嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產(chǎn)多肽發(fā)酵條件優(yōu)化及其呈味、抗氧化特性

馬媛媛，安飛宇，曹愷欣，趙 越，武俊瑞，史海粟，烏日娜*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

多肽是各氨基酸殘基以不同組合和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱，其中的特異性功能肽，如呈味功能肽及生理活性肽通常由2～50個(gè)氨基酸組成[1]。目前，“BIOPEP”數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)道了521個(gè)呈味功能肽及4 402個(gè)生理活性肽，其中包括呈味、抗菌、抗氧化、抗癌、抗衰老、抗炎和降血壓等多種生物活性[2]，其在食品、日用化工、醫(yī)藥制劑等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，因此受到研究人員的廣泛關(guān)注，其合成與制備方法更是研究的熱點(diǎn)。

目前，多肽多以酶解法制備[3]，但存在成本高、酶解條件嚴(yán)格、預(yù)處理時(shí)氨基酸易被破壞[4]問(wèn)題等，而發(fā)酵是一種更為經(jīng)濟(jì)有效的方法，可通過(guò)微生物的作用產(chǎn)生生物活性肽和食品級(jí)蛋白質(zhì)水解物，是在工業(yè)水平上生產(chǎn)特異性功能肽的理想方法，與酶法制備相比，其產(chǎn)物生物活性強(qiáng)、安全性高且更環(huán)保[3，5]?，F(xiàn)如今，已開(kāi)展多項(xiàng)利用微生物法制備特異性功能肽的相關(guān)研究，如LI C等[6-8]利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵制備抗氧化肽；CHEN L等[9]利用瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）發(fā)酵制備降血壓肽；MUHIALDIN B J等[10-11]利用大腸桿菌（Escherichia coli）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）制備抑菌肽。此外，本課題組前期研究表明，嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）是豆制品發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)菌種，其在發(fā)酵過(guò)程中可分泌大量酶類，將原料蛋白中的大分子蛋白分解成小分子肽及游離氨基酸，其與鮮味肽等特異性功能肽的合成代謝密切相關(guān)[12-13]。

因此，本研究以實(shí)驗(yàn)室前期從自然發(fā)酵豆醬中篩選出的產(chǎn)多肽能力較強(qiáng)的嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1為研究對(duì)象，以大豆蛋白為發(fā)酵基質(zhì)，通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)多肽培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)所制備多肽的呈味特性及抗氧化特性進(jìn)行初步研究，以期為其進(jìn)一步的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）SNTH-1（CGMCC.No 23165）：分離自遼寧省自然發(fā)酵豆醬。

1.1.2 試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）溶液：北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸、氯化鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：美國(guó)Sigma公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、乙酸鈉（無(wú)水）3 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、七水合硫酸鎂0.575 g/L、一水合硫酸錳0.25 g/L、葡萄糖20 g/L、檸檬酸三鈉2.42 g/L、酵母浸粉4 g/L、牛肉浸膏8 g/L、吐溫80 1 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

參考ZHAO J D等[14]的方法并稍作修改，大豆蛋白液體發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10 g/L、乙酸鈉（無(wú)水）3 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、七水合硫酸鎂0.575 g/L、一水合硫酸錳0.25 g/L、葡萄糖20 g/L、檸檬酸三鈉2.42 g/L、吐溫80 1 g/L、氯化鈉100 g/L，調(diào)整pH值至7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Eon型酶標(biāo)儀：美國(guó)Biotek公司；UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：龍尼柯（上海）儀器有限公司；Insent SA402B型電子舌：日本Insent公司；LX-B50L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；PHS-3E型pH計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵產(chǎn)多肽培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

