彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者神經(jīng)生長因子、Netrin-1、腦源性神經(jīng)生長因子的表達(dá)及相關(guān)性分析

林道銳 徐璐 陳瑜 郭麗娟 楊慧

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤是一種常見的好發(fā)于血液系統(tǒng)的惡性腫瘤[1]，是非霍奇金淋巴瘤的常見病理類型[2,3]。彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者常見臨床癥狀有無痛性、進(jìn)行性的淋巴結(jié)腫大，發(fā)熱，乏力，盜汗等[4]。彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤最常見累及的部位為胃腸道，胃或者回盲部，其他的部位也常常有發(fā)生。該病多見于>60歲的老年人，也可以見于兒童[5]。靶向治療是近幾年興起的淋巴瘤治療手段，患者的化療效果較為可觀，且不良反應(yīng)發(fā)生率相對較低，完全緩解率可以達(dá)到75%～80%，5年的生存率大約為50%，但每種靶向藥物只針對特定的患者群體，在治療上產(chǎn)生了局限性，所以發(fā)掘新型治療靶點(diǎn)刻不容緩[6]。神經(jīng)因子在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要角色[7]，神經(jīng)生長因子在膽管癌和骨腫瘤等惡性腫瘤組織中的表達(dá)顯著升高，抗神經(jīng)因子治療能夠有效緩解患者臨床癥狀、促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，抗神經(jīng)生長因子信號通路維持著霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的生存，神經(jīng)生長因子沉默的霍奇金淋巴瘤細(xì)胞凋亡比例顯著升高。Netrin-1 是Netrin 家族成員之一，在神經(jīng)生長、血管生成和免疫反應(yīng)中均發(fā)揮著強(qiáng)大的調(diào)控功能[8,9]。腦源性神經(jīng)生長因子主要位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)能夠維持神經(jīng)元的存活和生長[10]，并在一些惡性腫瘤的增殖和侵襲中發(fā)揮著促進(jìn)作用。本文通過觀察神經(jīng)生長因子、Netrin-1、腦源性神經(jīng)生長因子在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者組織的變化，并分析其關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年1月至2020年12月來我院就診的符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者60例為研究對象，根據(jù)淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)(IPI)將患者分成低危組(評分≤2)和高危組(評分>2)，每組30例患者；另采取30例慢性淋巴結(jié)炎患者活檢淋巴組織為對照組。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，經(jīng)患者及其家屬同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):①病理結(jié)果確診為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；②年齡：16～60。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn):①患有慢性阻塞性肺疾??；②伴隨癌癥；③患有退行性神經(jīng)病變和自身免疫性疾病等慢性疾病患者; ④合并腦出血和腦梗死; ⑤合并結(jié)核、艾滋病和乙肝病毒感染患者; ⑥長期酗酒;⑦吸毒。

1.3 試劑盒材料 羊血清封閉液、生物素二抗、堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液、蘇木精; Ki-67、CD31、NGF、BDNF 和 Netrin-1 一抗; CD4-PE、CD25-FITC; 淋巴細(xì)胞分離液。

1.4 免疫組化法檢測Ki-67、神經(jīng)生長因子、Netrin-1、腦源性神經(jīng)生長因子的表達(dá) 收集淋巴標(biāo)本，4%多聚甲醛固定24 h后，進(jìn)行石蠟切片。梯度脫水后，加入3%過氧化氫。PBS清洗3次，羊血清封閉液封閉30 min后，滴加Ki-67、NGF、BDNF 和 Netrin-1的一抗，4℃冰箱過夜。緩沖液清洗3遍，加二抗，孵育。再沖洗3遍，加入工作液，孵育。PBS清洗3次后顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片，之后置于顯微鏡下觀察。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞比例 收集各組患者治療前的外周血3 ml，加入3 ml的0.9%氯化鈉溶液稀釋。加入淋巴細(xì)胞分離液上層，梯度離心。取中間的白膜層，0.9%氯化鈉溶液清洗3次后，平均分成3份，加入流式細(xì)胞學(xué)抗體(CD4-PE和CD25-FITC)，避光室溫條件下染色20 min。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 3組研究對象一般資料在性別比、年齡、體重方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組研究對象一般資料比較

2.2 Ki-67增殖指數(shù)變化 低危組 Ki-67較對照組上升；高危組較低危組上升(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 Ki-67增殖指數(shù)變化(×100)

表2 Ki-67增殖指數(shù)變化

2.3 神經(jīng)生長因子、Netrin-1、腦源性神經(jīng)生長因子表達(dá)的變化：與對照組相比，低危組神經(jīng)生長因子、Netrin-1平均光密度增加(P<0.05)；與低危組相比，高危組神經(jīng)生長因子、Netrin-1平均光密度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3組腦源性神經(jīng)生長因子平均光密度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3，圖2。

表3 神經(jīng)生長因子、Netrin-1、腦源性神經(jīng)生長因子表達(dá)的變化

圖2 神經(jīng)生長因子、Netrin-1、腦源性神經(jīng)生長因子表達(dá)的變化(免疫組化×100)

2.4 Treg細(xì)胞比例比較 與對照組比較，低危組Treg比例增加(P<0.05)；與低危組比較，高危組Treg比例增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 Treg細(xì)胞比例

