自然發(fā)酵剁辣椒中優(yōu)良酵母菌的篩選及鑒定

宋新燕，肖 茜，王蓉蓉，蔣立文，劉成國，周 輝*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省食品科學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室，湖南 長沙 410128）

剁辣椒是湖南省最常見的特色腌制食品，因其簡便易制、口感鮮辣以及豐富的營養(yǎng)價值深受大家青睞[1]。據(jù)統(tǒng)計，湖南有超100家辣椒加工企業(yè)年銷售額達40億元。剁辣椒加工工藝較為簡單，多以家庭制作和小規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)為主。在辣椒基本成熟后，將其清洗干凈，去蒂晾干，切碎后加入高鹽和酒或姜蒜等香辛料拌勻，放入陶瓷容器中密封腌制，待其自然發(fā)酵而成[2-3]。剁辣椒在發(fā)酵過程中，起主導(dǎo)作用的乳酸菌、酵母菌等各種有益微生物經(jīng)發(fā)酵和生理生化反應(yīng)產(chǎn)生的呈味物質(zhì)，賦予了剁辣椒酯香濃郁、滋味鮮美的獨特風(fēng)味[4-5]。

酵母菌是一種典型的兼性厭氧微生物，在有氧和無氧條件下都能存活[6]，尤其適應(yīng)于含糖量較高的偏酸性環(huán)境。目前對發(fā)酵蔬菜中微生物的探究主要集中于兩大優(yōu)勢菌種：乳酸菌和酵母菌。其中酵母菌作為功能菌種的應(yīng)用研究較少。有研究指出，蔬菜發(fā)酵中的酵母菌主要有異常漢遜酵母（Hansenula anomala）、亞膜漢遜酵母（Hansenulasubpolliculosa）、羅斯酵母（Ascomycetes）、易變球擬酵母（Torulopsis versatilis）等[7]。目前對發(fā)酵蔬菜中酵母菌的研究較多集中在泡菜類產(chǎn)品。張鵬[8]從四川泡菜中分離出13株酵母菌，通過篩選得到兩株發(fā)酵性能良好且符合四川泡菜發(fā)酵要求的酵母菌，經(jīng)鑒定為粗狀假絲酵母（Candida valida）、近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）。劉春燕[9]利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法對四川泡蘿卜發(fā)酵過程中的酵母菌進行分離鑒定，共得到清酒假絲酵母（Candida sake）、膠紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa）、畢赤酵母（Pichi agaleiformis）、酒酵母（Kazachstania exigua）四種酵母菌，且在自然發(fā)酵泡菜過程中，酵母菌的數(shù)量最終穩(wěn)定在104～105CFU/mL左右。

目前研究結(jié)果表明，發(fā)酵剁辣椒中主要的香氣物質(zhì)是酯類和醛類，且酯類物質(zhì)的相對含量在發(fā)酵后期表現(xiàn)出增長趨勢，說明可能是由有機酸與醇類生化反應(yīng)生成[10-11]。本課題組在前期對傳統(tǒng)剁辣椒發(fā)酵過程中菌群的研究時發(fā)現(xiàn)，酵母菌能以較高的數(shù)量（約105CFU/g）與乳酸菌一同生長，說明酵母菌在剁辣椒發(fā)酵過程中同樣起著重要的作用，其代謝產(chǎn)物對剁辣椒的風(fēng)味具有重要的影響。

本研究以自然發(fā)酵剁辣椒中分離出的酵母菌為研究對象，通過比較產(chǎn)醇、產(chǎn)酯、耐鹽、耐酸等發(fā)酵特性及耐受性指標(biāo)篩選出優(yōu)良酵母菌菌株。進而利用分子生物學(xué)方法并結(jié)合菌株形態(tài)特征、細(xì)胞結(jié)構(gòu)對分離篩選出的優(yōu)良酵母菌株進行種屬鑒定，以期能夠應(yīng)用于剁辣椒接種強化發(fā)酵，提高產(chǎn)品風(fēng)味及品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