微生物發(fā)酵法制備多肽的影響因素主要包括微生物種類、培養(yǎng)基種類與組成、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、pH值、溫度等[15]。將甘油管保藏的嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1按2%（V/V）的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，33 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，再將其按2%（V/V）的接種量接種于鹽度為10%、pH為7.0的大豆蛋白液體發(fā)酵培養(yǎng)基，33 ℃條件下培養(yǎng)，考察發(fā)酵時(shí)間（24 h、32 h、40 h、48 h、56 h）對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產(chǎn)多肽能力的影響。在此基礎(chǔ)上，依次考察發(fā)酵溫度（25 ℃、29 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、鹽度（3%、5%、7%、9%、11%）、初始pH值（6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產(chǎn)多肽能力的影響，確定最佳培養(yǎng)條件。

1.3.2 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵產(chǎn)多肽培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

（1）PB試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以多肽含量為響應(yīng)值，選取發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）、鹽度（D）、初始pH值（E）5個(gè)因素的高低水平，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行PB試驗(yàn)，PB試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（2）最陡爬坡試驗(yàn)

依據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，篩選出影響最大的3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定中心點(diǎn)。

（3）Box-Behnken試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以多肽含量（Y）為響應(yīng)值，初始pH值（X1）、鹽度（X2）及發(fā)酵溫度（X3）為考察因素，采用Design-Expert 8.0.6軟件，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定產(chǎn)多肽的最佳培養(yǎng)條件，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 多肽含量的測(cè)定

參考RUAN S等[16]的方法，并稍作修改。將質(zhì)量濃度分別為0、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL、12 mg/mL、16 mg/mL和20 mg/mL的四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL添加到4 mL雙縮脲試劑中，混勻，在室溫（（25±1）℃）下放置30 min，然后在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值，以四肽的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.014 1x+0.06（R2=0.998）。同理，測(cè)定1 mL發(fā)酵上清液中的多肽含量。

1.3.4 粗多肽的提取

參考ZHANG Y等[17]的方法并稍作修改。發(fā)酵結(jié)束后將樣品取出，于85 ℃水浴鍋中滅酶15 min，再8 000 r/min離心15 min，取發(fā)酵液上清過(guò)0.45 μm微孔膜除去不溶物和菌體后，收集上清液并凍干作為粗多肽。

1.3.5 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽滋味特性的測(cè)定

分別以響應(yīng)面試驗(yàn)所確定的最優(yōu)培養(yǎng)條件、優(yōu)化前的培養(yǎng)條件、空白培養(yǎng)基作為試驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組，以電子舌測(cè)試由氯化鉀和酒石酸配制的人工唾液無(wú)味點(diǎn)（Tasteless）組為基準(zhǔn)[18]，當(dāng)樣品的味覺(jué)值低于無(wú)味點(diǎn)時(shí)說(shuō)明樣品無(wú)該味道，反之則有。采用電子舌技術(shù)對(duì)發(fā)酵液的滋味特性（酸味、苦味、澀味、苦味回味、澀味回味、鮮味、厚味、咸味、甜味）進(jìn)行評(píng)估和比較[19]。

1.3.6 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽DPPH自由基清除率的測(cè)定

分別以響應(yīng)面試驗(yàn)所確定的最優(yōu)培養(yǎng)條件、優(yōu)化前的培養(yǎng)條件作為試驗(yàn)組、對(duì)照組，測(cè)定其抗氧化能力。參考XIE Z J等[20-21]的方法，并稍作修改。配制40 mg/mL的樣品溶液，取2 mL粗多肽液于測(cè)試管中，加入2 mL 1×10-4mol/L DPPH溶液，混合均勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1，以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇調(diào)零，相同條件下測(cè)定2 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇與等體積樣品均勻混合后的吸光度值A(chǔ)2，以及DPPH溶液與體積分?jǐn)?shù)95%乙醇等體積混合后的吸光度值A(chǔ)3，計(jì)算DPPH自由基清除率，其計(jì)算公式如下：

半抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）表示DPPH自由基清除率為50%時(shí)抗氧化肽的質(zhì)量濃度。通過(guò)調(diào)整SNTH-1粗多肽的質(zhì)量濃度，選取DPPH自由基清除率在25%～85%范圍的SNTH-1粗多肽質(zhì)量濃度，再進(jìn)行線性擬合，即可求得IC50值。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，單因素試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS20.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析，采用OriginPro2018進(jìn)行作圖、DPPH自由基清除率的線性擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵產(chǎn)多肽培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、鹽度、初始pH值對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產(chǎn)多肽能力的影響見(jiàn)圖1。

圖1 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single factor experiment for culture conditions optimization

由圖1A可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽含量呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，發(fā)酵前40 h多肽含量顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)發(fā)酵40 h時(shí)，多肽含量最高，為（12.78±0.16）mg/mL；發(fā)酵40 h后多肽含量變化差異不顯著（P＞0.05）。分析原因可能是發(fā)酵前期嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株活性較強(qiáng)，具有較強(qiáng)的產(chǎn)肽能力；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞40 h后，菌株達(dá)到平臺(tái)期，多肽含量趨于穩(wěn)定，這與朱雯娟[22]的研究結(jié)果一致。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為40 h。

由圖1B可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，多肽含量呈先升高后緩慢降低的趨勢(shì)，且各組間差異顯著（P＜0.05），當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)多肽含量最高，為（15.15±0.23）mg/mL。分析原因可能是發(fā)酵溫度較低時(shí)，嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1的活性差，且蛋白酶酶解速率低，僅有部分大豆蛋白被完全利用，從而影響其產(chǎn)多肽能力[23]；雖然較高的發(fā)酵溫度能提高蛋白酶酶解速率，但會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)活力，不利于發(fā)酵產(chǎn)多肽[24]。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

由圖1C可知，隨著接種量的增加，多肽含量呈先升高后趨于平緩的趨勢(shì)，當(dāng)接種量＜1%時(shí)，多肽含量存在顯著差異（P＜0.05）；當(dāng)接種量＞1%時(shí)，多肽含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)接種量為3%時(shí)達(dá)到最高，為（16.43±0.15）mg/mL。分析其原因可能是當(dāng)接種量較少時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，菌體密度低，發(fā)酵培養(yǎng)基中的大豆蛋白未被完全利用，致使多肽含量較低；而較多的接種量，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵初期菌體生長(zhǎng)速度過(guò)快，細(xì)胞過(guò)早老化，發(fā)酵培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的匱乏，致使產(chǎn)多肽能力下降[22]。因此，確定最佳接種量為3%。

由圖1D可知，隨著鹽度的增加，多肽含量呈先快速升高后緩慢降低的趨勢(shì)，各組間存在顯著差異（P＜0.05），當(dāng)鹽度為5%時(shí)達(dá)到最高，為（21.45±0.30）mg/mL。分析其原因可能是嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1作為中度嗜鹽菌，適宜的鹽度能提高菌株的生長(zhǎng)活性，有利于蛋白酶等代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而提高產(chǎn)多肽能力[25-26]。因此，確定最佳鹽度為5%。

由圖1E可知，隨著初始pH值的升高，多肽含量總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，各組間均存在顯著差異（P＜0.05）；當(dāng)初始pH值為8.0時(shí)，多肽含量達(dá)到最高，為（28.67±0.34）mg/mL。分析其原因可能是pH會(huì)影響菌體的細(xì)胞膜滲透度和營(yíng)養(yǎng)離子化程度，從而影響嗜鹽四聯(lián)球菌的生長(zhǎng)代謝[27-28]。而嗜鹽四聯(lián)球菌生長(zhǎng)時(shí)利用葡萄糖產(chǎn)酸，弱堿的環(huán)境可與酸綜合，縮短延滯期，這與王博[29]的研究結(jié)果一致。因此，確定最佳初始pH值為8.0。

2.2 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵產(chǎn)多肽培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 PB試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多肽含量為響應(yīng)值，進(jìn)行PB試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

