不同針灸方法對KOA模型大鼠軟骨損傷生物標(biāo)志物MMP-1、MMP-3和TIMP-1的影響

任菁鈺，王 順，牟秋杰，田會玲，楊佳一，劉 浩，汪子棟，李志剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是以局部軟組織黏連、軟骨變性退變和破壞為主的病理改變[1-3]，常以局部關(guān)節(jié)退變乃至畸形[4]及發(fā)作期中度以上疼痛甚則難以入眠[5]為臨床特征?，F(xiàn)代研究表明，針灸在臨床治療KOA具有可靠療效[6-8]，其中如手針、電針和溫針對KOA均具有延緩軟骨退變的作用[9-11]，但這3種方法之間的效果異同卻仍無明確結(jié)論。基于此，本研究擬通過大鼠KOA模型探討不同針灸方法對KOA大鼠軟骨損傷修復(fù)的干預(yù)差別及對相關(guān)生物標(biāo)志物MMP-1、MMP-3和TIMP-1的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

北京維通利華生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0006]，SPF級雄性SD大鼠50只，飼養(yǎng)于IVC大鼠籠中，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為正常組(N)、模型組(M)、溫針組(W)、電針組(D)和手針組(S)5組，每組10只。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑 單碘乙酸鹽、戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)；0.25 mm×25 mm針灸針(中研太和醫(yī)療有限公司)；4 %多聚甲醛、甲酸脫鈣液和蘇木素染液(北京百諾威生物科技有限公司)；抗體MMP-1、MMP-3(proteintech中國公司)；TIMP-1(美國Abcam公司)；通用二抗、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；感光膠片(美國柯達(dá)公司)。

1.2.2 儀器 ALLEGRA低溫高速離心機(jī)(美國Beckman);ASP300S全自動脫水機(jī)、RM2245半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國徠卡儀器有限公司);HQ穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀(美國Bio-Ra公司);37400-001機(jī)械觸覺測痛儀(Ugo Basile生物研究儀器公司);SDZ-V電子針療儀(華佗牌蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.3 模型制備

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 空白組及模型組 N、M組不做任何處理，共28 d。

1.4.2 手針組 造模成功后，S組采用規(guī)格0.25 mm×25 mm針灸針，選取鶴頂、陽陵泉穴[13]，刺入5 mm，200 r/min，行針1 min，留針20 min，每10 min行針1次。

1.4.3 電針組 D組在S組基礎(chǔ)上針刺后接電針，疏波，1 mA，2 Hz，20 min/次。

1.4.4 溫針組 W組在S組基礎(chǔ)上將直徑5 mm艾炷置于針柄，20 min/次。

S、D和W組均隔天干預(yù)，共28 d。

1.5 組織取材與檢測方法

1.5.1 組織取材 干預(yù)28 d后，戊巴比妥鈉麻醉，生理鹽水灌注，血凈后，將脛、腓和股骨肌肉組織剔凈，隨機(jī)取6只軟骨入-80 ℃保存，隨機(jī)取3只膝關(guān)節(jié)，入4%多聚甲醛固定48 h，沖水12 h，入甲酸脫鈣液，脫至大頭針輕松穿過組織，沖水6 h，入5%硫酸鈉溶液12 h，沖水，脫水，包埋。

1.5.2 檢測方法 行為學(xué)評價(jià):采用Lequesne MG膝關(guān)節(jié)評分[14]分別于造模前0 d和造模后14 d(造模結(jié)束前S組死亡1只)進(jìn)行模型評價(jià)；采用機(jī)械觸覺測痛儀在干預(yù)前后對各組患肢進(jìn)行檢測。

由于農(nóng)業(yè)食品系統(tǒng)的改變，決定這些變化，特別是參與超市供應(yīng)鏈?zhǔn)欠衲転樾∞r(nóng)戶帶來了積極的影響尤其重要。盡管收集“現(xiàn)在”和“以前”的數(shù)據(jù)有局限性，但是研究也對農(nóng)民在市場渠道方面的銷售收入、業(yè)績、整體情況、買家的滿意度，以及相對價(jià)格的影響做出了努力。出乎意料的是，農(nóng)民使用的市場渠道都不會對現(xiàn)在和五年前銷售、收入、性能和整體情況的差異有任何顯著的影響。然而，市場渠道對顧客滿意度和相對價(jià)格有一個(gè)顯著的影響。