剁辣椒樣品：本實驗室采用自然發(fā)酵自制，并保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 化學(xué)試劑

乙醇、重鉻酸鉀溶液、酚酞、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）、馬鈴薯浸粉、瓊脂（均為生化試劑）、葡萄糖、氯霉素（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖嘌呤硫酸鹽（yeast peptone dextrose adenine sulfate，YPDA）培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，蒸餾水定容至900 mL，調(diào)pH值至5.8，121 ℃滅菌20 min，冷卻至55 ℃時加入100 mL 20%葡萄糖溶液（過濾除菌），0.003%腺嘌呤硫酸鹽。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：將馬鈴薯去皮切塊300 g，加1 000 mL蒸餾水，煮沸10～20 min。用紗布過濾，補加蒸餾水至1 000 mL。加入葡萄糖和瓊脂各20 g/L，加熱溶化，分裝，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

WPX精密恒溫培養(yǎng)箱：上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FI-01620全波長酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技有限公司；LMQJ壓力蒸汽滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種純化與保存

將于-80 ℃冰箱凍藏的菌株解凍后，無菌操作下將其轉(zhuǎn)移至YPDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下連續(xù)傳代兩次。采用平板劃線法分離菌株，得到的單菌落接種于PDA斜面固體培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)，待其長出明顯菌落后，放置于4 ℃冰箱中低溫保藏。

1.3.2 酵母菌的初篩

（1）產(chǎn)香能力試驗：通過劃線法分離酵母菌，28 ℃培養(yǎng)3 d后進行感官評定試驗。采用嗅聞法，對酵母菌產(chǎn)香能力進行測定[12-13]。

（2）產(chǎn)醇試驗：參照李嶺卓等[14]的方法測定酵母菌的產(chǎn)醇能力。

表1 篩選酵母菌株感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory assessment standards of screened yeast strains

（3）產(chǎn)酯試驗：參照國標(biāo)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[15]測定酵母菌的產(chǎn)酯能力。發(fā)酵液中總酯含量（以乙酸乙酯計）的計算公式如下：

式中：X為總酯含量，g/L；C為氧氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/L；V為加入0.1 mol/L氧氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C1為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/L；V1為滴定時消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；5.0為取樣體積，mL；0.088為乙酸乙酯的摩爾質(zhì)量，g/mol。

（4）耐鹽酵母菌初篩：無菌操作下挑取冰箱斜面保存的酵母菌株活化24 h，之后按1%的接種量將活化后的菌懸液接種到100 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，其中含NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，參照國標(biāo)GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》測定其活菌數(shù)[16]。

1.3.3 酵母菌的復(fù)篩

（1）耐酸性試驗：用1 mol/L的乳酸溶液[17]分別配制pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的YPDA 液體培養(yǎng)基。將活化24 h后具有一定活力的酵母菌懸液，按1%的接種量轉(zhuǎn)移至上述溶液中，28 ℃培養(yǎng)24 h后，測定其OD600nm值。

（2）耐鹽度試驗[18]：將活化后的酵母菌液分別接種到8%、10%、12%、14%4個不同NaCl濃度的YPDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，接種量均為1%，以不含NaCl的培養(yǎng)基作為對照。參照國標(biāo)GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》對菌懸液進行活菌計數(shù)。

（3）菌株生長曲線的測定：將于4 ℃冰箱保存的斜面菌株活化，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h后接種至YPDA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為1%，之后每隔4 h取一次樣，于波長600 nm處測定各菌株細(xì)胞濃度的OD600nm值，繪制各菌株的生長曲線。

1.3.4 優(yōu)良酵母菌的鑒定

（1）酵母菌的形態(tài)學(xué)觀察：將篩選獲得的較優(yōu)良菌株純化后劃線于PDA平板上，28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)。挑取少量平板上的單菌落均勻涂布在載玻片上，采用結(jié)晶紫染色液染色后進行鏡檢。

