培養(yǎng)基與分割發(fā)酵優(yōu)化促進(jìn)Nisin生物合成

劉月鋒，馮碧純，喬靖宇，熊華儀，陳 雄，李 沛，李 庫，唐冠群，王 志*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司 酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443003）

乳酸鏈球菌素（Nisin）是乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）等菌株產(chǎn)生的抗菌肽，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌和芽孢桿菌存在顯著抑制作用[1-2]，因其在生物體內(nèi)易于降解，因而不會(huì)引起生物耐藥性，被公認(rèn)為安全無毒的天然食品添加劑[3]。

Nisin是由34個(gè)氨基酸組成的多肽[4]，屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，但其合成卻顯示出初級(jí)代謝的特征并與細(xì)胞生長(zhǎng)耦聯(lián)[5-6]，因而Nisin高效合成依賴于較高的菌體密度[7]。作為兼性厭氧菌，乳球菌三羧酸循環(huán)不完整，糖酵解是主要的能量生成途徑[8]，因而其糖代謝產(chǎn)能效率并不高，細(xì)胞生物量合成所需營養(yǎng)分子基本來自環(huán)境吸收或吸收后進(jìn)一步合成，而非由糖代謝從頭合成[9]。另外，乳球菌糖代謝為同型乳酸發(fā)酵[10]，乳酸積累導(dǎo)致pH下降和酸脅迫效應(yīng)[11]，進(jìn)而抑制糖酵解效率、細(xì)胞生長(zhǎng)和Nisin合成效率[12]。因而，發(fā)酵后期菌體停止生長(zhǎng)甚至自溶的原因是酸脅迫以及Nisin對(duì)細(xì)胞代謝活性的抑制[13]，而不僅僅是營養(yǎng)耗損[14]，乳球菌有限的生物量和耐酸能力嚴(yán)重限制了其Nisin的生產(chǎn)能力[15]。乳球菌還是多種維生素、氨基酸的營養(yǎng)缺陷型[16]，并不能同化無機(jī)氮源。該菌株具有復(fù)雜的蛋白水解系統(tǒng)[17]，包括蛋白酶、氨基酸和肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及胞內(nèi)肽酶[18]，而且菌株間蛋白水解能力以及對(duì)氮源的利用能力存在較大差異[19]。

為了提高乳球菌細(xì)胞生長(zhǎng)和Nisin合成效率，本研究通過正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，并在搖瓶培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，考察能快速啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的分割發(fā)酵模式[20]對(duì)Nisin合成的影響，確定最適分割發(fā)酵工藝，為發(fā)酵生產(chǎn)Nisin提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、酵母浸粉（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；玉米漿、蔗糖（均為食用級(jí)）：市售；三水合磷酸氫二鉀、氯化鈉、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、檸檬酸三銨、輕質(zhì)碳酸鈣、濃硫酸、稀鹽酸、蒽酮（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Nisin標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 IU/mg）：美國Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基：1.5%胰蛋白胨，1.5%酵母浸粉，1.5%牛肉膏，1%葡萄糖，1%乙酸鈉，0.2%磷酸氫二鈉，0.2%檸檬酸三銨，1%輕質(zhì)碳酸鈣，2%瓊脂，pH 6.8。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：4%蛋白胨，2%蔗糖，1%玉米漿，0.2%磷酸氫二鉀，0.2%氯化鈉，0.02%七水硫酸鎂，0.005%一水硫酸錳，0.5%檸檬酸三銨，0.6%輕質(zhì)碳酸鈣，pH 6.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基：3%蛋白胨，1%酵母浸粉，2%蔗糖，1%玉米漿，0.2%磷酸氫二鉀，0.2%氯化鈉，0.02%七水硫酸鎂，0.005%一水硫酸錳，0.5%檸檬酸三銨，0.6%輕質(zhì)碳酸鈣，pH 6.8。

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：2%酵母浸膏，0.5%氯化鈉，2%瓊脂，pH 7.4～7.5。

上述培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SPX-150D恒溫生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；V-1300可見分光光度計(jì)：上海美析儀器有限公司；HNV-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：湖北鼎泰高科有限公司；S-10生物傳感器分析儀：深圳市西爾曼科技有限公司；CJ-2D無菌操作臺(tái)：天津泰斯特儀器有限公司；10 L機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

-80 ℃冰箱保存的乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）甘油管接斜面種子培養(yǎng)基的平板，30 ℃培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接茄子瓶（裝液量為60 mL/250 mL），30 ℃培養(yǎng)24 h，無菌操作加入60 mL無菌水，并用無菌竹簽將菌苔挑起混合于無菌水中，得到種子液，備用。

