基于免疫學微流控芯片快速檢測病原體的研究進展

李斌，劉程，田亞晨，劉箐，李代禧，黃笑天，劉濤，楊昊

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海，200093)

食品安全關系到每個人的發(fā)展和生存，早期快速的檢測食源性致病菌可避免病原微生物感染所引起的爆發(fā)性食源性疾病[1]?，F(xiàn)有的培養(yǎng)鑒定法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)及聚合酶鏈式反應等檢測方法需要專業(yè)人士及設備，既昂貴又費時。因此，急需尋求一種簡單、快速及高靈敏度的病原微生物檢測方法[2]。

微流控芯片提供了一種經濟省時的檢測方式，可在極低濃度對食源性致病菌進行快速檢測[3]。微流控是一種在微米級尺度下進行樣品輸送、反應及檢測的一種技術，具有檢測速度快、靈敏度高、高通量、集成度及自動化高的優(yōu)點[4-5]。目前，微流控檢測芯片按照檢測原理主要分為基于分子生物學的微流控檢測芯片、基于電化學的微流控檢測芯片及基于免疫學的微流控檢測芯片3大類。其中，基于免疫學的微流控檢測芯片以抗原抗體特異性結合為基礎原理，具有檢測條件寬松、靈敏度高及速度快的特點。免疫微流控檢測芯片結合比色法避免了使用外部設備，可對食源性致病菌[6]、疾病標志物[7]、毒素[8]及激素[9]等多種生物分子進行檢測，已廣泛應用于食品檢測、環(huán)境保護及臨床診斷等領域[10]。

本課題組致力于將免疫檢測技術集成于微流控芯片上進行食源性致病菌的快速檢測,已開發(fā)出可檢測大腸桿菌及鮑氏志賀氏菌的免疫微流控檢測芯片并在進行后續(xù)優(yōu)化。研究表明，芯片基底均需不同程度的表面改性處理才可固定抗體用于免疫分析。如聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)的微通道需進行超聲清洗及等離子氧化等處理以減少非特異性吸附，避免出現(xiàn)假陽性；紙基襯底由于其多孔親水等特性，可通過干燥固定免疫分析所用試劑，但當通過表面修飾偶聯(lián)抗體時才能對食源性致病菌有較好的捕獲效率。其次，基底的光學性能及生物相容性等對芯片的應用場景有著基礎性影響，同時決定著芯片的成本、加工及組裝工藝?；诖?，本文綜述了近年來免疫微流控檢測芯片在病原微生物即時檢測中的研究進展，主要集中在硅基免疫微流控檢測芯片、高分子聚合物免疫微流控檢測芯片及紙基免疫微流控檢測芯片3部分。最后，討論了免疫微流控檢測芯片目前面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展機遇。

1 硅基免疫微流控檢測芯片

硅基免疫微流控檢測芯片是以免疫學檢測為基礎，以硅片、玻璃或石英等為基礎制備的免疫微流控檢測芯片。20世紀90年代，MANZ等[11]以硅片為基底首次制備出微流控芯片。由于微流控技術源于微機電技術，成熟的微細加工技術使硅成為早期免疫微流控檢測芯片的常用基底。

硅基片具有良好的生物相容性、化學惰性、導熱性和熱穩(wěn)定性[12]，對其表面改性可用于固定抗體進行免疫檢測[13]。KIM等[14]開發(fā)了一種用于檢測沙門氏菌的硅基免疫微流控檢測芯片(圖1-A)。該微流控檢測芯片含有1個蛇形通道(400 μm×50 μm，長×寬)，1個檢測區(qū)、3個進樣孔及1個出樣孔。結合沙門氏菌抗體的量子點預裝在一個進樣孔，磁球與樣品的混合溶液裝入另一進樣孔。兩種溶液在負壓下進入蛇形槽中混合和孵育，改性后的硅表面可配合固定抗體微球復合物不被輕易沖走，從而進行病原微生物的富集與分離。最后，形成的復合物在永磁體的作用下進入檢測區(qū)進行熒光信號檢測。該芯片對10份樣品進行了特異性檢測，靈敏度達到103CFU/mL。LI等[15]開發(fā)了一種用于檢測金黃色葡萄球菌的硅基免疫微流控檢測芯片(圖1-B)。硅基片在銀輔助化學刻蝕下形成了3D納米線基板，經表面化學修飾后用于檢測病原微生物(圖1-C)。相對于扁平化修飾的硅基片，三維立體硅基板經表面修飾后對金黃色葡萄球菌的捕獲率增大了10倍，未修飾的硅基片幾乎沒有非特異性吸附。研究人員在使用3種不同的培養(yǎng)基進行金黃色葡萄球菌的檢測時，捕獲率均在90%左右，靈敏度達到10 CFU/mL。