HE染色:切片脫蠟至水，蘇木素染色3 min，分化液5 s，沖洗30 s，返藍(lán)30 s，沖洗30 s，伊紅染色1 min，沖水5 s，脫水透明，封片。

免疫組化法檢測關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、MMP-3和TIMP-1陽性表達(dá):切片脫蠟至水，PBS 3 min×3，高壓鍋EDTA抗原修復(fù)8 min，H2O220 min，山羊血清20 min，MMP-1一抗(1∶200 μL)、MMP-3一抗(1∶100 μL)和TIMP-1一抗(1∶50 μL)，37 ℃，1 h，反應(yīng)增強(qiáng)液30 min，通用二抗20 min，DAB底物液一滴鏡下觀察，顯色后即刻清洗，復(fù)染8 s，沖水5 min，脫水透明，封片，Image-Pro Plus6.0軟件分析IOD值。

Western blot檢測關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、MMP-3及TIMP-1蛋白表達(dá):軟骨加裂解液，液氮研磨，離心取上清，BCA法測定蛋白含量。取40 μg總蛋白電泳，初始80 V，溴酚藍(lán)進(jìn)入后100 V。電轉(zhuǎn)30 mA，90 min。5%TBS-T脫脂奶粉封閉1 h。加一抗MMP-1、MMP-3、TIMP-1和GAPDH，4 ℃孵育過夜。加二抗孵育1 h，將膜入ECL混合液，X光片曝光，顯影，定影，晾干保存，掃描，Image-Pro Plus6.0軟件分析灰度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

2.1.1 各組膝骨關(guān)節(jié)Lequesne MG評分比較 結(jié)果顯示，造模前各組大鼠膝關(guān)節(jié)評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，造模后除N組外，其余4組評分顯著高于造模前，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明采用MIA注射大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)建立KOA大鼠模型成功。見表1。

表1 各組膝骨關(guān)節(jié)Lequesne MG評分比較

2.1.2 各組大鼠機(jī)械刺激回縮閾值比較 結(jié)果顯示，干預(yù)前M、W、D和S組較N組相比回縮閾值均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。W、D和S組與M組相比回縮閾值結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后W、D和S組較M組相比，回縮閾值均上升，在干預(yù)組中，其中D組與M組相比，D組較M組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組機(jī)械刺激回縮閾值比較

2.2 各組大鼠軟骨組織病理形態(tài)比較

HE染色：N組軟骨表層平整，細(xì)胞呈圓形或橢圓形；M組全層破壞嚴(yán)重，細(xì)胞破壞、增多紊亂，空泡明顯；W組軟骨較完整細(xì)胞增多紊亂，成簇聚集；D組軟骨較完整，細(xì)胞較完整、增多紊亂，出現(xiàn)纖維化；S組軟骨較完整，細(xì)胞較完整、增多紊亂，空泡明顯，出現(xiàn)纖維化。見圖1。

2.3 各組大鼠軟骨組織MMP-1表達(dá)比較

2.3.1 免疫組化法檢測 結(jié)果顯示，M組較N組升高，W、D和S組較M組降低，D組較W組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2、表3。

表3 各組大鼠軟骨組織MMP-1陽性表達(dá)比較

2.3.2 Western blot法檢測 結(jié)果顯示，M組較N組升高，D、W和S組較M組降低，W組較D組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3、表4。

表4 各組大鼠軟骨組織MMP-1蛋白表達(dá)比較

2.4 各組大鼠軟骨組織MMP-3表達(dá)比較

2.4.1 免疫組化法檢測 結(jié)果顯示，M組較N組升高，W、D和S組較M組降低，D組較S、W組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4、表5。

表5 各組大鼠軟骨組織MMP-3陽性表達(dá)比較

2.4.2 Western blot法檢測 結(jié)果顯示，M組較N組升高，D、S組較M組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5、表6。

表6 各組大鼠軟骨組織MMP-3蛋白表達(dá)比較

2.5 各組大鼠軟骨組織TIMP-1表達(dá)比較

2.5.1 免疫組化法檢測 結(jié)果顯示，N、M、W和S組較D組均降低，D、S組較M組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6、表7。