（2）26S rDNA 序列的擴增測序及比對：離心收集純化好的菌體，提交給湖南光凌鋒生物科技有限公司進行基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取，然后經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增后測序，將得到的26S rDNA序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank基因庫中進行序列比對，并用MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行菌株同源性分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果采用Excel 2016和Origin 9.0軟件進行分析，顯著性分析采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的初篩結(jié)果

酵母菌在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生大量的醇類、酯類等風(fēng)味物質(zhì)，通過嗅聞法可以篩選出香氣濃郁的酵母菌株。從表2可以看出，所有酵母菌都能產(chǎn)生特殊的香氣，但香氣程度有所差異。其中能產(chǎn)生較明顯的酯香、醇香或其他香氣的酵母菌株為D-17和H-37，且酯香香氣濃郁。而菌株Y-3、H-23、H-33香氣強度稍弱，持續(xù)性一般。通過感官評定進行初步判斷后，再結(jié)合理化試驗測定菌株發(fā)酵產(chǎn)物的具體含量，進而篩選出較優(yōu)良酵母菌株。

表2 篩選菌株產(chǎn)香、產(chǎn)酯、產(chǎn)醇以及6% NaCl耐受性的測定Table 2 Determination of aroma,ester,alcohol production and 6% NaCl tolerance of screened strains

產(chǎn)酯酵母多用于酒類發(fā)酵，有增酯、提香的作用[19-20]。常見的產(chǎn)酯酵母有漢遜酵母、球擬酵母、假絲酵母屬、畢赤氏酵母屬等[21]，在適宜的條件下可生成乙酸酯類，特別是乙酸乙酯。由表2可知，在相同培養(yǎng)條件下，酵母菌株H-23、H-37的產(chǎn)酯效果表現(xiàn)較好，其產(chǎn)酯量分別為11.47 g/L、11.51 g/L，與其余菌株產(chǎn)酯量有顯著差異（P＜0.05）；其余菌株發(fā)酵液中總酯含量為5.99～9.04 g/L。

本試驗利用K2Cr2O7比色法測定發(fā)酵液中乙醇含量，取相同培養(yǎng)條件下的酵母菌株各發(fā)酵液10 mL稀釋2倍?？紤]到在發(fā)酵液中，除乙醇外還含有其他還原性物質(zhì)干擾該方法測定的準(zhǔn)確性，為了排除干擾，采用煮沸的方式除去發(fā)酵液中的乙醇，加水平衡后，將原發(fā)酵液和除去乙醇的發(fā)酵液都與重鉻酸鉀反應(yīng)，分別測定其吸光度值，兩者之差表示乙醇的實際含量，乙醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=7.511 9x-0.346 0（相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9）。

酵母菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生酒香味，主要是乙醇等醇類化合物，對發(fā)酵蔬菜的風(fēng)味有著重要的作用，且在發(fā)酵后期，乙醇與有機酸發(fā)生酯化反應(yīng)形成的酯類物質(zhì)，是發(fā)酵蔬菜香氣成分的來源之一[22]。由表2可知，在相同培養(yǎng)條件下，菌株Y-3的產(chǎn)醇能力顯著高于其他菌株（P＜0.05），乙醇產(chǎn)量為13.41 g/L，約是菌株28乙醇產(chǎn)量的3倍；其次是菌株Y-6，乙醇產(chǎn)量為10 g/L；而菌株D-13與D-17之間乙醇產(chǎn)量無顯著性差異（P＞0.05），產(chǎn)醇含量均接近9.5 g/L。

發(fā)酵蔬菜在腌制過程中，有害微生物的生長繁殖會降低腌菜的品質(zhì)與口感，為了保證良好的發(fā)酵環(huán)境，通常會加入一定濃度的食鹽，一般NaCl含量在5%～10%之間，對于高鹽腌制的蔬菜甚至?xí)遊23]。同時高濃度的含鹽量也會抑制有益微生物的生長，因此在接種發(fā)酵時，需要菌種具有一定的鹽耐受性。為了更好的適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，先對菌株進行低濃度耐鹽性測試。由表2可知，在6%NaCl濃度下培養(yǎng)24 h，菌株D-13的耐受性較好，菌體數(shù)量＞9×106CFU/mL，顯著高于其他菌株（P＜0.05）；菌株D-16、Y-3、H-28活菌數(shù)也都達到了8×106CFU/mL，菌株D-17、H-37活菌數(shù)分別為（7.35±0.07）×106CFU/mL、（7.1±0.08）×106CFU/mL。