由表3及表4可知，各因素對(duì)多肽含量影響的順序?yàn)槌跏紁H值＞鹽度＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量；初始pH值對(duì)多肽含量的影響高度顯著（P＜0.01），鹽度、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽含量的影響顯著（P＜0.05），而接種量對(duì)多肽含量的影響不顯著（P＞0.05）。同時(shí)，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)多肽含量達(dá)到峰值后，即使隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量仍保持穩(wěn)定。因此，選定對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵產(chǎn)多肽影響最大的3個(gè)因素（發(fā)酵溫度、鹽度、初始pH值）進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

由PB試驗(yàn)結(jié)果可知，初始pH值（X1）、鹽度（X2）、發(fā)酵溫度（X3）均呈顯著正效應(yīng)（P＜0.05），應(yīng)逐步增加。利用最陡爬坡試驗(yàn)，初步確認(rèn)最大多肽含量區(qū)域，有效建立響應(yīng)面擬合方程。最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of steepest ascent experiments

由表5可知，當(dāng)初始pH值為8.0、鹽度為5%、發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，多肽含量達(dá)到最高，為29.81 mg/mL。因此，確定初始pH值8.0、發(fā)酵溫度37 ℃、鹽度5%為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design-Expert 8.0.6軟件，在PB試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，多肽含量（Y）為響應(yīng)值，確定初始pH值8.0、發(fā)酵溫度37 ℃、鹽度5%為中心點(diǎn)，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，共計(jì)17組，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表6中的多肽含量進(jìn)行多元線性回歸擬合，最終得到回歸方程：

由表7可知，模型的P＜0.001，表明該二次回歸方程模型極顯著（P＜0.001）。同時(shí)失擬項(xiàng)P=0.703 8＞0.05，不顯著，說(shuō)明響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合度較高，能較好解釋響應(yīng)中的變異。決定系數(shù)R2為0.992 2，說(shuō)明此方程對(duì)試驗(yàn)擬合度結(jié)果比較好，誤差??；校正決定系數(shù)R2Adj為0.982 1，表明能解釋試驗(yàn)中98.21%響應(yīng)值的變化并且試驗(yàn)誤差較小，說(shuō)明此回歸模型能對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵制備多肽的效果進(jìn)行較好地分析與預(yù)測(cè)。另一方面，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=0.91%＜10%，說(shuō)明本試驗(yàn)的置信度良好[30-31]，也從另一方面表明此模型的可靠性。由表7亦可知，影響多肽含量的主次順序依次為X1＞X2＞X3，即初始pH值＞鹽度＞發(fā)酵溫度。一次項(xiàng)X1及二次項(xiàng)X12、X22、X32對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.001），一次項(xiàng)X2及交互項(xiàng)X1X2、X2X3對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

根據(jù)曲面的陡峭程度能判斷各因素間交互作用對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產(chǎn)多肽能力影響的顯著性，曲面越陡峭，影響越顯著，反之不顯著，也可根據(jù)等高線的形狀判斷顯著性[32]。各因素及其交互作用對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產(chǎn)多肽能力影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖2。

由圖2可知，初始pH值與鹽度、鹽度與發(fā)酵溫度間的交互作用的響應(yīng)面呈凸面，說(shuō)明存在最大值，坡度較陡峭，等高線呈閉合的橢圓形，說(shuō)明各因素間交互作用明顯，而初始pH值與發(fā)酵溫度間交互作用的響應(yīng)面坡度較平坦，且等高線近似圓形，表明初始pH值和發(fā)酵溫度間的交互作用對(duì)多肽含量的影響沒(méi)有顯著性，該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖2 各因素間交互作用對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產(chǎn)多肽含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of interaction between various factors on the contents of peptide produced by Tetragenococcus halophilus SNTH-1