1.3.2 溫度和不同氮源對(duì)乳酸乳球菌生物量的影響

在28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃條件下，分別考察4%蛋白胨（單一氮源）、3%蛋白胨和1%酵母浸粉（復(fù)合氮源）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇培養(yǎng)基成分中蛋白胨（A）、蔗糖（B）、玉米漿（C）添加量為影響因素進(jìn)行L9（33）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分別以乳酸乳球菌生物量以及Nisin效價(jià)為考察指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for optimization of fermentation medium formula

1.3.4 搖瓶培養(yǎng)及10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)

以生物量以及Nisin效價(jià)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用優(yōu)化培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)。

搖瓶培養(yǎng)：裝液量為50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶接種種子液0.45 mL。置于30 ℃搖床間歇振蕩培養(yǎng)12 h（每小時(shí)200 r/min運(yùn)轉(zhuǎn)30 s后，轉(zhuǎn)速調(diào)為0 r/min）。

10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵：10 L發(fā)酵罐中裝7 L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種60 mL種子液，30 ℃、100 r/min不通氣培養(yǎng)20 h。

1.3.5 分割發(fā)酵

分割發(fā)酵指分批發(fā)酵達(dá)到一定程度后放料，并補(bǔ)加等量新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)的發(fā)酵方式，其具有快速啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的優(yōu)勢(shì)[20]。分割發(fā)酵過程為：使用優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基在10 L發(fā)酵罐進(jìn)行分批發(fā)酵（具體條件同1.3.4），Nisin效價(jià)達(dá)到峰值（0～18 h）后放料，放料體積比例為70%、75%、80%、85%（罐內(nèi)保留體積比例為30%、25%、20%、15%），后通氮?dú)猓榧嫘詤捬蹙娜樗崛榍蚓峁┛焖賳?dòng)生長(zhǎng)的厭氧環(huán)境）30 min的同時(shí)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，定容至7 L，繼續(xù)按30 ℃、100 r/min不通氣培養(yǎng)。

1.3.6 分析檢測(cè)

生物量（以細(xì)胞數(shù)計(jì)）測(cè)定：稀釋涂布平板法[21]；菌體對(duì)基質(zhì)消耗的得率系數(shù)（Yx/s）=生物量（108CFU/mL）/達(dá)到該時(shí)間點(diǎn)的總糖消耗量（g/L）；總糖（以蔗糖計(jì)）測(cè)定：硫酸-蒽酮法[22]；乳酸測(cè)定：生物傳感儀[23]；Nisin平均合成速率=Nisin效價(jià)（IU/mL）/達(dá)到該效價(jià)時(shí)的發(fā)酵時(shí)間（h）；產(chǎn)物對(duì)菌體的得率系數(shù)（Yp/x）=Nisin效價(jià)（IU/mL）/達(dá)到該時(shí)間點(diǎn)的最大生物量（108CFU/mL）。

Nisin效價(jià)測(cè)定：采用HPLC法。具體方法如下：

（1）樣品處理

發(fā)酵液用鹽酸稀釋至一定的倍數(shù)，pH在2.0～2.7之間[24]，12 000 r/min離心20 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。

（2）Nisin標(biāo)準(zhǔn)液制備以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取0.25 g Nisin標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，以0.01 mol/L的鹽酸溶液（pH2.0）定容，得到Nisin標(biāo)準(zhǔn)工作液（5000IU/mL）。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL至10mL容量瓶中，并用0.01 mol/L的鹽酸溶液（pH2.0）定容。得到系列Nisin標(biāo)準(zhǔn)液，其乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的最終效價(jià)分別為1 000 IU/mL、2 000 IU/mL、3 000 IU/mL、4 000 IU/mL、5 000 IU/mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濃度由低到高進(jìn)樣，以Nisin效價(jià)（x）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制Nisin標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）色譜條件

流動(dòng)相為水和乙腈以81∶19（V/V）混溶（加入0.05%三氟乙酸）；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3組平行試驗(yàn)均值，通過Origin 9.0和SPSS 23.0進(jìn)行作圖以及數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和氮源對(duì)乳酸乳球菌生物量的影響

考察4%蛋白胨（單一氮源）和以1%的酵母浸粉替代1%的蛋白胨（復(fù)合氮源，1%酵母浸粉+3%的蛋白胨）對(duì)乳酸乳球菌生長(zhǎng)代謝及菌體對(duì)基質(zhì)消耗的得率系數(shù)（Yx/s）的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同溫度和氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及菌體對(duì)基質(zhì)消耗的得率系數(shù)的影響Table 2 Effects of different temperature and nitrogen sources on the growth of bacteria and yield coefficient of substrate consumption