篩選菌株發(fā)酵特性及耐受性熱圖分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株Y-3、D-17、H-23、H-37相關(guān)信息在產(chǎn)香方面相對比較豐富，菌株Y-3、H-23、H-33、H-37相關(guān)信息在產(chǎn)酯方面相對比較豐富，菌株Y-3、Y-6、D-13、D-17相關(guān)信息在產(chǎn)醇方面相對比較豐富，菌株H-28、D-16、D-13、Y-3相關(guān)信息在6%NaCl耐受性方面相對比較豐富。結(jié)果表明，酵母菌株的表現(xiàn)功能在不同菌株中的豐度有所不同。在感官評定中產(chǎn)香表現(xiàn)較優(yōu)良的菌株有Y-3、D-17、H-23、H-37，能產(chǎn)生較為明顯的酯香或醇香等香氣成分。在發(fā)酵特性試驗中，菌株Y-3、H-23、H-33、H-37表現(xiàn)出了較好的產(chǎn)酯能力，其產(chǎn)酯量都在10 g/L以上；乙醇含量的測定中，菌株Y-3產(chǎn)乙醇量超過了13 g/L，約為菌株Y-6的1.4倍。在6%NaCl耐受試驗中，菌株Y-3、D-13、D-16、H-28的活菌數(shù)含量較高，都超過了8×106CFU/mL。

圖1 篩選菌株發(fā)酵特性及耐受性熱圖分析Fig.1 Heatmap analysis of fermentation characteristics and tolerance of screened strains

綜上，在發(fā)酵特性和耐鹽方面綜合表現(xiàn)較優(yōu)良的菌株為Y-3、D-17、H-23、H-37。因此，對這4株菌進行進一步復(fù)篩試驗。

2.2 酵母菌復(fù)篩結(jié)果

2.2.1 耐乳酸性能

乳酸是發(fā)酵蔬菜中的主要有機酸，在發(fā)酵初期由于大量有機酸的生成其pH不斷下降，對發(fā)酵菌株的生長有較大的影響[24-25]，但是較低的pH值可以抑制雜菌的生長，因此菌種具有良好的耐酸性能對于發(fā)酵工藝來講有較大的意義。本實驗將菌株Y-3、D-17、H-23、H-37懸液接種于pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的YPDA液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24 h 后，測定其活菌數(shù)，結(jié)果見圖2。

圖2 不同pH值對篩選菌株的影響Fig.2 Effects of different pH value on screened strains

由圖2可知，篩選菌株在偏酸性環(huán)境中的生長較好，菌株Y-3在pH為4時，其生長能力增長較快，在pH繼續(xù)下降時，其活菌數(shù)沒有出現(xiàn)明顯下降趨勢；菌株D-17、H-23的最適pH為4，之后隨著pH下降，其生長能力減弱；而菌株H-37的最適pH為3.5，pH繼續(xù)下降時，其活菌數(shù)開始下降。結(jié)果表明，當(dāng)pH逐漸降低時，菌株Y-3的生長能力整體表現(xiàn)較好。

2.2.2 耐鹽性能

由圖3可知，當(dāng)NaCl含量為8%，4株菌的生長能力出現(xiàn)明顯下降，當(dāng)NaCl含量增大到12%時，菌株H-23、H-37的活菌數(shù)繼續(xù)呈下降趨勢，而菌株Y-3、D-17基本保持穩(wěn)定；當(dāng)NaCl含量增大到14%時，菌株D-17的活菌數(shù)開始出現(xiàn)下降趨勢，而菌株Y-3、H-23、H-37的活菌數(shù)開始出現(xiàn)回升的情況，可能是因為菌株產(chǎn)生了一定的耐受性。結(jié)果表明，在8%～14%的NaCl含量下，菌株Y-3的生長能力保持了相對比較穩(wěn)定的趨勢，而且活菌數(shù)相對表現(xiàn)較好。