A-沙門氏菌硅基微流控檢測芯片[14]；B-金黃色葡萄球菌硅基免疫微流控檢測芯片制備原理[15]； C-金黃色葡萄球菌硅基免疫微流控芯片制備及檢測原理[15]圖1 硅基免疫免疫微流檢測芯片F(xiàn)ig.1 Silicon-based immunoimmunity microfluidic detection chip

除表面改性外，硅也可通過加工形成多孔狀態(tài)(即多孔硅)來提高病原微生物的捕獲率。這是因為多孔硅具有更高的比表面積來固定抗體進行免疫檢測[16]。然而，多孔硅具有易碎、不透明、彈性模量高(130～180 GPa)及昂貴等缺點。高彈性模量使其難以開發(fā)微閥等微器件，不透明性則導致其難以進行可視化結果輸出，這導致其較少用于免疫微流控檢測芯片的開發(fā)應用中。

與硅基片相比，玻璃更便宜且擁有不錯的光學透明性。在加工方面，玻璃可通過蝕刻和光刻工藝形成微通道。組裝時，玻璃芯片常通過熱鍵合貼合密封通道。但熱鍵合容易造成玻璃微通道的變形，使得該組裝方式下的玻璃免疫微流控檢測芯片成品率較低[17]。因此，有研究人員將玻璃與聚合物貼合組裝免疫微流控檢測芯片。例如，ABDULLAH等[18]開發(fā)了一種玻璃基免疫微流控芯片，用于大腸桿菌及沙門氏菌的快速檢測(圖2-A)。該芯片通過濕法刻蝕等微加工工藝在玻璃基底上制備出微通道、富集區(qū)，檢測區(qū)及4個進出樣口。通過彈性聚合物聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)密封通道不會損壞微通道，也不會對后續(xù)的抗體固定化及免疫分析造成影響(圖2-B)。捕獲抗體事先通過共價結合在修飾后的玻璃表面，檢測抗體通過非特異性吸附固定在檢測電極上。檢測時，先注入檢測抗體將其固定。洗滌后，通入含有病原菌的樣品溶液并調節(jié)電極參數(shù)富集病原菌。最后，芯片內斜向下的電極將富集的病原菌推向檢測區(qū)。檢測區(qū)電極上檢測抗體與病原菌結合，通過檢測電極的阻抗變化來確定樣品中的病原菌含量，大腸桿菌和沙門氏菌的檢測限分別達到了10、13 cell/mL。

此外，玻璃也可用于開發(fā)數(shù)字免疫微流控檢測芯片。玻璃數(shù)字免疫微流控檢測芯片以液滴為對象，在玻璃基底上形成圖案并固定電極，通過電極上適宜的電位序列精確操控液滴，完成混合、分離及反應等實驗操作[19]。與通道型免疫微流控芯片相比，數(shù)字免疫微流控芯片能夠保證磁球等微固體流動時不發(fā)生堵塞通道的風險。COUDRON等[20]研制的數(shù)字免疫微流控系統(tǒng)集抗體固定、抗原檢測、磁分離及信號輸出等操作于一體，實現(xiàn)了病原微生物的全自動化免疫檢測(圖2-C)。運行時依次將捕獲抗體包被的磁珠、抗原及檢測抗體通入芯片，并使用通用平行板配置運行。該平行板可將1.5～3 μL的液滴夾在傳動板和導電接地蓋板的疏水表面之間，從而完成磁珠的提取、再懸浮及混合等操作。與基于流動的微流體相比，該芯片可在沒有高剪應力的情況下快速改變磁珠濃度以完成抗原的富集和檢測?；瘜W發(fā)光輸出檢測結果，發(fā)光強度取決于抗原捕獲量。為驗證其性能，該芯片以大腸桿菌、芽孢桿菌及噬菌體病毒為靶標進行了全自動檢測，檢測限分別為2×107CFU/mL、4×104CFU/mL及106PFU/mL。該芯片采用全自動化磁分離，將檢測時間縮短至6～10 min，解決了傳統(tǒng)免疫學檢測的的勞動密集型缺點。目前，玻璃基數(shù)字免疫微流控檢測芯片已廣泛應用于免疫分析及細胞研究等領域[21]。