表4 Treg細(xì)胞比例

2.5 相關(guān)性分析 神經(jīng)生長因子與Ki-67、Treg呈正相關(guān)(r=0.968或0.859,P<0.01)；Netrin-1與Ki-67、Treg、神經(jīng)生長因子呈正相關(guān)(r=0.964或0.825,P<0.01)；腦源性神經(jīng)生長因子與Ki-67、Treg、神經(jīng)生長因子沒有相關(guān)性(P>0.05)。見表5，圖4。

表5 相關(guān)性分析

圖4 相關(guān)性分析

3 討論

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤是發(fā)生在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤的一種，嚴(yán)重影響機(jī)體的造血功能，具有較強(qiáng)的侵襲性與異質(zhì)性，是發(fā)病率較高的惡性淋巴瘤[11,12]?；熓侵委熢摬〉闹饕椒╗13]。彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤為一種高度惡性、對化療相對敏感的淋巴瘤，骨髓抑制是化療的主要毒副作用之一，它包括貧血、白細(xì)胞較少、血小板減少，臨床患者多因化療不能耐受，尤其是老年患者，由于年齡高、體質(zhì)差，易同時(shí)合并心、腦、腎疾病，不能按時(shí)、足療程完成治療，影響疾病預(yù)后。因此，尋找緩解臨床癥狀、改善生存質(zhì)量、提高生活質(zhì)量、穩(wěn)定瘤體、提高機(jī)體免疫力、延緩腫瘤發(fā)展的治療方法是目前惡性淋巴瘤治療的重點(diǎn)。本文通過比較神經(jīng)生長因子、Netrin-1、腦源性神經(jīng)生長因子在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者體內(nèi)的表達(dá)變化并分析其相關(guān)性。

相關(guān)研究表明，神經(jīng)生長調(diào)節(jié)分子能夠維持神經(jīng)正常功能、促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)，還能夠調(diào)節(jié)免疫、細(xì)胞保護(hù)和促血管生成[14,15]。但腫瘤細(xì)胞中神經(jīng)生長調(diào)節(jié)分子高表達(dá)的機(jī)制尚不明確，有猜測稱其作用機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞浸潤神經(jīng)引起神經(jīng)生長因子及Netrin-1表達(dá)增加、腫瘤自身分泌以及腫瘤微環(huán)境等有關(guān)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)生長調(diào)節(jié)分子能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。TrkA、p75均是神經(jīng)生長因子的受體，高表達(dá)的神經(jīng)生長因子和TrkA可以增加癌細(xì)胞的侵襲率，且其表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)距離播散、高TNM分期、低分化和低存活率緊密相關(guān)[16,17]。本文通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，彌漫大B淋巴瘤患者組織中神經(jīng)生長因子的表達(dá)明顯增加，并且其與癌細(xì)胞增殖指數(shù)Ki-67具有顯著相關(guān)性，這提示，我們可以在臨床上將神經(jīng)生長因子作為評估彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的分級及預(yù)后的指標(biāo)。另外，神經(jīng)生長因子還與PI3K/AKT、mTOR等信號通路有密切聯(lián)系[18]，這些通路都或多或少的與腫瘤細(xì)胞的免疫、生物學(xué)功能及為環(huán)境有關(guān)，所以深入挖掘神經(jīng)生長因子對惡性腫瘤的作用效果及調(diào)控機(jī)制，對其應(yīng)用于淋巴瘤的靶向治療中具有重要臨床意義。

Netrin-1是一種軸突導(dǎo)向分子，也是新型的免疫抑制因子，能夠促進(jìn)神經(jīng)末梢定向生長、顯著降低患者的抗腫瘤免疫能力。研究發(fā)現(xiàn)，Netrin-1參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，能促使腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和促進(jìn)血管生成等[19]。本文通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者組織中Netrin-1呈現(xiàn)高表達(dá)，并且其與癌細(xì)胞增殖指數(shù)Ki-67具有顯著相關(guān)性，這指示Netrin-1與淋巴瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可將其當(dāng)做另一個(gè)重要靶點(diǎn)應(yīng)用于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的精準(zhǔn)治療。Treg 細(xì)胞是哺乳動物體內(nèi)重要的免疫抑制細(xì)胞，具有強(qiáng)大的抑制細(xì)胞免疫和固有免疫反應(yīng)的功能。本文實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，患者外周血Treg細(xì)胞顯著高表達(dá)，且與神經(jīng)生長因子、Netrin-1呈現(xiàn)正相關(guān)性，其具體作用機(jī)制尚不清楚。腦源性神經(jīng)生長因子是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在腫瘤細(xì)胞的增殖遷移中具有重要作用，所以被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤治療[20]。但本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其在該病中的變化并不顯著，所以其應(yīng)用于該病的靶向治療效果可能不是很好。

綜上所述，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者組織中神經(jīng)生長因子和Netrin-1顯著高表達(dá)，并且與增殖指數(shù)Ki-67密切相關(guān)，神經(jīng)生長因子、Netrin-1與外周血Treg細(xì)胞比例顯著正相關(guān)，這為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的靶向檢測治療提供了新靶點(diǎn)，其作用機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步研究。