由表2可知，在28～35 ℃培養(yǎng)時(shí)，復(fù)合氮源生物量均比單一氮源生物量提高15%～45%左右，這可能與復(fù)合氮源的肽和氨基酸組成更能滿足細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[18]對(duì)肽分子質(zhì)量和氨基酸組成有關(guān)。復(fù)合氮源條件下30 ℃培養(yǎng)的峰值生物量為3.1×109CFU/mL，較28 ℃和35 ℃提高25%～30%，與32 ℃峰值生物量接近。

由表2可知，復(fù)合氮源條件下，30 ℃的Yx/s最高，較28 ℃、32 ℃和35 ℃分別提高52%、18.5%和39%。說明30 ℃是該菌株的最適生長(zhǎng)溫度，與SAFARI R等[25]報(bào)道一致。在各個(gè)溫度條件下，復(fù)合氮源相對(duì)于單一氮源的Yx/s均有提高，在最適生長(zhǎng)溫度30 ℃條件下，復(fù)合氮源Yx/s較單一氮源提高78%。進(jìn)一步說明了復(fù)合氮源條件下細(xì)胞利用基質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率高于單一氮源。

因此，確定發(fā)酵氮源組成為3%蛋白胨、1%酵母浸粉，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

在前期單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蛋白胨（A）、蔗糖（B）、玉米漿（C）添加量為影響因素，以乳球菌生物量以及Nisin效價(jià)為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for optimization of fermentation medium formula

表4 以生物量為評(píng)價(jià)指標(biāo)正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results using biomass as evaluation index

由表3可知，影響菌體生物量的3個(gè)因素主次順序?yàn)檎崽牵居衩诐{＞蛋白胨，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合為A2B3C3，即蛋白胨5%，蔗糖3%，玉米漿2%；影響Nisin效價(jià)的3個(gè)因素主次順序?yàn)檎崽牵镜鞍纂耍居衩诐{，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合為A2B3C3，即蛋白胨5%，蔗糖3%，玉米漿2%。這也驗(yàn)證了關(guān)于Nisin隨細(xì)胞生長(zhǎng)而生產(chǎn)并依賴于較高的菌體密度，即Nisin合成與細(xì)胞生長(zhǎng)耦聯(lián)[5-6]的論述。由表4可知，蔗糖對(duì)菌體生物量具有極顯著影響（P＜0.01），玉米漿對(duì)菌體生長(zhǎng)具有顯著影響（P＜0.05）。

綜上，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨5%，蔗糖3%，玉米漿2%。

2.3 搖瓶水平發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)乳酸乳球菌生長(zhǎng)代謝的影響

以正交優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基配方（蛋白胨5%，蔗糖3%，玉米漿2%）作為優(yōu)化組，發(fā)酵培養(yǎng)基配方（蛋白胨3%，蔗糖2%，玉米漿1%）作為對(duì)照組，考察搖瓶水平發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前后培養(yǎng)基對(duì)乳酸乳球菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見圖1。由圖1A可知，發(fā)酵時(shí)間6～11 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，優(yōu)化組峰值生物量（11 h）為4.9×109CFU/mL，較對(duì)照提高43%。由圖1B可知，Nisin隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而持續(xù)合成，在12 h達(dá)到峰值，優(yōu)化組Nisin效價(jià)峰值（1 660 IU/mL）較對(duì)照組提高20%。結(jié)果表明，優(yōu)化培養(yǎng)基在搖瓶水平能夠較為合理的滿足乳酸乳球菌生長(zhǎng)以及合成Nisin的需要。

圖1 搖瓶水平發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)（A）和Nisin合成（B）的影響Fig.1 Effects of fermentation medium on cell growth (A) and Nisin production (B) in flask cultures before and after optimization

2.4 10 L發(fā)酵罐水平分批發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)乳酸乳球菌生長(zhǎng)代謝的影響

以正交優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基配方（蛋白胨5%，蔗糖3%，玉米漿2%）作為優(yōu)化組，發(fā)酵培養(yǎng)基配方（蛋白胨3%，蔗糖2%，玉米漿1%）作為對(duì)照組，考察10 L發(fā)酵罐水平分批發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前后對(duì)乳酸乳球菌生長(zhǎng)代謝的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 10 L發(fā)酵罐水平發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前（A）、后（B）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和Nisin合成的影響Fig.2 Effects of fermentation medium on cell growth and Nisin production in a 10 L bioreactor before (A) and after (B)optimization