A-玻璃免疫微流控檢測芯片[18]；B-濕法刻蝕和熔融黏合制造微芯片[18]；C-數(shù)字微流控芯片設計概覽及運行中的數(shù)字微流控芯片[20]圖2 硅基免疫微流控檢測芯片F(xiàn)ig.2 Silicon-based immunomicrofluidic detection chip

除硅片和玻璃免疫微流控外，石英基免疫微流控檢測芯片也被開發(fā)出來用于食源性致病菌的快速檢測。石英同樣具有良好的化學惰性、生物相容性及耐有機溶劑等優(yōu)點，且擁有最優(yōu)秀的光學特性[22]。然而，石英需經過復雜的表面處理才可用于固定抗體。此外，石英免疫微流控檢測芯片的加工工藝復雜，費用昂貴。這導致石英大多用于單分子檢測等特殊檢測領域，較少的用于食源性致病菌檢測。

綜上所述，硅基免疫微流控檢測芯片具有加工精度及檢測靈敏度較高的特點，但復雜的加工工藝及高成本導致硅基免疫微流控檢測芯片多用于實驗室科研[23]。雖然硅基底可與聚合物結合用于制備微泵、微閥等微器件以適應免疫微流控檢測芯片高集成的要求，但這卻削弱了玻璃和石英良好的光學性能等優(yōu)勢[24]。

2 聚合物免疫微流控檢測芯片

聚合物免疫微流控檢測芯片指的是以高分子聚合物為基底，以免疫學檢測為基礎開發(fā)的微流控檢測芯片[25]。聚合物免疫微流控檢測芯片具有價格低、品類多、彈性優(yōu)良、生物相容性及光學透明性好等優(yōu)點[26]，是硅基免疫微流控檢測芯片的替代品。常見的聚合物免疫微流控檢測芯片主要有PDMS、PMMA、聚碳酸酯(polycarbonate，PC)及聚苯乙烯(polystyrene，PS)免疫微流控檢測芯片。其中，PDMS可跟PDMS、玻璃、石英或其他聚合物通過鍵合等方式結合在一起制備免疫微流控芯片，具有加工簡便、成本低和可大規(guī)模制備等特點。EFFENHAUSER等[27]于20世紀90年代末首次開發(fā)出PDMS微流控芯片，軟光刻技術的出現(xiàn)則推動了PDMS免疫微流控檢測芯片的快速發(fā)展，是目前應用最為廣泛的聚合物免疫微流控檢測芯片之一[28]。

值得注意的是，PDMS的彈性模量低(300～500 kPa)，可用于制造微泵、微閥、微混合器及微檢測器等微器件[29]。CAI等[30]開發(fā)了一種一次性視覺免疫微流控檢測芯片，采用免疫磁分離、酶催化和距離指示技術檢測食源性致病菌(圖3-A)。該微流控檢測芯片主體為PDMS，含有1個動力驅動孔、3個進出樣孔、2個儲液室、微混合區(qū)及距離指示通道。芯片內微混合器固定有抗體修飾的磁球，用于富集樣品中的鼠傷寒沙門氏菌。富集后的復合物與抗體和過氧化氫酶共同修飾的聚苯乙烯微球偶聯(lián)，形成免疫磁球-細菌-聚苯乙烯酶夾心復合物。復合物上的過氧化氫酶通過微型混合器后催化過氧化氫分解生成氧氣，產生的氧氣增加了芯片中的壓力，并推動指示紅色染料溶液沿著通道向未密封的出口移動，通過移動距離反映樣品中鼠傷寒沙門氏菌的數(shù)量。該免疫微流控芯片內制備的微混合器通過富集病原微生物使其檢測靈敏度達到了150 CFU/mL，基于視覺輸出檢測結果而不需要外部設備。