2.2.4 最佳發(fā)酵條件的確定

利用響應(yīng)面優(yōu)化確定最佳條件為發(fā)酵時(shí)間40 h、鹽度5.23%、發(fā)酵溫度37.06 ℃、接種量3%、初始pH值8.08。在此條件下，多肽含量預(yù)測(cè)值為33.15 mg/mL。為便于實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵條件修正為發(fā)酵時(shí)間40 h、鹽度5.2%、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量3%、初始pH值8.1。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，多肽含量實(shí)際值為（32.96±0.02）mg/mL，與模型預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該回歸模型優(yōu)化出的工藝參數(shù)較為準(zhǔn)確，具有較高可行性，可實(shí)際應(yīng)用。

2.3 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵液呈味肽分析

基于樣品基質(zhì)呈味的復(fù)雜性，應(yīng)用電子舌技術(shù)，測(cè)定嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的酸味、苦味、澀味、苦味回味、澀味回味、鮮味、厚味、咸味、甜味，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產(chǎn)粗多肽呈味特性電子舌測(cè)定結(jié)果Fig.3 Taste characteristics of crude peptides produced by Tetraplococcus halophilus SNTH-1 determined by electronic tongue

由圖3可知，試驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組的咸味、鮮味的味覺(jué)值較高，甜味居中，苦味較低，均高于無(wú)味點(diǎn)組，可作為評(píng)價(jià)風(fēng)味的有效指標(biāo)；而酸味、澀味、苦味回味、澀味回味的味覺(jué)值低于無(wú)味點(diǎn)組，不呈味。試驗(yàn)組的鮮味、厚味、咸味、甜味、苦味的味覺(jué)值均高于對(duì)照組、空白組，說(shuō)明優(yōu)化后的發(fā)酵條件增強(qiáng)了嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1所產(chǎn)粗多肽的鮮味、厚味、咸味、甜味和苦味的表達(dá)。而苦味的增加可能是因?yàn)槭塞}四聯(lián)球菌SNTH-1生長(zhǎng)所產(chǎn)生的蛋白酶、肽酶等代謝產(chǎn)物，將大分子蛋白降解生成小分子肽和游離氨基酸，釋放了易于苦味受體結(jié)合的苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸等[33]，從而產(chǎn)生苦味。

2.4 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的抗氧化能力分析

基于樣品基質(zhì)復(fù)雜的生物活性，測(cè)定嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的DPPH自由基清除率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，DPPH自由基清除率與嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，隨著多肽質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率也在逐漸增大，且試驗(yàn)組多肽的DPPH自由基清除率高于對(duì)照組，說(shuō)明優(yōu)化后的發(fā)酵條件提高了嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的抗氧化性。試驗(yàn)組嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽清除DPPH自由基的IC50值為0.22 mg/mL。HE R等[34]利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）固態(tài)發(fā)酵制備的菜籽肽清除DPPH自由基的IC50值為0.165 mg/mL；龍久鈴等[35]利用米曲霉（Aspergillus oryzae）固態(tài)發(fā)酵制備的蘇麻餅粕肽清除DPPH自由基的IC50值為0.17 mg/mL，略低于嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的IC50值。綜上所述，嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1所產(chǎn)多肽中可能存在具有抗氧化能力的生理活性肽，具有一定的應(yīng)用潛力。

圖4 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產(chǎn)粗多肽發(fā)酵條件優(yōu)化前后的DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH free radical scavenging rate of crude peptide produced by Tetraplococcus halophilus SNTH-1 before and after fermentation condition optimization

3 結(jié)論

本研究以高產(chǎn)多肽的嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1為研究對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)、PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化確定其產(chǎn)多肽的最優(yōu)工藝為發(fā)酵時(shí)間40 h、鹽度5.2%、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量3%、初始pH值8.1，該條件下多肽含量為（32.96±0.02）mg/mL，嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1所產(chǎn)粗多肽的鮮味、厚味、咸味、甜味、苦味及DPPH自由基清除率比優(yōu)化前均有所提高，且清除DPPH自由基的IC50值為0.22 mg/mL。