由圖2A可知，對(duì)照組生物量13 h達(dá)到峰值，為5.6×109CFU/mL，后自溶至3.5×109CFU/mL。而Nisin效價(jià)15 h達(dá)到峰值，為1 643 IU/mL，Nisin平均合成速率vˉq為109.5 IU/（mL·h）。蔗糖由19.6 g/L迅速消耗至（11 h）5.96 g/L后緩慢消耗至4.62g/L（20h），0～11h糖消耗速率為1.24g/（L·h），而11～20 h糖消耗速率0.15 g/（L·h）。同時(shí)，乳酸由1 g/L迅速合成至10.5 g/L（11 h）后緩慢合成至14 g/L（20 h），0～11 h乳酸合成速率為0.86 g/（L·h），11～20 h乳酸合成速率為0.38 g/（L·h）。顯然11 h前后糖利用、細(xì)胞生長(zhǎng)及乳酸生成發(fā)生重大變化。由于乳酸乳球菌乳酸發(fā)酵是其能量供應(yīng)的主要來源[10]，但乳酸的積累又對(duì)細(xì)胞代謝活性產(chǎn)生抑制[12]，因而11 h后可能存在酸脅迫和能量供應(yīng)不足的矛盾。

由圖2B可知，優(yōu)化組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)至17 h到達(dá)峰值，為7.75×109CFU/mL，較對(duì)照提高了38%，13 h細(xì)胞生物量（5.3×109CFU/mL）與對(duì)照持平，但優(yōu)化組對(duì)數(shù)期較對(duì)照延長(zhǎng)了4 h。顯然，加強(qiáng)碳源供給能夠有效促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。伴隨細(xì)胞生長(zhǎng)，Nisin合成至17 h達(dá)到峰值2 573 IU/mL，Nisin平均合成效率為151.4 IU/（mL·h），分別較對(duì)照提高56.6%和38.2%。說明氮源的增加以及其比例的改變有助于Nisin合成。另外，消后蔗糖由29.7 g/L迅速消耗至（11 h）15.6 g/L，17 h蔗糖質(zhì)量濃度為11.8 g/L。0～11 h糖消耗速率為1.28 g/（L·h），與對(duì)照持平；11～17 h糖消耗速率為0.63 g/（L·h），較對(duì)照提升320%。同時(shí)，乳酸由0 h的1.5 g/L迅速合成至11 h的11.5 g/L、17 h的16 g/L。0～11 h乳酸合成速率為0.9 g/（L·h），略高于對(duì)照。11～17 h乳酸合成速率為0.75 g/（L·h），較對(duì)照提升97%。結(jié)果表明，優(yōu)化培養(yǎng)基在11 h后能持續(xù)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，為Nisin高效合成提供了高細(xì)胞密度基礎(chǔ)[5，13]，而且在糖供應(yīng)增強(qiáng)的情況下，細(xì)胞的耐酸性也增強(qiáng)了。

對(duì)照組產(chǎn)物對(duì)菌體的得率系數(shù)（Yp/x）為29.2IU/108CFU，而優(yōu)化組Yp/x為33.2 IU/108CFU，提高了13.7%。結(jié)果表明，優(yōu)化后氮源濃度以及比例（蛋白胨以及玉米漿）不僅能給細(xì)胞的生長(zhǎng)提供豐富的氮源，還能為Nisin合成提供更豐富的肽分子前體，進(jìn)而促進(jìn)了單位細(xì)胞的Nisin合成效率。

2.5 分割發(fā)酵對(duì)Nisin合成的影響

分割發(fā)酵[20]方式能快速啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)從而促進(jìn)Nisin快速合成，因此考察分割發(fā)酵方式對(duì)乳球菌生長(zhǎng)及Nisin合成能力的影響，結(jié)果見表5和圖3。

表5 分割發(fā)酵平均細(xì)胞生長(zhǎng)速率及平均Nisin效價(jià)合成速率結(jié)果分析Table 5 Results analysis of average cell growth rate and average Nisin synthesis rate of segmentation fermentation

由表5和圖3可知，乳酸乳球菌分批發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)至17h（8.1×109CFU/mL），平均生長(zhǎng)速率為4.76×108CFU/（mL·h）。Nisin合成與生長(zhǎng)耦聯(lián)，18 h的Nisin效價(jià)為2 656 IU/mL，平均合成速率為147 IU（/mL·h）。