表7 各組大鼠軟骨組織TIMP-1陽性表達(dá)比較

2.5.2 Western blot法檢測 結(jié)果顯示，W、D和S組較M組均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖7、表8。

表8 各組大鼠軟骨組織TIMP-1蛋白表達(dá)比較

3 討論

KOA的軟骨損傷尤以細(xì)胞外基質(zhì)(ExtracellμLar Matrix，ECM)中的基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)的增高與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)的相應(yīng)變化最為關(guān)鍵[15]，ECM通過合成及降解維持著動態(tài)平衡[16]，對關(guān)節(jié)軟骨起著支撐和緩解外部壓力的作用[17]，若因急性損傷、炎癥等因素破壞了ECM穩(wěn)態(tài)的平衡，則會激發(fā)ECM的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡能力[18]，其中MMP-1可直接作用于軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原使其裂解，從而加快軟骨的破壞和缺損[19]，而MMP-3可激活間質(zhì)膠原酶及其他蛋白酶原從而擴(kuò)大軟骨的破壞進(jìn)程[20]，TIMP-1則作為MMPs的抑制劑維持軟骨基質(zhì)動態(tài)平衡[21]。

本次研究中，MMP-1陽性、蛋白表達(dá)比較3種干預(yù)效果差異的趨勢表現(xiàn)為D>S>W，其中D組較W組降低(P<0.05)，而S組與W組，S組與D組差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明本研究KOA模型中電針較溫針更有利于降低MMP-1，從而保護(hù)軟骨基質(zhì)裂解與破壞，溫針與手針及手針與電針對調(diào)節(jié)MMP-1僅有效果趨勢而并無可靠證據(jù)證明效果差異。由MMP-3陽性表達(dá)比較可知，W、S和D 3組雖均較M組低，但D組較S、W組降低(P<0.05)，說明電針更有利于調(diào)節(jié)降低MMP-3。由TIMP-1陽性、蛋白表達(dá)比較可知，D組高于W、S和M組(P<0.05)，且各組效果趨勢仍然是D>S>W，而其恰好與3組在MMP-1、MMP-3中的趨勢相對應(yīng)，即MMP-1、MMP-3越低則相應(yīng)TIMP-1越高，說明溫針灸和電針、手針3種方法可能通過調(diào)節(jié)上升TIMP-1從而抑制MMP-1、MMP-3以達(dá)到緩解軟骨基質(zhì)裂解破壞的干預(yù)效果。

在本研究結(jié)果中，電針更有利于調(diào)節(jié)TIMP-1上升，且抑制MMP-1、MMP-3下降，這與一些臨床中關(guān)于溫針灸的研究結(jié)果相反[22-24]，這可能因?yàn)橹嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為KOA由氣滯血瘀、肝腎虧虛、風(fēng)寒濕痹和濕熱蘊(yùn)結(jié)等病因所致[25]，而本研究通過注射MIA所造大鼠KOA模型并不涉及風(fēng)寒、濕熱、肝腎虧虛這3種因素，而僅針對氣滯血瘀而設(shè)。故溫針灸、電針及手針的效果差異僅涉及活血、化瘀、通絡(luò)和止痛這幾個(gè)方面，結(jié)果顯示電針效果高于手針高于溫針灸，這僅說明電針與手針治療更傾向于單純活血化瘀止痛，溫針灸的熱性可能不利于單純的局部炎癥反應(yīng)，這是因?yàn)榕R床收集的KOA病例多為年齡偏大的患者，《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“女子，五七陽明脈衰”“丈夫，六八陽氣衰竭于上”,偏于中年的患者其KOA病機(jī)多有陽虛因素，這是臨床研究的局限性，這也是本研究的優(yōu)勢，將復(fù)雜因素剝離，單純探討不同針刺手法的具體療效，更有利于發(fā)掘針刺的療效與機(jī)制，并用以指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

綜上所述,電針、溫針灸和手針3種方法均能有效降低MMP-1、MMP-3同時(shí)升高TIMP-1，但相比之下，電針更有可能調(diào)節(jié)上升TIMP-1從而抑制MMP-1、MMP-3，手針方法次之，溫針灸效果則略遜于前兩者。本研究下一步將嘗試以風(fēng)寒、濕熱和肝腎虧虛等不同因素造模，進(jìn)一步研究不同針灸方法干預(yù)敏化穴位對KOA的具體療效差異，并深入研究軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中MMPs和TIMP與炎性因子的影響關(guān)系。