相同。不同胡枝子對各個脅迫處理的SOD 響應不同。尖葉胡枝子在脅迫時間達26 h 時，SOD 活性顯著增加并達到高峰，為132.64 U/mg，比對照提高了122%；牛枝子在脅迫13 h 時達到高峰，為108.04 U/mg，比對照提高了72%，與對照相比差異顯著（P<0.05）；達烏里胡枝子在脅迫19.5h 時達到高峰，為121.97 U/mg，比對照提高了80.72%，且與對照相比差異顯著（P<0.05）。

植物的抗旱性是多種因素綜合作用的結果［15］。因此，某一項生理指標難以全面、準確地反映出其抗旱生理響應情況。需要結合多個指標綜合分析，本研究進一步將結合分子水平的研究，深入探討其抗旱機制。