響應(yīng)面法優(yōu)化仙人掌果-紅心火龍果酒發(fā)酵工藝

王 鵬

（威海海洋職業(yè)學(xué)院 食品與藥品系，山東 威海 264300）

仙人掌（Opuntia stricta）屬于仙人掌科仙人掌屬，在福建、廣西、云南、海南等地均有分布，仙人掌果是仙人掌的果實(shí)，果肉呈紫紅色，口感酸甜、清新、風(fēng)味獨(dú)特，含有豐富的微量元素、黃酮類(lèi)、果膠、多糖、有機(jī)酸、氨基酸、多糖、色素和維生素等[1-3]。此外，仙人掌果具有活血祛濕、清熱解毒、清除自由基、抗衰老、抗腫瘤抗癌、降三高等功效[4-6]。火龍果（Hylocereus undulatus）又名紅龍果，與仙人掌同屬于仙人掌科，在我國(guó)海南、廣東、廣西、福建等地均有種植。紅皮火龍果根據(jù)果肉的顏色可分為紅皮白心和紅皮紅心兩大類(lèi)[7-8]?；瘕埞胸S富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、多酚、花青素、膳食纖維、維生素、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且顏色鮮亮、口感細(xì)膩多汁、香氣濃郁，經(jīng)研究表明紅心火龍果的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和色澤均優(yōu)于白心火龍果[9-11]，且具有更好的生理活性功能，在預(yù)防心腦血管疾病、糖尿病、高血壓、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)激素水平方面具有良好的功效[12-14]。

復(fù)合果酒是以?xún)煞N或兩種以上新鮮水果為原料，通過(guò)控制酵母菌發(fā)酵制得的低酒精度果酒，不僅保持了各種水果的風(fēng)味，還可以營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)，使得水果中的營(yíng)養(yǎng)成分得到更好的吸收。史曉華等[15]以仙人掌果和黑枸杞為原料，采用酒精度和感官評(píng)定為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)確定果酒最佳發(fā)酵工藝，制得一款富含黃酮和花青素，酒精度為12.0%vol的風(fēng)味獨(dú)特復(fù)合果酒；喬夢(mèng)丹等[16]以人參和仙人掌果為原料，采用酒精度作為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化果酒最佳發(fā)酵工藝，制得一款富含總皂苷和總花青素，酒精度為11.67%vol低度發(fā)酵復(fù)合果酒；鄧紅梅等[17]以龍眼和紅肉火龍果為原料，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化果酒發(fā)酵工藝，制得一款含有7種有機(jī)酸的低酒精度健康復(fù)合果酒。目前國(guó)內(nèi)外鮮有將仙人掌果和紅心火龍果復(fù)合開(kāi)發(fā)保健果酒的案例，因此，該研究將屬于同科的仙人掌果和紅心火龍果結(jié)合，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合果酒發(fā)酵工藝，以期為制得兼具感官品質(zhì)和保健功能的復(fù)合果酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仙人掌果、紅心火龍果：市售；X16酵母、LAFASEFRUIT果膠酶（60 000 U/g）：法國(guó)LAFFORT公司；硅藻土：寧波鼎創(chuàng)新材料有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PR224ZH/E電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：浙江一恒教學(xué)儀器有限公司；SGW-756全自動(dòng)折光儀：上海精密實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LRH-150F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HR2826打漿機(jī)：飛利浦（中國(guó)）投資有限公司；SEGL-5冷凍過(guò)濾機(jī)：溫州中環(huán)機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 仙人掌果-紅心火龍果酒發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

仙人掌和紅心火龍果鮮果→去皮處理→混合打漿→調(diào)整成分→酶解→發(fā)酵→過(guò)濾澄清→果酒

操作要點(diǎn)：

預(yù)處理：選擇成熟度高且新鮮的仙人掌果和紅心火龍果，去除果皮，分別保留紫紅色果肉。

破碎打漿：將仙人掌果果肉和紅心火龍果果肉按照1∶1的質(zhì)量比混合放入打漿機(jī)中，加入純凈水，打成勻漿。

調(diào)整成分：向勻漿中加入0.03%的抑菌劑焦亞硫酸鉀；加入白砂糖調(diào)節(jié)勻漿的糖度為22°Bx，攪拌均勻；控制pH值為3.4左右。

酶解：將0.3%果膠酶添加于調(diào)整成分后的勻漿中，并在45 ℃條件下水浴2～3 h。

發(fā)酵：將0.03%的X16酵母接種到酶解液中，在溫度24 ℃條件下，發(fā)酵周期為6～10 d，每24 h測(cè)定酒精度和糖度的變化量，當(dāng)二者不再發(fā)生變化時(shí)，判定為發(fā)酵結(jié)束。

過(guò)濾澄清：將1.5 g/100 mL的硅藻土添加到發(fā)酵液中，200 Hz超聲波澄清12 min后，用冷凍過(guò)濾機(jī)過(guò)濾，得到澄清果酒液。

1.3.2 仙人掌果-紅心火龍果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)

（1）單因素試驗(yàn)