圖3 不同NaCl含量對篩選菌株的影響Fig.3 Effects of different NaCl concentrations on screened strains

2.2.3 生長曲線的測定

4株酵母菌株的生長曲線見圖4。由圖4可知，4株菌在YPDA液體培養(yǎng)基中的生長情況沒有經(jīng)歷延滯期，接種后直接進入了對數(shù)生長期，說明以上菌株的生長力都比較旺盛。其中菌株H-37在12 h即進入了穩(wěn)定期，另外三株菌生長趨勢相似，都在24 h左右進入發(fā)酵穩(wěn)定期；在0～12 h，菌株Y-3的發(fā)酵速率最快。

圖4 篩選菌株的生長曲線Fig.4 Growth curves of screened strains

通過初篩和復(fù)篩試驗結(jié)果并經(jīng)分析后得出：菌株Y-3生長能力較強，且在耐鹽耐乳酸方面表現(xiàn)優(yōu)良，更能適應(yīng)蔬菜的發(fā)酵環(huán)境，而且菌株本身在產(chǎn)醇、產(chǎn)香等發(fā)酵性能上綜合表現(xiàn)突出，因此，對菌株Y-3進行形態(tài)學(xué)觀察及26S rDNA分子生物學(xué)鑒定。

2.3 菌株Y-3的鑒定

2.3.1 菌株Y-3的形態(tài)學(xué)觀察

菌株Y-3的菌落及細(xì)胞形態(tài)結(jié)果見圖5。由圖5a可知，菌落呈圓形，乳白色，中間凸起，菌落質(zhì)地均勻，表面光滑、濕潤、粘稠，易挑起，且邊緣規(guī)整，有明顯的醇香氣味。由圖5b可知，在光學(xué)顯微鏡下，菌體細(xì)胞為橢圓形，生殖方式為芽殖，無菌絲。

圖5 菌株Y-3的菌落（a）和細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.5 Colony (a) and cell (b) morphology of strain Y-3

2.3.2 菌株Y-3的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將菌株Y-3的26S rDNA序列在NCBI-GenBank數(shù)據(jù)庫中與已知酵母菌的對應(yīng)序列進行分析對比，找出與其相似性最高的已知菌種，結(jié)果見圖6。由圖6可知，菌株Y-3與Hanseniaspora pseudoguilliermondii[26]的同源性達到98%以上，菌株Y-3被鑒定為Hanseniaspora pseudoguilliermondii。

圖6 基于26S rDNA序列分析菌株Y-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain Y-3 based on 26S rDNA sequence analysis

3 結(jié)論

通過不斷對發(fā)酵食品中微生物的研究探索，人們逐漸認(rèn)識到酵母菌在食品中的重要作用。本試驗經(jīng)過對前期實驗室從自然發(fā)酵剁辣椒中分離的10株酵母菌進行感官及理化測定的篩選，評價比較了酵母菌在產(chǎn)香、產(chǎn)酯、產(chǎn)醇以及耐鹽耐酸等特性，最終獲得一株具有良好生長能力及發(fā)酵性能的酵母菌株Y-3，經(jīng)鑒定為Hanseniaspora pseudoguilliermondii，該種酵母屬于典型的生香酵母。有研究表示生香酵母是酒類發(fā)酵產(chǎn)香的主要菌種，近年來也逐漸應(yīng)用于泡菜、醬油等發(fā)酵食品以此提高產(chǎn)品的香氣風(fēng)味。因此認(rèn)為該菌株作為發(fā)酵菌劑可能會帶來良好的發(fā)酵效果，對于發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品的開發(fā)具有進一步研究意義。