然而，PDMS等表面疏水的聚合物易導致疏水分子的非特異性吸附和滲透，影響檢測結果的可靠性。因此，研究人員通過聚合物表面改性或使用聚合物微球來固定抗體以適應免疫微流控檢測芯片的開發(fā)。

ALTINTAS等[31]設計并制造了一種用于大腸桿菌全自動檢測的免疫微流控檢測芯片，研究了聚合物表面改性后修飾納米顆粒對抗體固定的影響(圖3-C)。一方面，芯片基底經表面改性后直接固定抗體，采用抗體-細菌-抗體的標準夾心法檢測大腸桿菌。另一方面，芯片基底表面改性后引入納米顆粒固定抗體。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記另一抗體作為檢測抗體，在細菌被捕獲后形成固定化的納米顆?？贵w-細菌-酶標抗體夾心體，HRP催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)產生氧化還原信號輸出。結果表明，引入納米顆粒后的微流控免疫檢測芯片對大腸桿菌的檢出限為50 CFU/mL，與未引入納米顆粒的標準夾心法相比，靈敏度提高了近400倍。王嶺[32]開發(fā)了一種PS免疫微流控檢測芯片，用于玉米萎蔫病菌的快速檢測(圖3-D)。該芯片通過熱壓鍵合黏合基板，中間夾層的PS薄膜微閥可控制流體進出。檢測時樣品被干燥在芯片內部，通過微閥依次泵入HRP標記的抗體及洗液，最后加入顯色底物顯色完成檢測。該芯片在程序軟件及PS薄膜微閥的配合下實現(xiàn)了致病菌的全自動免疫檢測。該芯片與傳統(tǒng)ELISA法的檢測靈敏度相當，但試劑消耗量減少了25倍，時間降低了10倍。CHOI等[33]開發(fā)了一種自動化快速檢測瘧原蟲的免疫微流控芯片(圖3-E)。該芯片的PC薄膜基底經表面改性后用于捕獲抗體的固定化，熒光標記的檢測抗體則被噴射在反應室中。樣品中的目標抗原注入芯片后首先與檢測抗體結合，之后流向檢測室與捕獲抗體結合形成抗體-抗原-熒光標記抗體復合物，通過熒光信號輸出檢測結果。通過改性后的PC薄膜固定抗體使其靈敏度達到了50 ng/mL，高于商用試劑盒的靈敏度(200 ng/mL)。雖然聚合物免疫微流控檢測芯片經表面處理或集成微器件提高了檢測靈敏度，降低了檢測時間，但離不開復雜的加工及組裝設備。同時，在抗體固定化方面前處理步驟過多，或許紙基免疫微流控檢測芯片能更好的處理該問題[34]。

A-視覺免疫微流控檢測芯片實物圖及其概念圖[30]；B-視覺免疫微流控芯片檢測原理[30]；C-免疫微流控芯片設計圖及其檢測原理[31]； D-PS免疫微流控芯片結構圖[32]；E-PC薄膜免疫微流控芯片結構圖及檢測流程[33]圖3 聚合物免疫微流控檢測芯片F(xiàn)ig.3 Polymer immunomicrofluidic detection chip

3 紙基免疫微流控檢測芯片

紙基免疫微流控芯片又稱“紙芯片”，是一種利用紙(如濾紙和硝酸纖維素膜等)替代傳統(tǒng)的硅基底或聚合物基底進行免疫檢測的微流控芯片。紙是由纖維素組成的高度多孔基質，與硅、玻璃、石英及高分子聚合物等微流控檢測芯片基底相比具有以下優(yōu)點：(1)原料豐富，成本低；(2)環(huán)保無害，可通過焚燒、生物降解等方式處理；(3)使用靈活，紙的多孔性結構允許進行流體的流動、過濾及分離等操作；(4)良好的親水性；(5)可一次性使用和大規(guī)模生產[35-37]。因此，紙基免疫微流控檢測芯片已廣泛應用于食品安全、環(huán)境檢測及臨床診斷等領域。