圖3 18 h、29 h、40 h和51 h分割發(fā)酵對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和Nisin合成的影響Fig.3 Effects of segmentation fermentation on cell growth and Nisin production in a 10 L bioreactor at 18 h,29 h,40 h and 51 h,respectively

18 h以30%的比例進(jìn)行分割培養(yǎng)，分割后（19 h）生物量為1.75×109CFU/mL，Nisin效價(jià)為0 IU/mL，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)7 h達(dá)到6.2×109CFU/mL，Nisin效價(jià)達(dá)到峰值（26 h，2 174 IU/mL），平均生長(zhǎng)速率為6.36×108CFU/（mL·h），較分批發(fā)酵提高40%；Nisin平均合成速率為311 IU/（mL·h），較分批發(fā)酵增長(zhǎng)112%。

29 h以25%的比例進(jìn)行分割培養(yǎng)，分割后（30 h）生物量為1.4×109CFU/mL，Nisin效價(jià)為0 IU/mL，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)7 h達(dá)到6.1×109CFU/mL，Nisin效價(jià)達(dá)到峰值（37 h，2 063 IU/mL），平均生長(zhǎng)速率為6.71×108CFU/（mL·h），較分批發(fā)酵提高41%；Nisin平均合成速率為294 IU/（mL·h），較分批發(fā)酵增長(zhǎng)100%。

40 h以20%的比例進(jìn)行分割培養(yǎng)，分割后（41 h）生物量為1.2×109CFU/mL，Nisin效價(jià)為0 IU/mL，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)7 h達(dá)到6.65×109CFU/mL，Nisin效價(jià)經(jīng)10 h生長(zhǎng)達(dá)到峰值（51 h，1 956 IU/mL），平均生長(zhǎng)速率為7.8×108CFU/（mL·h），較分批發(fā)酵提高64%；Nisin平均合成速率為196IU/（mL·h），較分批發(fā)酵增長(zhǎng)33%。

51 h以15%的比例進(jìn)行分割培養(yǎng)，分割后（52 h）生物量為6×108CFU/mL，Nisin效價(jià)為0 IU/mL，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)7 h達(dá)到6.5×109CFU/mL，Nisin效價(jià)經(jīng)10 h生長(zhǎng)達(dá)到峰值（62 h，1 850 IU/mL），平均生長(zhǎng)速率為8.4×108CFU/（mL·h），較分批發(fā)酵提高76%；Nisin平均合成速率為185IU/（mL·h），較分批發(fā)酵增長(zhǎng)26%。

15%、20%、25%和30%分割比例平均生長(zhǎng)速率較分批培養(yǎng)分別提高了76%、64%、41%和40%；而30%、25%、20%和15%分割比例的Nisin平均合成速率較分批培養(yǎng)分別提高了112%、100%、33%和26%。顯然分割比例越大，Nisin平均合成速率越高。考慮到分割發(fā)酵比例越高，用于Nisin產(chǎn)品生產(chǎn)的發(fā)酵液體積就越少，而且30%分割比例較25%分割比例僅僅提高5.8%，因此確定25%為最適分割比例。

3 結(jié)論

本研究通過正交試驗(yàn)確定乳酸乳球菌的最佳培養(yǎng)基配方為5%蛋白胨，3%蔗糖，2%玉米漿，1%酵母浸粉，0.2%磷酸氫二鉀，0.2%氯化鈉，0.02%七水硫酸鎂，0.005%一水硫酸錳，0.5%檸檬酸三銨，0.6%輕質(zhì)碳酸鈣，pH 6.8；培養(yǎng)溫度為30 ℃。搖瓶發(fā)酵11 h生物量為4.9×109CFU/mL，較對(duì)照提高43%，Nisin效價(jià)為1 660 IU/mL，較對(duì)照提高20%。10 L罐分批發(fā)酵中生物量在17 h達(dá)到7.75×109CFU/mL，較對(duì)照提高38%，Nisin效價(jià)為2 573 IU/mL，較對(duì)照提高56.6%。分批發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)18 h（Nisin平均合成速率vˉq為147 IU/（mL·h），以不同比例分割發(fā)酵并繼續(xù)培養(yǎng)7 h，第二次分割發(fā)酵（25%）的Nisin平均合成速率達(dá)到294 IU/（mL·h），較分批發(fā)酵提高了100%。該研究結(jié)果為Nisin工業(yè)發(fā)酵提供一定的理論以及數(shù)據(jù)支撐。