采用單因素輪換法，分別考察果肉質(zhì)量比（仙人掌果果肉質(zhì)量∶紅心火龍果果肉質(zhì)量=3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3），焦亞硫酸鉀添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%），酵母接種量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%），發(fā)酵溫度（20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃），初始糖度（18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx、26°Bx）對(duì)仙人掌果-紅心火龍果酒酒精度及感官評(píng)分的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取對(duì)酒精度影響較大的發(fā)酵溫度（A）、初始糖度（B）、酵母接種量（C）為自變量，以酒精度（Y）為響應(yīng)值，采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，并用Design-Expert 10.0專(zhuān)業(yè)版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化。

1.3.3 測(cè)定方法

酒精度、總酸、揮發(fā)性酸檢測(cè)方法參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定[18]；微生物指標(biāo)檢測(cè)方法參考GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[19]。

感官評(píng)分：請(qǐng)由15位高級(jí)品酒師組成的感官評(píng)分小組，參照葡萄酒感官評(píng)定要求[18]，采用無(wú)記名評(píng)分方式對(duì)色澤、香氣、滋味和典型性進(jìn)行綜合評(píng)分，滿(mǎn)分100分，取其平均值，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 仙人掌果-紅心火龍果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of cactus and red pitaya fruit wine

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010和Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 果肉質(zhì)量比對(duì)仙人掌果-紅心火龍果酒發(fā)酵的影響

由圖1可知，隨著果肉質(zhì)量比的改變，果酒酒精度基本保持在11.80%vol左右，隨著火龍果果肉質(zhì)量比例的增加，當(dāng)果肉質(zhì)量比達(dá)到1∶1時(shí)，仙人掌果-紅心火龍果酒的感官評(píng)分達(dá)到最大值（94.5分），繼續(xù)提高火龍果果肉質(zhì)量比例，果酒感官評(píng)分下降，仙人掌果肉質(zhì)量比例較大時(shí)，果酒清新度好但香氣不足，火龍果肉質(zhì)量比例較大時(shí)，果酒香氣較好但清新度差。因此，果酒較為適宜的果肉質(zhì)量比是1∶1。

圖1 果肉質(zhì)量比對(duì)果酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of pulp mass ratio on alcohol content and sensory score of the fruit wine

2.1.2 焦亞硫酸鉀對(duì)仙人掌果-紅心火龍果酒發(fā)酵的影響

由圖2可知，隨著焦亞硫酸鉀添加量的增加，仙人掌果-紅心火龍果酒的酒精度和感官評(píng)分隨之升高，當(dāng)焦亞硫酸鉀添加量達(dá)到0.03%時(shí)，酒精度和感官評(píng)分均達(dá)到最大值，分別為11.82%vol和95.5分，繼續(xù)增加焦亞硫酸鉀，會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)，不利于酒精的產(chǎn)生，使酒精度下降，同時(shí)較多的焦亞硫酸鉀會(huì)造成感官質(zhì)量的下降。因此，果酒較為適宜的焦亞硫酸鉀添加量是0.03%。

圖2 焦亞硫酸鉀對(duì)果酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of potassium metabisulfite on alcohol content and sensory score of the fruit wine

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)仙人掌果-紅心火龍果酒發(fā)酵的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，仙人掌果-紅心火龍果酒的酒精度和感官評(píng)分升高，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到24 ℃時(shí)，仙人掌果-紅心火龍果酒的酒精度和感官評(píng)分均達(dá)到最大值，分別為11.75%vol和95分，繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，酵母菌生長(zhǎng)旺盛，在相同的發(fā)酵時(shí)間下提前衰老，致使酒精度下降，并伴隨酸味產(chǎn)生，感官評(píng)分降低[20-21]。因此，果酒較為適宜的發(fā)酵溫度是24 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)果酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of the fruit wine

2.1.4 初始糖度對(duì)仙人掌果-紅心火龍果酒發(fā)酵的影響

由圖4可知，隨著初始糖度的升高，仙人掌果-紅心火龍果酒的酒精度和感官評(píng)分升高，當(dāng)初始糖度達(dá)到22°Bx時(shí)，滿(mǎn)足酵母菌發(fā)酵所需營(yíng)養(yǎng)，仙人掌果-紅心火龍果酒的酒精度和感官評(píng)分均達(dá)到最大值，分別為11.81%vol和94.5分，繼續(xù)增加初始糖度，酒精度呈下降趨勢(shì)，初始糖度的升高使果酒中滲透壓增大，不利于酵母菌的發(fā)酵，另外甜度的升高也降低了感官評(píng)分[22]。因此，果酒發(fā)酵較為適宜的初始糖度是22°Bx。

圖4 初始糖度對(duì)果酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of initial sugar concentration on alcohol content and sensory score of the fruit wine