在加工工藝方面，紙基免疫微流控檢測芯片可通過噴墨印刷、柔性版印刷及蠟印刷等印刷技術或光刻、沖壓、剪切和壓印等其他加工技術來制備[38]。其中，蠟網印刷是紙基免疫微流控芯片制應用較為普遍的一種加工方式。蠟印可在紙基表面建造疏水屏障和親水通道，具有制備簡便、成本低且無需密封通道的特點[39]。由于親水通道和疏水屏障的毛細效應，紙基免疫微流控檢測芯片在進行免疫分析時無需外部設備，實現(xiàn)了免疫檢測的低成本和便攜性。紙的高比表面積微孔結構和易于表面改性等優(yōu)勢使其可用于抗體固定、抗原抗體的孵育結合及化學發(fā)光反應等實驗，更有利于制備免疫微流控檢測芯片[40]。

一般情況下，紙基免疫微流控檢測芯片由一層紙制成，僅限于二維通道網絡。當將兩層或多層紙基底疊加在一起時，會產生基于紙襯底的三維紙基免疫微流控檢測芯片，允許流體在三維空間進行流動。由于紙張很薄，將多張紙堆疊在一起可增加通道密度，而不會改變設備大小。這使得三維紙基免疫微流控檢測芯片能夠在更短的時間內完成更復雜的流體處理。如圖4所示，

A-三維紙基芯片制備原理[41]；B-三維紙基芯片檢測沙門氏菌原理圖(a-紙芯片檢測原理，b-紙芯片折疊原理)[41]； C-紙基免疫微流控芯片結合智能手機檢測病原菌(a-入射光角度，b-檢測光角度)[41]；D-紙基免疫微流控芯片結合旋轉框架結構圖及實物圖[41]圖4 紙基免疫微流控檢測芯片F(xiàn)ig.4 Paper-based immunomicrofluidic detection chip

CHEN等[41]開發(fā)了一種三維折紙免疫微流控檢測芯片(圖4-A)。該芯片通過蠟印制備疏水區(qū)域，分別通過表面干燥和表面改性固定免疫分析所用試劑。折疊滑動芯片可使分析物在各紙層間進行垂直擴散，輕松執(zhí)行免疫分析所需步驟，極大的提高了檢測效率。在實際應用性能方面，該芯片成功檢測到樣品中的金黃色葡萄球菌。在以人免疫蛋白作為模型對三維折紙免疫微流控檢測芯片進行優(yōu)化后，檢測時間最短縮短至7 min，檢測限達到了0.01 ng/mL。相比傳統(tǒng)的ELISA、熒光免疫檢測、免疫熒光法及斑點ELISA等免疫檢測方式，上述三維折紙免疫微流控檢測芯片的檢測效率更高，在食源性致病菌的快速檢測上具有極大的應用潛力。

比色法作為一種簡單的檢測策略，常與紙基免疫微流控檢測芯片結合使用，降低了紙基免疫微流控檢測芯片的成本并提高了其便攜性[42]。然而，傳統(tǒng)的比色法僅能進行定性分析，低靈敏度和高檢測限制了紙基免疫微流控檢測芯片的更大規(guī)模應用。因此，有研究人員通過改變紙基免疫微流控芯片的信號輸出模式來定量檢測病原微生物。例如，PARK等[43]開發(fā)了一種與智能手機相結合檢測沙門氏菌的紙基免疫微流體檢測芯片(圖4-C)。紙基底經光刻蝕刻形成微通道，在通道內預裝抗鼠傷寒沙門氏菌的抗體標記的微粒形成檢測區(qū)。檢測時將紙質微流控裝置浸入含有鼠傷寒沙門氏菌的溶液中，預裝在芯片內的抗體微粒與菌結合形成微粒-細菌復合物。檢測區(qū)的光散射強度與樣品中病原微生物數(shù)量呈反比，通過簡單的圖像處理和算法計算后得出細菌濃度，實現(xiàn)了紙基免疫微流控芯片對沙門氏菌的定量檢測。該紙基免疫微流控芯片的檢測下限為100 CFU/mL，總檢測時間<1 min，遠低于ELISA等傳統(tǒng)方法定量檢測食源性致病菌所需1 h或過夜的檢測時間。

相對于單一紙基底的免疫微流控檢測芯片來說，引入3D打印結合聚合物制備的紙基免疫微流控檢測芯片能夠使兩者優(yōu)勢互補，更有利于食源性致病菌的快速檢測[44]。例如，CARRELL等[45]開發(fā)了一種紙與3D打印旋轉框架相結合可重復使用的免疫微流控芯片，用以沙門氏菌的快速檢測(圖4-D)。該免疫微流控檢測芯片通過紙基襯底快速而準確的固定顯色底物修用以檢測結果的信號輸出，而不需要復雜的表面修飾。3D旋轉聚合物框架則用于放置紙基芯片，在離心力的作用下驅動溶液的流動進行洗滌，實現(xiàn)了試劑的輸送、洗滌和檢測自動化。檢測時從樣品孔注入含有病原菌的樣品溶液，修飾后的紙基芯片結合外部永磁體固定免疫磁球對病原菌進行富集。洗滌后加入生物素標記的檢測抗體，形成免疫磁球-細菌-檢測抗體復合物。該復合物表面含生物素，可與帶有鏈霉親和素的半乳糖苷酶相結合。最終，半乳糖苷酶與固定好的顯色底物發(fā)生反應，芯片由黃變紅即表明樣品中含有病原菌。該免疫微流控檢測芯片以沙門氏菌為目標病原菌，分別在培養(yǎng)基和牛奶中進行培養(yǎng)，檢出限分別達到了4.4×102、6.4×102CFU/mL。該紙基微流控芯片與傳統(tǒng)的紙基分析設備相比，避免了洗滌步驟而沒有影響其檢測性能，為商業(yè)化提供了一種實用的產品。

4 總結與展望

綜上所述，本文討論了基于免疫學的微流控芯片在食源性致病菌快速檢測方面的應用與進展,介紹了各免疫微流控檢測芯片特性(表1)及其相應的免疫微流控檢測芯片在病原微生物上的檢測性能(表2)。免疫微流控檢測芯片在病原微生物的快速檢測上具有傳統(tǒng)檢測方法無法比擬的顯著優(yōu)點，例如試劑和樣品的低消耗量、成本低、檢測環(huán)境要求低、檢測速度快、高通量、高度集成及操作自動化等。此外，由于免疫微流控檢測芯片具有高比表面及抗體固定化等優(yōu)勢，檢測時間大大縮短，檢測靈敏度也得到了提高。

表1 常見3種免疫微流控檢測芯片的特性Table 1 Performance comparison of 3 common immune microfluidic chips

表2 免疫微流控檢測芯片的性能比較Table 2 Comparison of commonly used immune microfluidic detection chips

值得注意的是，雖然免疫微流控檢測技術發(fā)展?jié)摿薮螅杂幸恍┨魬?zhàn)阻礙其大規(guī)模應用。首先，制備并組裝芯片并沒有設計時看上去那么簡單，需用光刻機和真空熱壓鍵合機等專業(yè)機器及嚴格的加工工藝。其次，芯片內可能出現(xiàn)的死體積使得檢測結果存在不穩(wěn)定性，長期的低溫存儲也會對預裝載試劑造成損害，用于結果輸出的外部設備也使其檢測的便攜性受到影響。目前，大多數(shù)免疫微流控檢測芯片僅用于病原體的快速定性檢測，在區(qū)分活菌和死菌方面仍有待研究。因此，免疫微流控檢測芯片在開發(fā)時應簡化制備方法，去除死體積的影響來增加結果的可靠性。在輸出結果時減少使用外部設備或開發(fā)小型化外部設備，將微流控芯片的便攜性最大化。同時，探索能夠區(qū)分活菌與死菌的免疫微流控芯片研究方案，進一步提高其應用性能。在免疫微流控檢測芯片開發(fā)時若能考慮并解決上述問題，那么最終開發(fā)的免疫微流控檢測芯片將有更廣泛的應用并對基礎科學研究產生重大影響。