2.1.5 酵母接種量對(duì)仙人掌果-紅心火龍果酒發(fā)酵的影響

由圖5可知，隨著酵母菌接種量的增加，仙人掌果-紅心火龍果酒的酒精度和感官評(píng)分升高，當(dāng)酵母接種量達(dá)到0.03%時(shí)，仙人掌果-紅心火龍果酒的酒精度和感官評(píng)分均達(dá)到最大值，分別為11.79%vol和95分，繼續(xù)增加酵母接種量，過(guò)量的酵母消耗較多的糖分用于生長(zhǎng)繁殖，不利于酒精的產(chǎn)生，導(dǎo)致酒精度下降，整體風(fēng)味下降[23-24]。因此，果酒較為適宜的酵母接種量是0.03%。

圖5 酵母接種量對(duì)果酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.5 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of the fruit wine

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化無(wú)花果-仙人掌果酒發(fā)酵工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵溫度（A）、初始糖度（B）、酵母接種量（C）為3個(gè)評(píng)價(jià)因素，以酒精度（Y）為考察指標(biāo)，建立酒精度（Y）與3個(gè)因素的數(shù)學(xué)回歸方程，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化果酒關(guān)鍵發(fā)酵工藝參數(shù)[25-27]。果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析及顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3。

表2 仙人掌果-紅心火龍果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation technology optimization of cactus and red pitaya fruit wine

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

通過(guò)Design-Expert 10.0軟件對(duì)表2中酒精度（Y）指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，得到回歸模型二次多項(xiàng)方程：Y=11.86+0.071A+0.28B+0.30C-0.13AB-0.028AC+0.005BC-0.53A2-0.43B2-0.62C2。

由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1極顯著，而失擬項(xiàng)的P=0.178 0＞0.05不顯著，說(shuō)明本試驗(yàn)理論和實(shí)際值偏差很小，得到的回歸模型能夠很好地的預(yù)測(cè)響應(yīng)值。回歸方程一次項(xiàng)A、B、C、交互項(xiàng)AB、二次項(xiàng)A2、B2、C2均對(duì)復(fù)合果酒酒精度有極顯著影響（P＜0.01）。交互項(xiàng)AC、BC對(duì)結(jié)果無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。

2.3 因素間交互作用分析

各因素交互作用對(duì)仙人掌果-紅心火龍果酒酒精度影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6。

圖6 各因素交互作用對(duì)仙人掌果-紅心火龍果酒酒精度影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on alcohol content of cactus and red pitaya fruit wine

由圖6可知，固定酵母接種量為0水平時(shí)，發(fā)酵溫度和初始糖度之間的交互作用對(duì)酒精度（Y）有極顯著的影響（P＜0.01），當(dāng)發(fā)酵溫度和初始糖度均在0水平即（24 ℃）和（22°Bx）范圍內(nèi)，兩因子對(duì)酒精度的影響呈顯著正交互作用；而高于或低于0水平時(shí)，兩因子對(duì)酒精度的影響呈負(fù)交互作用，都會(huì)降低酒精度。發(fā)酵溫度和酵母接種量之間的交互作用以及初始糖度和酵母接種量之間的交互作用對(duì)酒精度（Y）均有影響，但都不顯著（P＞0.05）。

采用Design-Expert 10.0專(zhuān)業(yè)版對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，得到果酒的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度23.853 ℃，初始糖度22.160°Bx，酵母接種量0.032%，果酒酒精度的預(yù)測(cè)值為11.91%vol。為滿(mǎn)足實(shí)際可行性操作，將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為發(fā)酵溫度24 ℃，初始糖度22°Bx，酵母接種量0.03%，在此條件下平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到果酒實(shí)際酒精度為11.89%vol，與預(yù)測(cè)值的誤差為0.16%，二者基本一致，因此表明該工藝可行。

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)結(jié)果

2.4.1 感官指標(biāo)

在最佳條件下制得的仙人掌果-紅心火龍果酒清澈透明有光澤、無(wú)懸浮物、鮮艷紫紅色；酒香濃郁醇厚、果香突出、協(xié)調(diào)；具有典型火龍果果香及仙人掌果的清香；酒體醇厚、入口柔和、回味綿長(zhǎng)，感官評(píng)分達(dá)95.5分。

2.4.2 理化指標(biāo)

仙人掌果-紅心火龍果酒的酒精度11.89%vol，總酸含量（以乙酸計(jì)）為6.82 g/L，揮發(fā)酸含量（以乙酸計(jì)）為1.53 g/L，總糖含量為45.7 g/L。

2.4.3 微生物指標(biāo)

仙人掌果-紅心火龍果酒菌落總數(shù)26＜50 CFU/mL，大腸桿菌0＜3 MPN/100 mL，致病菌未檢出，符合國(guó)標(biāo)要求。

3 結(jié)論

該研究以酒精度為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定了各因素對(duì)果酒發(fā)酵的影響趨勢(shì)，并通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化仙人掌果-紅心火龍果酒發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度24 ℃，初始糖度22°Bx，酵母接種量0.03%，此條件下制得仙人掌果-紅心火龍果酒的酒精度11.89%vol，果酒的感官評(píng)分為95.5分，是一款營(yíng)養(yǎng)和感官價(jià)值俱佳的復(fù)合保健果酒。